1. בידוד של PBMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקיז דם (7.5-8.0 מ&quot;ל) לתוך Tube Vacutainer BD CPT תא הכנה עם הפרין סודיום. הצינור מכיל נתרן קרישה הפרין ו נוזל Ficoll-Hypaque צפיפות, בתוספת ג&#39;ל פוליאסטר המחסום, המפריד בין שני נוזלים. צנטריפוגה שפופרת / דם מדגם בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) של הרוטור אופקי (נדנדה-out ראש) במשך 20 דקות ב 1800 x גרם. החלף צנטריפוגות את הבלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, את רצף השכבות מתרחשת כדלקמן (ראה מלמעלה למטה): א) פלזמה - ב) בתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) וטסיות - ג) פתרון צפיפות - ד) ג&#39;ל פוליאסטר - ה) גרנולוציטים - ו) כדוריות דם אדומות (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף שבריר של שכבת פלזמה, עוזב 5-10 מ&quot;מ של פלזמה מעל שלבי הביניים מבלי להפריע את שכבת התאים. פלזמה יכולה לשמש תרבות (סעיף 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר שבר מועשר (PBMC) בשעה שלבי הביניים עם טפטפת והעברת צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את PBMC עם 10 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS), על ידי צינור היפוך 5 פעמים, ולאחר מכן צנטריפוגות 5 דקות ב 400 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים כביסה פעמיים, ולאחר מכן resuspend גלולה תא 5 מ&quot;ל של PBS. קבע את מספר התא. בדרך כלל 1.3 x10 6 תאים התאושש 1 מ&quot;ל של דם מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תדירות הפנוטיפ של תאים T γδ ב PBMC ידי cytometry זרימה (סעיף 3) (איור 2). </li></ol> 2. הרחבת γδ ותאי T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיות תא 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל במשך 5 דק &#39;ב 400 x g בטמפרטורת החדר, וזורקים supernatants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבות (CM) על ידי הוספת IL-2 האנושי (IL-2) ו zoledronate (Zometa) לריכוזים האחרון של 1000 IU / מ&quot;ל ​​ו - 5 מיקרומטר, בהתאמה. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) או OpTmizer (Invitrogen) תמיכה בתקשורת הרחבה טובה של γδ ותאי T (מידע נוסף הפניות 6 ו - 9). Zometa מסופק בצורת נוזל (4 בקבוקון mg/5-ml). כדי להכין פתרון 5 מיקרומטר, הוסף 50 μl של Zometa עד 30 מ&quot;ל של מדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה במדיום תרבות להסתגל 1x10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 1 מ&quot;ל של CM המכיל 1x10 6 תאים לתוך הבאר כל צלחת 24 באר. עבור בקנה מידה גדול תרבויות, תאים יכולים להיות seeded ב 0.5 x 10 6 תאים / 2 ס&quot;מ על פי שטח פנים של בארות צלחת, צלחת או בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פלזמה עצמיים (סעיף 1.3), אספו אדם א.ב. סרה, או FCS כך הוא כ 10% מנפח של התרבות (100 μl גם עבור כל צלחת 24 באר). מניחים את הלוחות humidified 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על תרבות בצפיפות תא של 0.5-2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. הוסף בינוני טרי המכיל IL-2 אנושי (1000 IU / ml) בלבד (ללא Zometa) כל 2-3 ימים, העברת תאים בתרבית לתוך בארות חדשות או צלוחיות לפי הצורך, בהתאם למידת התפשטות תאים (איור 3). אספקת פלזמה או בסרום עד בינוני, כך ריכוז בסרום יכול להישמר לפחות 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים ביום 12-14 ולקבוע את תדירות, פנוטיפ, פונקציות של תאים T γδ ידי cytometry זרימה (ראה להלן). </li></ol> 3. ניתוח פנוטיפי על ידי זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 200 דגימות μl המכיל 2 x 10 5 תאים מיון הקרינה המופעל תאים (FACS) צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל PBS קר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x גרם. ואז, resuspend את כדורי במאגר FACS 50 μl (PBS + 1% אזיד הנתרן FCS + 0.1%). הוסף 5 μl של נוגדנים לכל דגימות (נוגדנים חד שבטיים מפורטים טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הקרח בחושך במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ 2 מ&quot;ל FACS לטעום כל, ולאחר מכן מערבולת. צנטריפוגה דגימות דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C. בזהירות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חיץ 300 FACS מערבולת μl ו. ניתוח דגימות על cytometer זרימה (איור 2). </li></ol> 4. IFN-γ ייצור assay 10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני assay, להכין ממריץ תאים על ידי 3-5 culturing x10 5 תאים Daudi / מ&quot;ל במדיום 1640 RPMI FCS בתוספת 10% (RPMI-10) לילה עם Zometa (5 מיקרומטר) (להלן המיועד Z-Daudi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף Z-Daudi ו resuspend ב RPMI-10 ב 2x10 6 תאים / מ&quot;ל. הוסף 100 μl של Z-Daudi (2x10 5) היטב כל צלחת סביב תחתית 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בתאי T γδ ב 2x10 