نشكر تران هيونه، أندرو سان أنطونيو، لين جيري للحصول على المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DA023700 وDA023700-04S1 إلى XX

1. الدماغ شريحة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران المعدلة وراثيا هي بعمق مع الصوديوم بنتوباربيتال (&gt; 100 ملغ / كغ، والملكية الفكرية) وقطع رأسه بسرعة، وانتزعت أدمغتهم في حل القطع المجمدة والاوكسيجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم نظارات GFP لفحص البصر إذا مخ الفأر عن الواقع GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع الفروع القشرية الحسية الجسدية الأولية من 400 ميكرون سميكة مع vibratome في السكروز التي تحتوي على السائل المخي الشوكي الاصطناعي (ACSF). يتم تحضين شرائح 1 في ACSF-السكروز التي تحتوي على لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة عند 32 ° C، وبعد فترة الحضانة الأولية، ونقل إلى ACSF تسجيل في درجة حرارة الغرفة. في جميع أنحاء الحضانة والتسجيل، وانفجر بشكل مستمر مع شرائح 95٪ O 2 -5٪ CO 2. </li></ol> 2. معدات بدء التشغيل ويتضح تنفيذ نظام شامل في الشكل 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظام التبريد بالليزر ومزود الطاقة turneد على، والحصول على استعداد ليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تشغيل كافة الأجهزة المتصلة بمكافحة ضوئي (بما في ذلك نظام مرآة المسح الضوئي، المغير الضوئي، وهو مصراع الإلكترونية ومكبر للصوت الإدخال الثنائي الضوئي) على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المعدات الكهربية (بما في ذلك مكبر للصوت ل700B Multiclamp وmicromanipulators) على. تتم التسجيلات الكهربية، ضوئي، والتصوير من الأعمال التحضيرية في شريحة شريحة غرفة نضح شنت على المسرح الآلية من المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تشغيل الكاميرا التصوير (Retiga 2000، Q-التصوير، أوستن، تكساس) على. وتصور شرائح المجهر تستقيم مع (BW51X، أوليمبوس) مع الأشعة تحت الحمراء الفرق المقابل تدخل (DIC) وبرنامج التحصين الموسع، الفلورسنت البصريات من خلال نظام التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم بدء تشغيل برنامج ماتلاب EPHUS القاعدة وQ-برنامج الكاميرا التقاط ما يصل. وهناك نسخة مخصصة معدلة من البرمجيات Ephus (Ephus، متاحة على <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/ &lt;</a>/ A&gt;) يستخدم للسيطرة على بروتوكولات ضوئي والحصول على البيانات ضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد النظام في وضع التشغيل، ينبغي للمرء أن تحقق لمعرفة ما إذا كان نظام ضوئي بالليزر هو في حالة عمل. كما يتم استخدام المجهر الهدف 4X لتقديم ومضات أشعة فوق البنفسجية لuncaging الغلوتامات، يمكن وضع قطعة من الورق الأبيض تحت لمراقبة نمط المسح الضوئي ليزر في حين أن نظام تشغيل. </li></ol> 3. إنشاء شريحة نضح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تشغيل نظام نضح الضغط على لتغذية ACSF تسجيل في غرفة شريحة. والحرص على ضمان مستوى ثابت من السوائل 2.0 مم فوق شريحة في القاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إضافة قسامة من محلول المخزون من MNI-الغلوتامات، في قفص إلى 25 مل من تعميم ACSF لتركيز 0.2 ملم الغلوتامات في قفص. يرجى ملاحظة أن بعد 5-6 ساعات من التجريب، سيتم تحديث الحل حمام وMNI الغلوتامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل شريحة الدماغ إلى غرفة تسجيل. يمكن للمرء تشغيل ليالي التصويرystem للتحقق من الجودة وتحديد شريحة تشريحيا المنطقة الحسية الجسدية الأولية. ثم يرتكز على شريحة مع عصابة حسب الطلب البلاتين الوترية. يجب الحرص على عدم وضع مرساة على المنطقة المخصصة للتسجيلات الدماغ. </li></ol> 4. كله خلية التصحيح لقط تسجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم سحب أسلاك الزجاج (4-6 المقاومة MΩ) ومليئة حلا الداخلية التي تحتوي على 0،1٪ biocytin لوضع العلامات وتحديد الخلية المورفولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء تسجيل التصحيح، وتصور الخلايا في الهدف 60X. وأول من عرف أنواع الخلايا المثبطة واختيارها على أساس التصور التعبير GFP تحت المجهر أوليمبوس DIC / الفلورسنت، و تجرى في وقت لاحق التسجيلات