Este estudio fue apoyado por Max McGee Centro Nacional de Investigación para Menores Diabetesat Colegio Médico de Wisconsin y el Instituto de Investigación de Niños de Wisconsin. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, o la preparación del manuscrito.

1. Antes de la creación de un ensayo de supresión, es necesario cuentas de abrigo tosylactivated con anti-CD3 humano (clon UCHT1, 1μg/ml concentración final) para la estimulación de células y después comprobar si las cuentas están recubiertas de manera eficiente mediante la creación de un ensayo in vitro de la proliferación de uso humano las células T <ol><li> Tomar 1 ml de M-450 cuentas de tosylactivated vial original, lugar en soporte magnético y espera hasta que todas las cuentas se han adherido a la pared del tubo. Retire el tubo de amortiguación, mientras que todavía está en el soporte magnético. Tome el tubo del soporte magnético y añadir 1 ml de buffer1, colocar el tubo en soporte magnético y retire el tubo de buffer1 mientras está en el soporte magnético, cuentas resuspender en 1 ml de buffer1 y añadir 40μl de anti-CD3 humano, agitando a 37 º C durante 15 minutos, añadir 0,1% w / v BSA y continuar agitando durante 16 horas siguientes. </li><li> Lavado de los granos en buffer2 dos veces durante 5 minutos a 2-8 ° C y una vez en buffer3 durante 5 minutos a 2-8 ° C con soporte magnético como se explicó anteriormente, quitar el tampón y volver a suspender las bolas en 1 ml de buffer2, las cuentas son 4x10 8 / ml concentración final y listo para usar. </li><li> Alícuota de 50.000 y 25.000 PBMC / y por triplicado en una placa de 96 pocillos y añadir un número variable de CD3 revestida de piedras (4x10 8 cuentas / ml, CD3 1μg/ml, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 gotas / celular ) con el fin de determinar el número óptimo de cuentas por celda. Después de 72 horas en cultivo, añadir 1μCi [3H]-timidina y continuar la incubación a 37 ° C durante las 16 horas siguientes. Las células de la cosecha en la placa de la cosecha multipantalla (Millipore), añadir líquido de centelleo y leer cuentas por minuto (cpm) / y con mejores NXT Count (Packard, CT). Use las gotas / proporción de células en CPM están por encima de 5000, pero 15.000 menos que para evitar la sobre-estimulación de células T reguladoras, que podrían perder la función supresora. Por lo general, la proporción de 3 bolas / celular estimula la respuesta y las células T reguladoras en todos los grupos sometidos a prueba hasta el momento 1-4. </li></ol> 2. PBMC aislamiento de toda la sangre de donantes sanos o de leukopacks humanos o de la capa leucocitaria (BC) por lo general tomado de voluntarios sanos y disponibles de forma gratuita desde los Centros de Transfusión de Sangre (Figura 1) <ol><li> Diluir la AC (~ 50 ml) 1:06 con PBS (añadir 250 ml). Ahora no es el volumen total de 300ml. Poco a poco la capa de 25ml de BC diluida en la parte superior de 15 ml de Ficoll-Paque PLUS añadido a 50 ml tubos Falcon, sin alterar las capas. Centrifugar a 800xg (1400 rpm en una centrífuga Sorvall con rotor basculante SH-3000) durante 30 minutos a 4 ° C, con frenos de apagado. </li><li> Recoger cuidadosamente la capa de PBMC (fase intermedia) y la transferencia a un nuevo máximo de 50 ml tubos Falcon. Lávese las PBMC mediante la cumplimentación de los tubos hasta 50 ml con DPBS. Recoger 2 gránulos de las células en un tubo. Centrifugar a 400xg durante 10 min a 4 ° C. Repita la etapa de lavado dos veces, cada vez que la combinación de 2 gránulos de las células en un solo tubo. Combine todos los gránulos de las células en un solo tubo de 50 ml. </li><li> Contar con PBMC usando Trypan exclusión de prueba azul. Hacer una dilución 1:10 en azul tripán añadiendo 20μl de PBMC a 180μl de azul de tripano mancha. Mezclar bien y tomar 20μl a contar en hemocitómetro de inmediato. Contar el número de todas las células teñidas de azul y sin mancha y está ubicado en dos manzanas cada uno con 16 plazas más pequeñas. Tomar la media de ambas y se multiplica por 10. Divida este número por 100 