6 תאים / מ&quot;ל RPMI-10 המכיל Brefeldin ב 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל. העברת 100 μl של השעיה T γδ תא (2x10 5) זה Z-Daudi התאים היטב המכיל או לשלוט בארות (100 μl של RPMI-10 בלבד, או RPMI-10 עם 20 ng / ml של phorbol 12-13-myristate אצטט[PMA] פלוס 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של ionomycin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C ו resuspend את כדורי ב μl 200 של קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות צינורות FACS. הוסף 4 מ&quot;ל של קר PBS ו צנטריפוגות צינורות דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי ב 50 μl של חיץ FACS עם FITC-מצומדות אנטי TCRVγ9 (5 μl) ו PE/Cy5-conjugated אנטי CD3 מב (2.5 μl). דגירה מוגן מפני אור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של מגיב IntraPrep 1 ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 4 מ&quot;ל של PBS על צינור כל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x g בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שאיפה ולהוסיף 100 μl של 2 מגיב IntraPrep. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של PE-מצומדות אנטי IFN-γ מב אל המבחנה. דגירה מוגן מפני אור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של PBS על צינור כל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x g בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ידי השאיפה ואת resuspend התא גלולה ב 0.5 מ&quot;ל של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים על ידי זרימה cytometer. שער על CD3 + + TCRVγ9 תאים לבחון את הביטוי של IFN-γ (איור 4). </li></ol> 5. נציג תוצאות: חשוב לקבוע את אחוז בתאי T γδ ב PBMC ב חניכה של התרבות. כפי שמוצג באיור. 2 אחוז CD3 + + TCRVγ9 γδ בתאי T ב PBMC היה 1.6% ביום 0. האוכלוסיות היו דומיננטיים CD27 + + CD45RA נאיבי או CD27 + CD45RA - פנוטיפים הזיכרון המרכזי. כאשר γδ בתאי T היו מגורה בצורה יעילה, הם יצרו צבירים בימים 3-5 (איור 3 A ו-B). כאשר היווצרות אשכול התעכבה, את הצמיחה של תאים מסוגים אחרים, כגון CD4 + או CD8 + αβ בתאי T או תאים NK יכול להשתלט על הצמיחה של γδ ותאי T (איור 3 C ו-D). לאחר 14 ימים של תרבות, תדירות γδ בתאי T עלה ל 93.8% יותר מאשר של תאים בתרבית γδ תרבויות מוצלח תא T (איור 2 E). תאים בתרבית T γδ NKG2D שהוגברו ו CD69 הביטוי (איור 2 G ו-H). הם מוצגים CD27 - CD45RA - פנוטיפ זיכרון מפעיל (איור 2 F). הפונקציות של γδ בתאי T הוערכו לגבי ייצור ציטוקינים ו cytotoxicity. IFN-γ תאיים מכתים הוכיח כי γδ המיוצר בתאי T IFN-γ בתגובה PMA / ionomycin טיפול או Z-Daudi תאים IPP שנצבר לאחר הטיפול zoledronate (איור 4). תוצאות אלו מצביעות כי zoledronate ביעילות לעורר ולהרחיב פונקציונלי בתאי T γδ. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שפופרת </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> עכבר IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> עכבר IgG1 </td><td> עכבר IgG1 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. נוגדנים חד שבטיים משמשים מכתים ססגוניות של תאים T γδ. דוגמה לניתוח פנוטיפי של תאים T γδ שבוצעו במעבדה שלנו מוצג באיור. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. ההפרדה של PBMC. דם (7.5-8.0 מ&quot;ל) נשאבים לתוך Tube Vacutainer BD CPT תא הכנה עם הפרין סודיום ו centrifuged ישירות עבור 20 דקות ב 1800 x גרם. לאחר צנטריפוגה, שכבות וכתוצאה מכך כפי שניתן לראות מלמעלה בוttom: א) פלזמה - ב) PBMC וטסיות - ג) פתרון צפיפות - ד) ג&#39;ל פוליאסטר - ה) גרנולוציטים - ו) כדוריות דם אדומות. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. פנוטיפ אופייני משטח של תאים T γδ. PBMC היו מגורה עם zoledronate ו IL-2 למשך 14 יום. תאים הוכתמו FITC שכותרתו אנטי TCR Vγ9 ו PE/Cy5-labeled אנטי CD3 לפקח על התרחבות γδ ותאי T (A ו-E). γδ בתאי T זוהו על ידי הביטוי שלהם TCRVγ9, והבעתם של CD27 ו CD45RA (B ו-F), NKG2D (C ו-G), או CD69 (D ו-H) נבדק. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. נציג γδ תרבויות T התא. PBMC היו מגורה עם IL-2 (1,000 IU / ml) ו zoledronate (5 מיקרומטר). שדות נציג מוצגים (IX71 מיקרוסקופ הפוך [אולימפוס] X 200). אשכולות של אגרגטים γδ בתאי T ניתן לצפות ביום 3 (א) יום 5 (ב), כאשר γδ בתאי T הורחבו בהצלחה. לעומת זאת, לא אשכולות או אגרגטים נצפו כאשר γδ T צמיחת תאים לא היה מספיק (C ו-D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. IFN-γ הייצור. γδ בתאי T הודגרו עם RPMI-10 בלבד (A) או PMA / ionomycin (ב) או Z-Daudi (C) עבור 4 שעות. ראשית, הבעת הפנים של TCRVγ9 היה מוכתם ואז IFN-γ הייצור נבדק ע&quot;י IFN γ-תאיים מכתים. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. קינטיקה של התרבות T γδ התא. (א) מספר מוחלט של תאים בתרבית, (B) אחוז γδ בתאי T, ו - (ג) המספר המוחלט של תאים T γδ בנקודות הזמן שצוין.