المرئية تحت السيطرة بمساعدة الأشعة تحت الحمراء رصد الفيديو DIC. يرجى ملاحظة أن عدة مرات من التبديل بين أوضاع DIC والفلورسنت ضروري لتأكيد موقع الخلية في حين تقترب GFP القطب إلى الخلية المستهدفة. </li><lيتم تطبيق ط&gt; التقليدية التصحيح لقط التقنيات. انتقل يتم تعبئة القطب مع ضغط موجب، على مقربة من سطح الخلية لإنشاء الدمل ملحوظ على غشاء الخلية المستهدفة، ويتم تطبيق الضغط بسرعة ثم سلبية لتشكيل gigaseal وكسر في حين رصد ردود حقن الحالي على شاشة فيديو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على كسر في، يتم أخذ الصور للخلية في 60X تحت سائط DIC والفلورية للتحقق على الخط. قبل جمع البيانات ضوئي، يتم حقن hyperpolarizing وإزالة إستقطاب البقول الحالي لدراسة خصائص كل خلية في الكهربية الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتتحقق مرة واحدة مستقرة تسجيلات خلية كاملة مع المقاومة وصولا جيدا (عادة &lt;20 MΩ)، يتم فيها تشغيل المجهر الهدف من 60X إلى 4x ضوئي ليزر المسح. ويتم الحصول على صورة شريحة 4x وسوف تستخدم لتوجيه وتسجيل مواقع ضوئي. </li></ol> 5. الليزر هيئة السلع التموينيةnning ضوئي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعيين المعلمات اقتناء ضوئي والبيانات من خلال تفعيل وحدة التبديل تكوين Ephus. عادة، يتم استخدام الليزر 1 مللي ثانية (20 ميغاواط) مع فاصل زمني التحفيز من 1 ثانية لرسم خرائط ضوئي. يتم الحصول على البيانات من 1 ثانية آثار عينات في 10 كيلوهرتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحميل صورة شريحة 4X داخل الوحدة النمطية معين من Ephus. ويعرف موقع سوما الخلية، ويتم تعيين مواقع ضوئي من نمط 16X16 (80 ميكرومتر ميكرومتر تباعد X 80) في كل أنحاء موقع الخلية، التي تغطي جميع الطبقات القشرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعيين الملف استثارة الخلايا العصبية سجلت عن طريق فحص المواقع ارتفاعه ردا على ضوئي في وضع المشبك الحالي. لدينا برنامج إلكتروني سهل الاستخدام مع ميزات عرض على الانترنت يسهل التجارب رسم الخرائط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعيين الدائرة المحلية اتصالات مثير من خلال الكشف عن التيارات بعد المشبكي مثير (EPSC) من الخلية بينما سجلت الليزر المسح الضوئي في مختلفالمواقع. يقام الخلية في -70 بالسيارات في وضع المشبك الجهد للكشف عن التيارات مثير الداخل. وتتكرر الخرائط EPSC 2-3 مرات مع استدارة أو انعكاس ضوئي نمط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: الدائرة المحلية اتصالات المثبطة يمكن تعيينها أيضا من خلال الكشف عن التيارات بعد المشبكي المثبط (IPSC) من الخلية مسجل عقد في وثيقة إلى 0 بالسيارات في وضع المشبك الجهد للكشف عن التيارات المثبطة الخارج. ملاحظة أنه من الأفضل استخدام القطب الكهربائي الحل الداخلي مع البوتاسيوم السيزيوم استبدال لرسم خرائط IPSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من جميع المقايسات الفسيولوجية، تتم إزالة بلطف القطب من الخلية مسجل. يتم أخذ شريحة من الدماغ وإصلاحها في بارافورمالدهيد 4٪ بين عشية وضحاها. اتسخت الخلايا سجلت ضد biocytin. يتم فحص شكل الخلية مع المجهري متحد البؤر أو الفلورسنت برنامج التحصين الموسع، وهو ما يؤكد أيضا أن كل خلية هي في الحقيقة سجلت عصبون، معربا عن GFP استهدفت في الأصل. </li></ol> 6. Photostimulatأيون تحليل البيانات يتم تطبيق منهجية تم تطويرها حديثا لدينا وتنفيذ البرامج 11 إلى كشف وقياس الأحداث ضوئي-أثار متشابك في خرائط البيانات الخام. كما يتضح في الشكل 2، هي التي شيدت مرمزة الخرائط لتوضيح نمط متشابك من المدخلات إلى الخلايا العصبية المسجلة. 