para obtener el número de PBMC / ml. Porcentaje de células viables calcular como [1 - (número de células de color azul / número de células totales) x 100]. Proceder en caso de viabilidad es ≥ 95%. </li></ol> 3. MACS pre-tipo de células T CD4 <ol><li> Antes de continuar, la transferencia de 1 ml de PBMC en un nuevo tubo, añadir 4 ml de los medios de comunicación para preparar a las células de la irradiación con 5000rad-estos serán células presentadoras de antígeno (APC). </li><li> Centrifugar el resto de las células en 250xg en PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA durante 10 min a 4 ° C. Retirar las células sobrenadante y resuspender en 4 ml de buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA. </li><li> Agregar 200μl de MACS microbolas anti-CD4 e incubar a 4 ° C durante 20 minutos. </li><li> Lave mediante la adición de 40 ml de buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA y centrifugar a 250xg durante 10 minutos a 4 ° C. Elimínese el líquido sobrenadante y resuspender en 8 ml de desgasificado, la temperatura ambiente PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA. </li><li> Filtro por separado la suspensión de células con separación de Pre-filtros antes de su carga en una columna de LS. </li><li> Dividir la suspensión celular y la capa de 4 ml cada columna LS más de calibrado (con 3 ml de deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA). LS columna se fija en el separador MidiMACS. Antes de la suspensión celular se agota, o bien volver a ejecutar el caudal contínuo o añadir 3 ml de la temperatura ambiente deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA y dejar que el buffer que se recorra. Agregar más buffer hasta que salga clara. </li><li> Pipeta de 5 ml de búfer deggassed en la columna LS, LS eliminar la columna del separador MidiMACS y el lugar en un nuevo tubo estéril de recogida 15ml dejar correr ~ 1.0 ml a través. Poner el pistón en la columna y empuje lentamente el resto de lavolumen fuera. </li><li> Haga lo mismo con las dos columnas LS y combinar las dos fracciones de células CD4 +. Agregue hasta 50 ml de PBS las células y el recuento. Rendimiento esperado es de hasta 5x10 8 células. Centrifugar a 400xg durante 10 minutos y suspender las células en 2 ml y PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA. </li></ol> 4. Fluorescentes clasificación de células activadas (FACS) de aislamiento (Figura 2) <ol><li> Hacer un cóctel de anticuerpos a los marcadores de CD a los siguientes marcadores de superficie celular (mantener protegido de la luz): 20 l de anti-humano CD8-FITC (clon del EPR-T8), 20 l de anti-CD14 humano-FITC (clon M5E2; receptor de LPS), 20 l de anti-CD32 humano-FITC (clon FLI8.26; FcγR de tipo II) y 6 l de anti-CD116 humana-FITC (clon M5D12, GM-CSFRα cadena) y, en su defecto, añadir 40μl contra -CD4 humano APCCy7 (clon RPA-T4). </li><li> Tome 5μl de la suspensión celular y se tiñen con 2 ml de cóctel 2μl mancha, lo que es un tubo para determinar el umbral (Fluorocromo Minus One FMO) 5. </li><li> Añadir 50 l de anti-CD25 humano-PE (clon M-A251, IL-2Rα) para el cóctel de la mancha, y añadir el cóctel de suspensión de células y se incuba a 4 ° C 30 minutos. Lavar las células en tampón PBS, centrifugar a 400xg durante 10 minutos y suspender las células a una concentración de 10 7 células / ml. </li><li> Prepare las células y las células no teñidas o cuentas teñidas con un solo fluorocromo para su uso como control de compensación de clasificación de células en FACS Aria (BD Biosciences, San José, NJ). </li><li> Adquirir las células en el tubo de FMO, que permitirá al usuario establecer el umbral para la clasificación de células CD25 + T (Figura 2a). Establecer una puerta alrededor de FITC células negativas para excluir FITC de células positivas que comprende los monocitos, los macrófagos y los linfocitos CD4 + otros-no de las células T (Figura 2b). </li><li> En un gráfico diferente, dibuja puertas para CD25, CD25low y CD25high células T Tregs (1% de las células que expresan el mayor número de CD25) (Figura 