אנו מודים טראן הוין, אנדרו סן אנטוניו, ג&#39;רי לין לסיוע הטכני שלהם. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי DA023700 וDA023700-04S1 לXX

1. הכנת פרוסת המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מהונדסים הם עמוקים מורדמים בנתרן פנטוברביטל (&gt; 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג, ip) ומהירות ערופה, והמוח שלהם חולצו בפתרון חיתוך קפוא וחומץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקפי GFP משמשים ראייה למסך אם מוח העכבר אמנם מבטא את ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקים בקליפת מוח חושיים ראשוניים של 400 מיקרומטר העבה לחתוך עם vibratome בנוזל המכיל סוכרוז המלאכותי השדרתי (ACSF). פרוסות מודגרת ראשון בסוכרוז המכיל ACSF למשך 30 דקות עד 1 שעות ב 32 ° C, ואחרי תקופת הדגירה הראשונית, הועברו לACSF הקלטה בטמפרטורת חדר. במהלך הדגירה וההקלטה, בפרוסות בעבעו ברציפות עם 95% 2% -5 O CO 2. </li></ol> 2. הפעלת ציוד היישום הכולל של המערכת בא לידי ביטוי באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת קירור הליזר וספק כוח היא אל תדליקד ב, מקבל הליזר מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל החומרה הקשורה לשליטת photostimulation (כולל מערכת סריקת המראה, אפנן אופטי, תריס אלקטרוני ומגבר קלט photodiode) מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד אלקטרו (כולל מגבר 700B Multiclamp וmicromanipulators) מופעל. הקלטות אלקטרו, photostimulation, והדמיה של ההכנות הפרוסות נעשות בתא זלוף פרוסה הועלה על הבימה הממונעת של מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצלמת ההדמיה (Retiga 2000, ש-הדמיה, אוסטין, טקסס) מופעלת. פרוסות דמיינו עם מיקרוסקופ הזקוף (BW51X, אולימפוס) עם ניגוד אינפרא אדום הפרש התערבות (DIC) ואופטיקה עלית ניאון באמצעות מערכת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת Matlab מבוססת EPHUS ותוכנת מצלמה ש-לכידה הם התחילו. גרסה מותאמת עדכון של תוכנת Ephus (Ephus, זמין <a href="https://openwiki.janelia.org/">בhttps://openwiki.janelia.org/ &lt;</a>/&gt;) משמש לשליטת פרוטוקולי photostimulation ולרכוש נתוני photostimulation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהמערכת מופעלת, צריך לבדוק אם מערכת photostimulation הליזר היא במצב עבודה. כאובייקטיבי מיקרוסקופ 4x משמש להעברה את הבזקי UV למשחרר רפרוף גלוטמט, פיסת נייר לבן ניתן לשים תחת להתבונן דפוס סריקת ליזר תוך המערכת פועלת. </li></ol> 3. הגדרת זלוף פרוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת זלוף לחץ מופעלת להאכיל ACSF ההקלטה לתוך חדר הפרוסה. טיפול נלקח על מנת להבטיח רמת נוזל קבועה של 2.0 מ&quot;מ מעל הפרוסה בבית הבליעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot של פתרון המניות של משרד תשתיות הלאומיים, בכלוב-גלוטמט הוא הוסיף 25 מ&quot;ל של מחזורי ACSF לריכוז של 0.2 מ&quot;מ גלוטמט בכלוב. שים לב שאחרי 5-6 שעות של ניסויים, פתרון האמבטיה וMNI-גלוטמט יהיה רעננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסת מוח מועברת לתא ההקלטה. אפשר להפעיל את ההדמיה שלystem כדי לבדוק את האיכות והפרוסה אנטומית לאתר את האזור החושי הראשוני. אז הפרוסה מעוגנת בטבעת פלטינת מייתר בהזמנה אישית. יש להיזהר שלא לשים את העוגן על האזור במוח המיועד להקלטות. </li></ol> 4. הקלטת תא כל תיקון clamping- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות זכוכית (MΩ 4-6 התנגדות) הם משכו ומלאים בפתרון פנימי המכיל biocytin 0.1% לתיוג תא וזיהוי מורפולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע הקלטת תיקון, תאים הם דמיינו במטרת 60x. סוגי תאים מעכבים מזוהים ראשון ונבחרו על סמך הדמיה של ביטוי של GFP תחת מיקרוסקופ אולימפוס דסק&quot;ש / ניאון; הקלטות לאחר מכן מתבצעות תחת בקרה חזותית בעזרת ניטור וידאו דסק&quot;ש