7. ممثل النتائج: وتظهر النتائج مثال على تسجيل الكهربية ورسم الخرائط ضوئي في الشكل 2. واستهدفت تسجيلات من أنواع الخلايا المثبطة محددة ممكن باستخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن GFP في أنواع الخلايا المثبطة المعروفة. نظرا لتنوع interneurons المثبطة، يتم الجمع بين تحليلات التعبير GFP، الكهربية الذاتية والصفات المورفولوجية (الشكل 2A) للوصول إلى التصنيف النهائي الخلية نوع. الرقم 2B-C توضيح أن ضوئي ليزر المسح يسمح لرسم خرائط واسعة من cortic المحليةشركة اتصالات الدائرة لالخلايا العصبية المثبطة واحد. يظهر مخطط البيانات الخام في الشكل 2C. ويستثنى من الردود uncaging مباشرة من تحليل البيانات (الشكل 2C). الخرائط الإدخال الكمي ومرمزة، هو موضح في الشكل 2D-F. تلقت سبيل المثال سريع التشويك المثبطة interneurons قوية مدخلات متشابك مثير (EPSCs) من طبقة 4 و الطبقات العميقة. عن طريق ربط المنظمة الخلية المدخلات متشابك لمسارات محددة القشرية، ونحن قادرون على استنتاج دورها ممكن (على سبيل المثال، وردود الفعل وتثبيط feedforward) في معالجة المعلومات القشرية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> الشكل 1. الأجهزة العامة نظام ليزر ضوئي المسح. لدينا نظام التحكم الشامل يتكون من ضوئي، تصوير الفيديو، وأنظمة تسجيل الكهربية. اعتمدنا في تصميم نظام LSPS سبق وصفها 7،17. يتم استخدام وحدة لتوليد الليزر 355 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية لاسإيه لuncaging الغلوتامات. يتم توجيه شعاع الليزر من خلال مسار بصري لنظامنا. يتم التحكم باستخدام المغير الكهربائية الضوئية (أي pockels الخلية) ومفتاح ميكانيكي - فترات قصيرة من ومضات ليزر (3 مللي سبيل المثال، 1). شعاع الليزر الطاقة عن طريق التضمين عجلة التدرج الكثافة محايدة ورصد من خلال تحويل جزء صغير من شعاع الليزر مع ساترة الزجاج إلى الثنائي الضوئي. نظام المسح الضوئي ليزر يتضمن زوج من المرايا XY المسح، مسح العدسة، العدسة أنبوب، وعدسة الهدف. المرايا تسليم شعاع الليزر من خلال عدسة المسح الضوئي، ثم يدخل شعاع المجهر عبر مرآة مزدوج اللون ويتركز بواسطة عدسة مصنوعة خصيصا أنبوب الأشعة فوق البنفسجية الإرسال. شعاع underfills الفتحة الخلفي من الهدف المجهر لتوفير مزيد من عمودي (في مقابل المخروطية) إلقاء الضوء شعاع، والحفاظ على رسم الخرائط ثنائية الأبعاد وممكن عن طريق الحد من القرار المحوري. في إطار الهدف 4X، شعاع الليزر تشكل البقع uncaging، كل approximatiنانوغرام لمحة جاوس مع عرض من 153 ميكرومتر أفقيا في المستوى البؤري (انظر إدراج). ويمكن تحقيق العديد من المناصب تحفيز الليزر من خلال المرايا الجلفانومتر يحركها المسح XY، والمرايا وفتحة الخلفي من الهدف في الطائرات المتقارن، ترجمة مواقع مختلفة في مرآة مواقع المسح في الطائرة عدسة الهدف التنسيق. خلال uncaging، يتم تحفيز عدد متغير من نمط المواقع التي تغطي المجال الكامل بالتتابع في nonraster، اعشوائي تسلسل لتجنب إعادة النظر في محيط مواقع حفز مؤخرا. يرجى الرجوع إلى شو وآخرون (2010) للحصول على معلومات أكثر تفصيلا. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> الشكل 2. رسم الخرائط المحلية الاتصالات الدائرة مثير لعصبون السريعة التشويك، معربا عن GFP في طبقة القشرة 4 من الماوس الحسية الأولية. A1 و A2 عرض الصور وDIC الفلورسنت GFP للخلية المستهدفة تحت 60Xالهدف في شريحة الدماغ المعيشة، في حين A3 يبين شكل الخلية التي كشفت عنها تلطيخ biocytin في شريحة، بعد تسجيل الثابتة. A4 يوضح أنماط إطلاق الخلية GFP مسجل، سمة من عصبون السريعة التشويك المثبطة، واستجابة لحقن الحالي intrasomatic من نقاط القوة مختلفة. B تظهر صورة شريحة فرضه مع 16 موقعا ضوئي بسرعة x16 (*). يشار إلى موقع الخلية بواسطة دائرة حمراء صغيرة. C يظهر مجموعة من آثار استجابة ضوئي-أثار من المواقع التحفيز هو مبين في B، بينما عقدت خلية في -70 بالسيارات للكشف عن التيارات مثير الداخل. ويوضح أشكال مختلفة من الاستجابات ضوئي من آثار في مواقع 1 و 2، والذي يتم توسيع وتظهر بشكل منفصل في إدراج. تتبع 1 هو مثال للردود مباشرة (المشار إليها بواسطة رؤوس سهام الحمراء) إلى الغلوتامات uncaging على جسم الخلية والتشعبات promximal. آثار أخرى في 2 أمثلة نموذجية من متشابك مثير فيوضع استجابات (الأزرق). ويمكن تمييز الاستجابات المباشرة والمدخلات متشابك من سعة والإختفاء الاستجابة. D، E و F هي خرائط ملونة (16X16 المواقع) من متوسط ​​السعة EPSC، الأرقام EPSC، وأول الكمون EPSC الكشف في الموقع، على التوالي، للبيانات الخام هو مبين في الخريطة C. اتساع المدخلات المتوسط ​​من كل موقع التحفيز هو السعة متوسط ​​EPSCs في إطار التحليل، مع استجابة عفوية خط الأساس تطرح من الاستجابة ضوئي من نفس الموقع. كما يتم قياس عدد EPSCs ووقت الوصول أو الكمون من EPSC أول اكتشاف في الموقع وتآمر. يرجى الرجوع إلى (شي وآخرون، 2010) لمزيد من التفاصيل.