2c). Subconjuntos de células suelen mostrar alta pureza (Figura 2d, 2e y 2f). </li><li> Centrifugar los tubos de recogida de las células en 400xg durante 10 minutos y mantenerse en hielo hasta placas. </li></ol> 5. Establecer el cultivo de células en placa de 96 pocillos (esquema adjunto como Tabla 1) en 200μl/well <ol><li> 50μl alícuota de CD3 revestida de piedras (1 mg / ml), calculado a 3 perlas / células de respuesta en un pozo, se resuspendieron en medio completo con agregados de 10% de suero humano AB en el fondo en U 96 y placas. (Por ejemplo, para hacer que los medios de comunicación de 2 ml con CD3 recubierto, tomar 7.5μl de stock de CD3 revestida de piedras de final de la concentración de 4x10 8 / ml y se diluye en 2 ml de los medios de comunicación, cada 50μl contendrá 75.000 beads-3beads/cell). </li><li> Diluir APC irradiado a la concentración celular de 5x10 5 / ml y añadir 50μl (contendrá 2,5 x 10 4 células) en cada pocillo con el estímulo añadido previamente, incluidos los pozos etiquetados como &quot;células T reguladoras sólo&quot;, &quot;APC sólo&quot; y &quot;medios de comunicación sólo&quot; en la tabla 1. </li><li> Añadir 2,5 x 10 4 / así CD4CD25-o las células T CD4CD25low por triplicado siguiendo el diseño en la Tabla 1. </li><li> Añadir Tregs de co-cultivos (fila B, Tabla 1) en la proporción de 1:10 (2500 células Treg) y los pozos de la etiqueta &quot;sólo Tregs&quot; e incubar la placa a 37 ° C en la incubadora de CO 2 con un 5% de CO 2 , en la humedad saturada durante 72 horas. </li><li> Pulso de los pozos con 1μCi [3H]-timidina y continuar la incubación a 37 ° C durante 16 horas siguientes. </li></ol> 6. La recolección y conteo <ol><li> Las células de la cosecha en la placa de la cosecha multipantalla con Packard Filtermate cosechadora o un sistema alternativo. </li><li> Añadir líquido de centelleo (Microscint 20), cubrir la cosecha plato con cubierta de plástico transparente en la preparación para el paso final. </li><li> Lea cuentas por minuto (cpm) / y con mejores NXT Count (Packard, CT) o un sistema alternativo. </li></ol> 7. Informática porcentaje de supresión <ol><li> Como las células se cultivaron por triplicado, el promedio se calcula para cada condición. Si el coeficiente de variación es&gt; 30%, el valor atípico es eliminado y cpm sólo a partir de dos pozos se promedian. Porcentaje de la supresión se obtiene calculando [(sc) / s] x 100%, donde s = cpm en la cultura única y c = cpm en co-cultivo. </li><li> Como ingenuo (CD25) e in vivo activado (CD25low) las células T efectoras se colocan como células T de respuesta, la diferencia en la capacidad de células T reguladoras para suprimir cada uno de estos subconjuntos es capturado y utilizado como un indicador pronóstico potencial funcional basado en la premisa que las células activadas son más difíciles de suprimir. </li></ol> 8. Los resultados representativos: Una gran variabilidad en los métodos utilizados y los resultados derivados del análisis in vitro de la supresión humanos nos llevó a realizar un estudio exhaustivo de las condiciones que influyen en el ensayo 1. Hemos desarrollado un ensayo que prueba no sólo la función Treg, sino también su pureza, teniendo en cuenta la baja relación entre Tregs: Teffs (1:10), que determinó anteriormente 6. Además, se diferencian en células T reguladoras ªEIR capacidad de reprimir con éxito ingenuo e in vivo de células T activadas, incluso en sujetos sanos, como se muestra en la Figura 3 y en nuestros estudios anteriores 2,4, que se vuelve más importante si el balance inmunológico está comprometido, al igual que en los sujetos con riesgo de desarrollar DT1 . La prueba funcionó muy bien en el estudio donde se comparó la función supresora de los recursos naturales (nTregs), inducible (iTregs) e in vitro nTregs ampliado, lo que nos permite comparar su función entre los controles sanos, de reciente aparición (RO) DT1 y larga (LS ) sujetos DT1. Llegamos a la conclusión de que los sujetos RO DT1 mejor que la capacidad de generar tanto funcional iTregs nTregs y ampliado en