<ol>
	<li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;+T+cell+effector+functions:+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity.">&#947; T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li><li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+(E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+&#947;&#948;+T+cells+in+Escherichia+coli.">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human &#947;&#948; T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li><li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+cell+receptor+&#947;&#948;+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells.">Human T cell receptor &#947;&#948; cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li><li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology.">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li><li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP/DMAPP.">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li><li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+&#947;&#948;+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo.">Induction of &#947;&#948; T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+&#947;&#948;+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy.">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional &#947;&#948; T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li><li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate,+a+potent+stimulator+of+human+&#947;&#948;+T+cells.">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human &#947;&#948; T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li><li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+&#947;&#948;+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma:+a+pilot+study.">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using &#947;&#948; T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li><li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+antigen-specific+CD8+T+cells:+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection.">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li><li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy.">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li><li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V&#947;9+&#947;&#948;T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma.">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated V&#947;9 &#947;&#948;T-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li><li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+&#947;&#948;+T+cells.">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous &#947;&#948; T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת התפשטות יעילה של תאים T γδ מ PBMC. γδ שתאי T מופעלים והרחיב על ידי zoledronate ו IL-2 לפתח פונקציות מפעיל מלאה, שהתבטאה ייצור ציטוקינים ו cytotoxicity. זה כבר דווח כי pyrophosphate סינתטי phosphoantigens bromohydrin (BrHPP) ו 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP) להרחיב גם בתאי T γδ, אולם הם אינם זמ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> נוברטיס פארמה ק K </td><td></td><td> zoledronate </td></tr><tr><td> PROLEUKIN </td><td> נוברטיס פארמה </td><td></td><td> IL-2 רקומביננטי אנושי </td></tr><tr><td> BD Vacutainer הכנה CPT Cell Tube עם הפרין סודיום </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203 בינוני </td><td> Cell מדע וטכנולוגיה מכון </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> brefeldin </td><td> סיגמא </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) </td><td> סיגמא </td><td> P1585-1mg </td><td></td></tr><tr><td> ionomycin </td><td> סיגמא </td><td> 13909-1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD3-FITC או PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD4-ECD </td><td> Beckman קולטר </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD8-PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD14-PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD19-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD45-ECD </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD56-PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי TCRαβ-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי TCR Vγ9-FITC </td><td> Beckman קולטר </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD27-PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD45RA-ECD </td><td> Beckman קולטר </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי NKG2D-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNγ-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> עכבר IgG1 אלוטיפ לשלוט-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר IgG1 אלוטיפ שליטה ECD או PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