<ol>
	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons.">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+sources+of+synaptic+input+to+cortical+inhibitory+interneurons+and+pyramidal+neurons.">Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).</li><li>Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-scale+specificity+of+cortical+networks+depends+on+inhibitory+cell+type+and+connectivity.">Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity.</a> Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).</li><li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex.">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li><li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex.">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li><li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation.">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cortical+inhibitory+neuron+type+that+coexpresses+somatostatin+and+calretinin.">Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin.</a> J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).</li><li>Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+matched+filtering+for+synaptic+event+detection+and+extraction.">Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction.</a> PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses.">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li><li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex.">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد تم تعيين ضوئي تقنيات القائمة على التطبيق الفعال لتحليل الدوائر القشرية. ليزر ضوئي مسح جنبا إلى جنب مع تسجيل خلية كاملة يسمح رسم الخرائط عالية القرار من توزيعات الصفحي من مصادر إدخال الخلايا العصبية قبل المشبكي إلى واحد، وذلك لأن وقت واحد تسجيل من الخلايا العصبية...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> خطوط الماوس المعدلة وراثيا </td><td> جاكسون المختبر أو من مصادر أخرى </td><td></td><td> يرجى الرجوع إلى وكلوي شو (2009) </td></tr><tr><td> نظارات GFP </td><td> BLS المحدودة، المجر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> vibratome </td><td> نظم ايكا </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> MNI الغلوتامات في قفص (4-ميثوكسي-7-nitroindolinyl-L-الغلوتامات في قفص) </td><td> العلوم البيولوجية Tocris، Ellisville، MO </td><td> القط رقم 1490 </td><td></td></tr><tr><td> biocytin </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> القطب مجتذب </td><td> سوتر الصك، نوفاتو، CA </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب الزجاج لصنع أقطاب كهربائية </td><td&gt; </td><td> BF150-86-10 </td><td></td></tr><tr><td> Multiclamp مكبر للصوت 700B </td><td> الجزيئية الأجهزة، سانيفيل، CA </td><td> Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> الكاميرا الرقمية CCD </td><td> Q-التصوير، أوستن، TX </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> البحث المجهر </td><td> أوليمبوس، طوكيو، اليابان </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> UV وحدة الليزر </td><td> DPSS الليزر، سانتا كلارا، كاليفورنيا </td><td> نموذج 3501 </td><td></td></tr><tr><td> غيرها من معدات ليزر المسح phostimulation </td><td></td><td></td><td> يرجى الرجوع إلى شو وآخرون (2010) </td></tr></tbody></table> الحلول: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السكروز التي تحتوي على السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) لقطع شريحة (في ملي: 85 كلوريد الصوديوم، و 75 السكروز، 2.5 بوكل، 25 الجلوكوز، 1.25 ناه 2 PO 4، 4 MgCl 2، 0،5 CaCl 2، و 24 NaHCO 3). </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل ACSF (في ملي: 126 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 26 NaHCO 3، 2 CaCl 2، 2 MgCl 2، 1،25 ناه 2 PO 4، والجلوكوز 10) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل الكهربائي الداخلي (في ملي: 126 K-غلوكونات، 4 بوكل، 10 HEPES، 4 ATP-المغنيسيوم، 0.3 GTP نا، وفسفوكرياتين 10؛ درجة الحموضة 7.2، 300 الميلي أسمول). </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