אינפרא אדום. שים לב כמה פעמים במעבר בין מצבי DIC וניאון יש צורך לאשר את מיקום תא GFP עת שהתקרב לאלקטרודה לתא המטרה. </li><lאני&gt; טכניקות קונבנציונליות תיקון clamping-מוחל. האלקטרודה מלאה בלחץ חיובי, עבר בסמוך לתא השטח להקמת גומה נראית לעין על קרום תא המטרה, ולאחר מכן לחץ שלילי מיושם במהירות כדי ליצור gigaseal ולפרוץ תוך המעקב אחר תגובות ההזרקה הנוכחית על צג וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השבירה ב, התמונות של התא ב60x תחת מצבי DIC וניאון נלקחות לאימות באופן מקוון. לפני איסוף נתוני photostimulation, hyperpolarizing וdepolarizing פולסים נוכחיים הזריק לבחון תכונות אלקטרו הבסיסיות של כל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי תאים שלמים ברגע יציב מושגות עם התנגדות גישה טובה (בדרך כלל &lt;20 MΩ), מטרת מיקרוסקופ מופעלת מ60x ל4x לphotostimulation סריקת הליזר. התמונה הפרוסה ב4x נרכשה ותשמש להדרכה ורישום אתרי photostimulation. </li></ol> 5. הליזר SCAnning photostimulation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את הפרמטרים לרכישת photostimulation ונתונים נקבעים על ידי הפעלת מודול מתג התצורה של Ephus. בדרך כלל, 1 MS ליזר (20 mW) עם מרווח גירוי של 1 שני משמש למיפוי photostimulation. עקבות נתונים של 1 שני נדגמו ב 10 קילוהרץ הם נרכשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת פרוסת 4x נטענת למודול הממפה של Ephus. המיקום של סומה תא מוגדר, ואתרי photostimulation של תבנית בגודל 16x16 (80 מיקרומטר 80 מיקרומטר ריווח x) מוגדרים סביב מיקום התא, מכסים את כל שכבות בקליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרופיל העירור של נוירון נרשם ממופה על ידי בחינת מיקומי תקיעת המסמר בתגובה לphotostimulation במצב הנוכחי המהדק. התוכנה הידידותית למשתמש שלנו עם תכונות התצוגה מקוונות מאפשרת ניסויי המיפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבורי מעגלים מעוררים מקומיים ממופים זיהוי של זרמי postsynaptic מעוררים (EPSC) מהתא נרשם בזמן סריקת ליזר בשונהמקומות. התא מתקיים ב -70 mV במצב מהדק מתח כדי לזהות זרמים מעוררים פנימה. מפות EPSC חוזרות 2-3 פעמים עם מסובב דפוס photostimulation או התהפכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: חיבורי מעגלים מעכבים מקומיים יכולים גם ממופים על ידי זיהוי של זרמי postsynaptic מעכבים (iPSC) מהתא המוקלט שנערך על קרוב ל 0 mV במצב מהדק מתח כדי לזהות זרמים מעכבים חיצוניים. שים לב שהדרך טובה ביותר הוא להשתמש בפתרון הפנימי אלקטרודה עם אשלגן הוחלף בצזיום למיפוי iPSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל המבחנים הפיסיולוגיים סקרים, אלקטרודה מוסרת בעדינות מהתא המוקלט. פרוסת המוח נלקחת החוצה וקבוע בparaformaldehyde 4% בין הלילה. התאים נרשמו מוכתמים נגד biocytin. מורפולוגיה תא נבדקה עם מיקרוסקופיה confocal או עלית הניאון, שגם מאשר שכל תא הוא אכן נרשם interneuron GFP להביע ממוקד במקור. </li></ol> 6. Photostimulatניתוח נתוני יון מתודולוגיה חדשה שפותחה שלנו ויישום תוכנה 11 מוחלת על זיהוי והמדידה של photostimulation-עוררו אירועים הסינפטי במפות הנתונים הגולמיות. כפי שהודגם באיור 2, מפות צבעוניות שנבנות על מנת להמחיש את הדפוס של קלט הסינפטי לנוירון נרשם. 7. נציג תוצאות: תוצאות לדוגמה של הקלטה ומיפוי אלקטרו photostimulation מוצגות באיור 2. הקלטות ממוקדות של סוגי תאים מעכבים ספציפיים מתאפשרות באמצעות עכברים מהונדסים המבטאים GFP בסוגי תאים מעכבים ידועים. בהינתן המגוון של interneurons המעכב, ניתוחים של ביטוי של GFP, אלקטרו הפנימי ומאפיינים מורפולוגיים (איור 2 א) משולבים להגיע לסיווג סוג התא הסופי. תרשים 2B-C להמחיש שphotostimulation סריקת הליזר מאפשר מיפוי מקיף של cortic המקומיal חיבורי מעגלים להנוירונים מעכבים יחידים. מפת הנתונים הגולמית שמוצגת באיור 2 ג. את התגובות משחררות רפרוף