comparación con sujetos de control LS T1D y sano 7. Por lo tanto, este ensayo puede ser utilizado como una herramienta excelente en el reconocimiento tanto de un estado temprano y tardío de un desequilibrio inmunológico. Esquema 1 Presentación esquemática de los pasos involucrados en la represión en el ensayo in vitro <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Pasos del ensayo de supresión in vitro presentados con fotografías <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Estrategia de apertura de puerta en el aislamiento de células FACS. a) CD25 umbral + se ajustó de acuerdo a Fluorocromo Minus One (FMO), b) las células fueron cerradas como FITC-negativos, c) FITC-negativos células fueron aún más cerrada y se recoge en CD + CD25, CD + CD25low y CD + CD25high ( Tregs) se muestra con porcentajes, d) FACS ordenados Tregs después de la clasificación, e) FACS ordenados CD + CD25low después de la clasificación, y f) FACS ordenados CD4 + CD25 de las células T después de la clasificación <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Los resultados representativos de los sujetos sanos a) Los resultados representativos de cuentas por minuto (cpm) de los sujetos sanos presentan como un solo cultivo para todos los subconjuntos de células implicadas (ingenuo-CD25-en vivo-activa CD25low, células presentadoras de antígeno-APC y regulación de las células T-Treg), así como co-cultivos de células T de respuesta (CD25-o CD25low) y células T reguladoras. b) El porcentaje de supresión de cada uno de CD25-y CD25low respuesta por las células T autólogas Tregs se presenta para los controles sanos (n = 4). Supresión se calcula como [(sc) / s] x 100%, donde s = cpm en la cultura única y c = cpm en co-cultivo. Aunque ligera diferencia en la capacidad de las células T reguladoras para suprimir la respuesta de células T se dio cuenta, no fue significativa (prueba t pareada p = 0,08). C) Se presentan cpm en temas de riesgo de cada cultura individual, incluyendo CD25-y CD25low como respuesta las células T, así como APC y Tregs, y co-culturas donde se siembra cada subconjunto de respuesta de células T con células T reguladoras (CD25-/Tregs y CD25low/Tregs). d) Porcentaje de la supresión de cada uno de CD25-y las células T de respuesta CD25low autólogo Tregs se presenta en sujetos de riesgo (n = 4). La diferencia en la capacidad de las células T reguladoras para suprimir CD25-en comparación con las células T CD25low respuesta fue significativa (prueba t pareada p = 0,04). Tabla 1. Esquema de puesta en marcha de ensayo de supresión in vitro <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1.3 </td><td> 6.4 </td><td> 9.7 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> los medios de comunicación sólo </td><td> los medios de comunicación sólo </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25-/ Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Tregs sólo </td><td> APC sólo </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Como la única característica única de células T reguladoras, la función de supresión debe ser probado de forma fiable y uniforme entre los sujetos en las diferentes fases de desarrollo de la enfermedad dentro de la misma y entre los diferentes estudios. Le ofrecemos los detalles de la prueba de supresión desarrollado en nuestro laboratorio como nuestra contribución a la normalización de este ensayo. En nuestro estudio de optimización extensa, hemos determinado que la estimulación de células T con anti-CD3 hu...