الخلايا العصبية المثبطة وظيفة ذات أهمية حاسمة لالقشرية. انهم يشكلون حوالي 20٪ من مجموع السكان العصبية القشرية، ويمكن تقسيمها إلى مزيد من الأنواع الفرعية المختلفة على أساس المورفولوجية الخاصة بهم، مناعى، والخصائص الفسيولوجية 1-4. على الرغم من أن الأبحاث السابقة كشفت الكثير عن الخصائص الذاتية للفرد من أنواع الخلايا العصبية المثبطة والمعرفة عن صلاتهم الدوائر المحلية لا تزال محدودة نسبيا 3،5،6. بالنظر إلى أن تتشكل وظيفة كل عصبون المرء عن طريق مساهمتها متشابك مثير والمثبطة داخل الدوائر القشرية، لقد تم مسح ضوئي باستخدام الليزر (LSPS) لاتصالات خريطة الدوائر المحلية لأنواع الخلايا المثبطة محددة. مقارنة التحفيز الكهربائي التقليدية أو الغلوتامات التحفيز نفخة، LSPS لديه مزايا فريدة تسمح لرسم الخرائط والتحليل الكمي واسعة من المدخلات الفنية المحلية على الخلايا العصبية بشكل فردي سجلت 3،7-9. الليزر الصورةالتحفيز عن طريق uncaging الغلوتامات ينشط الخلايا العصبية بشكل انتقائي perisomatically، دون تفعيل محاور عصبية من التشعبات أو مرور البعيدة، والتي تضمن قرار التعيين الفرعية الصفحي. هي مناسبة تماما لحساسية وكفاءة المدخلات لرسم الخرائط LSPS من مواقع عديدة على مدى التحفيز منطقة كبيرة لتحليل الدوائر القشرية. هنا نقدم أسلوب LSPS جنبا إلى جنب مع خلية كاملة التصحيح للقط المحلية رسم خرائط الدوائر المثبطة. ومما يسهل من التسجيلات استهدفت أنواع الخلايا المثبطة محددة عن طريق استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) في الخلايا العصبية المثبطة محدودة السكان في القشرة 3،10، والتي تمكن من أخذ عينات تتفق أنواع الخلايا المستهدفة وتحديد واضح للأنواع الخلايا سجلت . أما بالنسبة لرسم الخرائط LSPS، ونحن الخطوط العريضة لنظام الأجهزة، ووصف الإجراء التجريبي والحصول على البيانات، وتقديم أمثلة على رسم خرائط الدوائر الابتدائية في الماوس somatosensory القشرة. كما هو موضح في تجاربنا، يتم تنشيط الغلوتامات في قفص في منطقة محدودة مكانيا من شريحة الدماغ عن طريق التحلل الضوئي ليزر الأشعة فوق البنفسجية؛ متزامنة الجهد المشبك التسجيلات تسمح كشف ضوئي-استجابات متشابك. يتم إنشاء خرائط لمدخلات متشابك مثير أو المثبطة إما إلى الخلايا العصبية المستهدفة عن طريق المسح الضوئي شعاع الليزر لتحفيز مئات المواقع المحتملة قبل المشبكي. وهكذا، يمكن LSPS بناء خرائط تفصيلية للمدخلات متشابك تؤثر على أنواع معينة من الخلايا العصبية المثبطة من خلال التجارب المتكررة. أخذت معا، هذه التقنية على أساس ضوئي يقدم علماء الأعصاب أداة قوية لتحديد التنظيم الوظيفي للدوائر المحلية القشرية.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation at JoVE.com