הישירות אינן נכללות בניתוח נתונים (האיור 2C). מפות הקלט כמותיים מסומנות בצבעים, שמוצגות באיור 2D-F. את interneurons המעכב מהיר spiking הדוגמא קבל קלט הסינפטי מעורר חזק (EPSCs) משכבה 4 ושכבות עמוקות יותר. על ידי הנוגע לארגון הקלט הסינפטי של התא למסלולים קורטיקליים מוגדרים, אנו יכולים להסיק התפקיד האפשרי שלו (למשל, משוב ועיכוב feedforward) בעיבוד מידע בקליפת המוח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> איור 1. מכשור כללי למערכת photostimulation סריקת הליזר. המערכת הכוללת שלנו מורכב משליטת photostimulation, הדמית וידאו, ומערכות הקלטת אלקטרו. אנחנו אמצנו את העיצוב של מערכת LSPS תואר קודם 7,17. יחידת ליזר משמשת לייצור 355 ננומטר UV אסאה למשחרר רפרוף גלוטמט. קרן הליזר מכוון דרך הנתיב האופטי של המערכת שלנו. משכי זמן קצרים של הבזקי ליזר (למשל, 1 - 3 ms) נשלטים על ידי שימוש במאפנן אלקטרו אופטי (כלומר, pockels תא) וצמצם מכאני. כוח קרן הליזר הוא מווסת על ידי גלגל שיפוע צפיפות ניטראלית ופיקוח על ידי הסטת חלק קטן של קרן הליזר עם coverslip זכוכית לphotodiode. מערכת סריקת הליזר כוללת זוג XY של מראות סריקה, סריקת העדשה, עדשות הצינור, ועדשה האובייקטיבית. המראות לספק קרן הליזר דרך עדשת סריקה, ולאחר מכן את הקרן נכנסה למיקרוסקופ באמצעות מראה Dichroic וממוקד על ידי עדשת מחוייט UV-העברת צינור. קרן underfills הצמצם האחורי של מטרת מיקרוסקופ כדי לספק יותר עמודים (בניגוד לצורה חרוטה) קרן מאירה, שמירה על המיפוי כדו ממדים שניתן על ידי הקטנת הרזולוציה הצירית. תחת מטרת 4x, קרן הליזר יוצרת כתמים משחררים רפרוף, כל approximating פרופיל Gaussian ברוחב של 153 מיקרומטר הרוחבי במישור המוקד (ראה מסגרת). עמדות גירוי ליזר שונות יכולות להיות מושגות באמצעות מראות סריקת XY galvanometers מונחה, כמו המראות והצמצם האחורי של המטרה הן במטוסים המצומד, לתרגם עמדות המראה למקומות שונים בסריקת מישור המוקד של העדשה האובייקטיבית. במהלך משחרר רפרוף, מספר משתנה של אתרי דוגמת שמכסים את כל השדה מומרצים רצף בnonraster, רצף אקראי, כדי למנוע מחודש קרבת אתרי מגורה לאחרונה. אנא עיין בשו et al. (2010) לקבלת מידע מפורט יותר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> איור 2. מיפוי קשרי מעגלים מעוררים מקומיים לinterneuron GFP מבטא מהיר spiking בשכבת 4 של קליפת מוח התחושתית עכבר עיקרית. A1 ו-A2 להראות את תמונות DIC וGFP ניאון של התא הממוקד תחת 60xמטרה בפרוסת המוח החייה, ואילו A3 מציג את המורפולוגיה של התאים שהתגלתה על ידי הצביעה בbiocytin לאחר הקלטת פרוסה, הקבועה. A4 מציג את דפוסי הירי של התא המוקלט GFP, האופייני לinterneuron המעכב המהיר spiking, בתגובה לזריקות נוכחיות intrasomatic של עוצמות שונות. B מציג את התמונה על גבי הפרוסה עם 16 אתרי photostimulation x16 (*). מיקום התא מסומן בעיגול האדום הקטן. C מראה מערך של עקבות תגובה photostimulation עורר-ממקומות הגירוי מוצגים בB, ואילו התא התקיים ב -70 mV לאתר זרמים מעוררים פנימה. צורות שונות של תגובות photostimulation מומחשות באמצעות העקבות במקומות 1 ו 2, שהתרחבו ובנפרד מוצגים בכנס. עקבות 1 היא דוגמה לתשובות ישירות (שמצוין על ידי ראשי החץ האדומים) לגלוטמאט משחרר רפרוף על גוף התא ודנדריטים promximal. עקבות אחרות ב2 הן דוגמאות טיפוסיות של הסינפטי מעורר בלשים תגובות (כחול). תשובות ישירות ותשומות סינפטיים יכולים להיות מכובדות על ידי אמפליטודות שלהם, וזמן תגובת תגובה. D, E ו-F הן מפות בצבעים (16x16 אתרים) של ממוצע EPSC משרעת, מספרי EPSC והשהית EPSC התגלתה לראשונה לאתר, בהתאמה, עבור הנתונים הגולמיים המפה מוצגת בג משרעת הקלט ממוצע מכל אתר הוא גירוי המשרעת הממוצעת של EPSCs בחלון הניתוח, בתגובה הספונטנית הבסיסית נגרעה מתגובת photostimulation של אותו האתר. מספר EPSCs ואת זמן ההגעה או ההשהיה של EPSC התגלה לראשונה לאתר גם מדד וזמם. אנא עיין ב( השי et al., 2010) לקבלת פרטים נוספים.