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo o instrumento </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> Amersham Pharmacia Biotech </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de tripano </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 microbolas </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> Separación de los pre-filtros </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LS columna </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD4 humano APCCy7 (clon RPA-T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD25-PE (clon M-A251, IL-2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD8-FITC (clon RPA-T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD14-FITC (clon M5E2; receptor de LPS) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD32-FITC (clon FLI8.26; FcγR de tipo II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD116-FITC (clon M5D12, GM-CSFRα cadena) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 humanos </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> Casero </td><td></td><td> 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> Casero </td><td></td><td> PBS/2mM EDTA / 0,1% BSA pH 7,4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> Casero </td><td></td><td> 0,2% de BSA pH 8,5 Tris/0.1 </td></tr><tr><td> Completa los medios de comunicación RPMI </td><td> Casero </td><td></td><td> Medio RPMI 1640 glutamina 2 mM L-5 mM HEPES 100 U / mg / ml penicilina / strept 0,5 mM piruvato sódico </td></tr><tr><td> [3 H] timidina </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> humanos agrupados suero AB </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de la cosecha multipantalla </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

human in vitro suppression as screening tool for the recognition of an early state of immune imbalance

Las células T reguladoras (Tregs) son mediadores críticos de la tolerancia inmunológica a antígenos propios. Además, son reguladores esenciales de la respuesta inmune después de una infección. A pesar de los esfuerzos para identificar marcadores de superficie única en Tregs, la única característica única es su capacidad para suprimir la proliferación y la función de las células T efectoras. Si bien es claro que sólo en los ensayos in vitro se pueden utilizar en la evaluación de la función Treg humanos, esto se vuelve problemático cuando se evalúen los resultados de los estudios transversales en las células sanas y células aisladas de pacientes con enfermedades autoinmunes (como la diabetes tipo 1-DT1) necesitan para ser comparados. Hay una gran variabilidad entre laboratorios en el número y tipo de células T de respuesta, la naturaleza y la fuerza de la estimulación, Treg: ratios de respuesta y el número y tipo de células presentadoras de antígeno (APC) que se utiliza en humanos en ensayos de supresión in vitro. Esta variabilidad hace que la comparación entre los estudios de medición de la función Treg difícil. El campo de las necesidades de Treg un ensayo de supresión estándar que funcione bien con los sujetos sanos y aquellos con enfermedades autoinmunes. Hemos desarrollado un ensayo de supresión in vitro que muestran muy poca variabilidad intra-ensayo en la estimulación de células T aisladas de voluntarios sanos en comparación con sujetos con base destrucción autoinmune de las células pancreáticas β-. El objetivo principal de esta obra es describir un ensayo in vitro supresión humanos que permita la comparación entre grupos de sujetos diferentes. Además, este ensayo tiene el potencial para delinear una pequeña pérdida en la función nTreg y anticiparse a una mayor pérdida en el futuro, por lo tanto la identificación de los sujetos que podrían beneficiarse de la terapia inmunomoduladora preventivas 1. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de los pasos involucrados en este procedimiento. Esperamos contribuir a la estandarización de la prueba de supresión in vitro utilizado para medir la función Treg. Además, le ofrecemos este ensayo como una herramienta para reconocer un estado inicial de desequilibrio inmunológico y un biomarcador potencial funcional de DT1.

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado<em&gt; In vitro</em&gt; Prueba capaz de identificar el desequilibrio inmunológico en personas en riesgo de desarrollar DT1.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

14.4K vistas.  Medical College of Wisconsin. Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado In vitro Prueba capaz de identificar el desequilibrio inmunológico en personas en riesgo de desarrollar DT1.