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

تقدم هذه الورقة مقاربة الجمع بين المسح الضوئي ليزر ضوئي مع تسجيلات خلية كاملة في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن GFP في الخلايا العصبية المثبطة محدودة السكان. هذه التقنية تسمح لرسم الخرائط والتحليل الكمي واسعة النطاق للدوائر المحلية متشابك من الخلايا العصبية المثبطة محددة القشرية.

رسم الدوائر العصبية المثبطة بواسطة المسح الضوئي ليزر ضوئي

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

mapping-inhibitory-neuronal-circuits-laser-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Views.  University of California, Irvine. تقدم هذه الورقة مقاربة الجمع بين المسح الضوئي ليزر ضوئي مع تسجيلات خلية كاملة في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن GFP في الخلايا العصبية المثبطة محدودة السكان. هذه التقنية تسمح لرسم الخرائط والتحليل الكمي واسعة النطاق للدوائر المحلية متشابك من الخلايا العصبية ال...

Video: Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

الليزر مسح ضوئي للدوائر الدماغ الأمامي المستهدفة Optogenetically

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

التصميم ومعالجة السطوح، التصفيحات الخلوية، والتثقيف من وحدات الشبكات العصبية تتكون من الدوائر وظيفيا بين اتصال

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

ريويرينغ الخلايا العصبية: طريقة جديدة للتوسع نيوريت سريع والوظيفي اتصال الخلايا العصبية

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

التحفيز الكهربائي Transcranial المزمن وتسجيل إينتراكورتيكال في الفئران

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

أوبتوجينيتيك الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال في التصرف الفئران

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.