<ol>
	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons.">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+sources+of+synaptic+input+to+cortical+inhibitory+interneurons+and+pyramidal+neurons.">Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).</li><li>Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-scale+specificity+of+cortical+networks+depends+on+inhibitory+cell+type+and+connectivity.">Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity.</a> Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).</li><li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex.">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li><li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex.">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li><li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation.">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cortical+inhibitory+neuron+type+that+coexpresses+somatostatin+and+calretinin.">Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin.</a> J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).</li><li>Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+matched+filtering+for+synaptic+event+detection+and+extraction.">Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction.</a> PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses.">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li><li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex.">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכניקות מיפוי Photostimulation מבוססות כבר מיושם ביעילות לניתוח מעגלים בקליפת מוח. photostimulation סריקת הליזר בשילוב עם הקלטת תא שלמה מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוה של הפצות עלעלים של מקורות קלט presynaptic לנוירונים בודדים, כי ההקלטה סימולטנית מנוירון postsynaptic עם photostimulation של צבירי נוירונ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> קווי עכבר מהונדסים </td><td> ג&#39;קסון מעבדה או מקורות אחרים </td><td></td><td> אנא עיין בשו וCallaway (2009) </td></tr><tr><td> GFP משקפים </td><td> BLS בע&quot;מ, הונגרי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> vibratome </td><td> מערכות יקה </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> משרד התשתיות הלאומי גלוטמט כלוב (4-methoxy-7-nitroindolinyl כלוב-L-גלוטמט) </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> מק&quot;ט 1490 </td><td></td></tr><tr><td> biocytin </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> חולץ אלקטרודה </td><td> סאטר Instrument, Novato, קליפורניה </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות זכוכית להכנת אלקטרודות </td><td&gt; </td><td> BF150-86-10 </td><td></td></tr><tr><td> Multiclamp מגבר 700B </td><td> התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA </td><td> Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> דיגיטלית מצלמת CCD </td><td> Q-הדמיה, אוסטין, טקסס </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ מחקר </td><td> אולימפוס, טוקיו, יפן </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> יחידת הליזר UV </td><td> DPSS לייזרים, סנט קלרה, קליפורניה </td><td> מודל 3501 </td><td></td></tr><tr><td> ציוד אחר לphostimulation סריקת הליזר </td><td></td><td></td><td> אנא עיין בשו et al. (2010) </td></tr></tbody></table> פתרונות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוכרוז המכיל נוזל השדרתי מלאכותי (ACSF) לחיתוך פרוס (במ&quot;מ: 85 NaCl, 75 סוכרוז, 2.5 KCl, 25 גלוקוז, 1.25 nah 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, ו24 3 NaHCO). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההקלטה ACSF (במ&quot;מ: 126 NaCl, KCl 2.5, 26 3 NaHCO, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1.25 nah 2 PO 4, ו 10 גלוקוז) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון האלקטרודה פנימי (במ&quot;מ: 126 K-גלוקונאט, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, ו 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm). </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

הנוירונים מעכבים הם קריטיים לתפקוד של קליפת מוח. הם מהווים כ 20% מהאוכלוסייה העצבית בקליפת המוח כולו וניתן לסווג נוסף לתוך תת מגוונים המבוסס על immunochemical, הצורני שלהם, והתכונות פיסיולוגיות 1-4. למרות שמחקרים קודמים גילו הרבה על תכונות פנימיות של סוגים שונים של תאי עצב מעכבים, ידע על קשרי המעגלים המקומיים שלהם הוא עדיין מצומצם יחסית 3,5,6. בהתחשב בכך שהפונקציה של כל נוירון בודד מעוצבת על ידי הקלט המעורר והמעכב הסינפטית בתוך מעגלי קליפת מוח, היינו באמצעות ליזר סריקת photostimulation (LSPS) לחיבורים במעגל מקומיים המפה לסוגי תאים מעכבים ספציפיים. בהשוואה לגירוי חשמלי קונבנציונלי או גירוי עלים גלוטמט, LSPS יש יתרונות ייחודיים המאפשרים מיפוי מקיף וניתוח כמותי של תשומות פונקציונליות מקומיות לנוירונים 3,7-9 נרשמו בנפרד. ליזר תמונהגירוי באמצעות משחרר רפרוף גלוטמט סלקטיבי מפעיל נוירונים perisomatically, ללא הפעלת האקסונים של מעבר או דנדריטים הדיסטליים, אשר מבטיח רזולוצית מיפוי תת מינרית. הרגישות והיעילות של LSPS לתשומות מיפוי מאתרי גירוי רבים על פני אזור גדול מתאימות גם לניתוח מעגל קליפת מוח. כאן אנו מציגים טכניקה של LSPS שילוב עם תיקון כל תאי clamping למיפוי מעגל מעכב מקומי. הקלטות ממוקדות של סוגי תאים מעכבים ספציפיים בהנחייתם של שימוש בעכברים מהונדסים המבטאים חלבוני ניאון ירוקים (GFP) באוכלוסיות נוירון מעכבות מוגבלות בקליפת 3,10, המאפשרת דגימה עקבית של סוגי התאים הממוקדים וזיהוי חד משמעי של סוגי התאים נרשמו . באשר למיפוי LSPS, אנו מתארים את מכשור המערכת, לתאר את הליך הניסוי ורכישת נתונים, ודוגמאות נוכחיות של מיפוי מעגל בעכבר העיקרי somatosensory קליפת המוח. כפי שהודגם בניסויים שלנו, גלוטמט כלוב מופעל באזור מרחב מוגבל של פרוסת המוח על ידי photolysis הליזר UV; הקלטות בו זמנית מתח מהדק לאפשר זיהוי של תגובות הסינפטי photostimulation-עוררו. מפות של קלט הסינפטי או מעכב או מעורר לנוירון הממוקד נוצרות על ידי סריקת קרן הליזר כדי לעורר מאה אתרים presynaptic פוטנציאליים. לפיכך, LSPS מאפשר הבנייה של מפות מפורטות של תשומות סינפטיים impinging על סוגים מסוימים של נוירונים מעכבים באמצעות ניסויים חוזרים ונשנים. יחדיו, הטכניקה photostimulation המבוססת מציעה מדעני המוח כלי רב עצמה לקביעת הארגון הפונקציונלי של מעגלי קליפת מוח המקומיים.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation at JoVE.com

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

נייר זה מציג את גישה של שילוב סריקת הליזר photostimulation עם הקלטות תא שלמות בעכברים מהונדסים המבטאים GFP באוכלוסיות נוירון מעכבות מוגבלות. הטכניקה מאפשרת מיפוי מקיף וניתוח כמותי של מעגלים סינפטיים המקומיים של נוירונים בקליפת המוח מעכבים ספציפיים.

מיפוי מעגלים עצביים מעכבים ידי Photostimulation סריקת הליזר

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

mapping-inhibitory-neuronal-circuits-laser-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Views.  University of California, Irvine. נייר זה מציג את גישה של שילוב סריקת הליזר photostimulation עם הקלטות תא שלמות בעכברים מהונדסים המבטאים GFP באוכלוסיות נוירון מעכבות מוגבלות. הטכניקה מאפשרת מיפוי מקיף וניתוח כמותי של מעגלים סינפטיים המקומיים של נוירונים בקליפת המוח מעכבים ספציפיים.

Video: Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

עיצוב, משטח טיפול, סלולרי ציפוי, וCulturing של רשתות עצבי מודולרי מורכב ממעגלי קשרים בין פונקציונלי

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.