expansion of human peripheral blood  &gamma;&delta; t cells using zoledronate

אדם בתאי T γδ יכול לזהות ולהגיב למגוון רחב של מתח המושרה אנטיגנים, ובכך לפתח מולדת פעילות אנטי סרטניים זיהומיות אנטי רחבה. 1 רוב בתאי T γδ בדם ההיקפי יש קולטן Vγ9Vδ2 T התא. תאים אלה מזהים אנטיגן באופן מרכזי histocompatibility מורכב עצמאית ולפתח פונקציות חזקה מפעיל cytolytic ו-Th1 כמו 1. לכן, γδ ותאי T הם תאים למועמד אטרקטיבי עבור מפעיל חיסוני סרטן. Vγ9Vδ2 שתאי T מגיבים phosphoantigens כגון (E)-4-hydroxy-3-methyl-אבל-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), אשר מסונתז חיידקים דרך ביוסינתזה isoprenoid; 2 ו pyrophosphate isopentenyl (IPP), אשר מופק בתאים אוקריוטים דרך מסלול mevalonate. 3 במצב פיזיולוגי, הדור של IPP בתא nontransformed אינו מספיק להפעלת בתאי T γδ. Dysregulation של מסלול mevalonate בתאי גידול מוביל הצטברות של IPP ו γδ הפעלה T לתאים. 3 מאחר aminobisphosphonates (כגון pamidronate או zoledronate) לעכב synthase pyrophosphate farnesyl (FPPS), האנזים הפועל במורד הזרם של IPP במסלול mevalonate, רמות תאיים של IPP ו sensitibity להכרה תאים γδ T ניתן להגדיל על ידי aminobisphosphonates טיפולית. IPP הצטברות הוא פחות יעיל בתאים nontransfomred מאשר תאים סרטניים עם ריכוז רלוונטי פרמקולוגית של aminobisphosphonates, המאפשרים לנו אימונותרפיה של סרטן על ידי הפעלת בתאי T γδ עם aminobisphosphonates. 4 מעניין, IPP מצטבר מונוציטים כאשר PBMC מטופלים aminobisphosphonates, בגלל יעיל ספיגת התרופה על ידי תאים אלו. 5 מונוציטים שמצטברים להיות IPP-הצגת אנטיגן תאים לעורר Vγ9Vδ2 בתאי T בדם ההיקפי. 6 בהתבסס על מנגנונים אלה, אנו פיתח טכניקה להרחבת בקנה מידה גדול של תרבויות γδ T התא באמצעות zoledronate ו interleukin -2 (IL-2). 7 שיטות אחרות להרחבת γδ בתאי T לנצל את pyrophosphate bromohydrin סינתטי phosphoantigens (BrHPP) 8 או 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP). 9 כל השיטות האלה מאפשרות לשעבר הרחבת vivo, וכתוצאה מכך מספר גדול של תאים T γδ לשימוש חיסוני המאמצת. עם זאת, רק zoledronate הוא מגיב זמינים מסחרית ה-FDA. Zoledronate-מורחבת γδ בתאי T להציג CD27 - CD45RA - פנוטיפ זיכרון מפעיל והתפקוד שלהם ניתן להעריך על ידי IFN-γ assay הייצור 7.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Human Peripheral Blood  Î³Î´ T Cells using Zoledronate at JoVE.com

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

שיטה להרחיב בתאי T γδ מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC) מתואר. PBMC שמקורם בתאי T γδ הם מגורה והרחיב באמצעות zoledronate ו אינטרלויקין -2 (IL-2). הרחבת בקנה מידה גדול של γδ בתאי T יכול להיות מיושם על חיסוני הסלולר עצמיים של סרטן.

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

expansion-of-human-peripheral-blood-t-cells-using-zoledronate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

26.4K Views.  University of Tokyo Hospital. שיטה להרחיב בתאי T γδ מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC) מתואר. PBMC שמקורם בתאי T γδ הם מגורה והרחיב באמצעות zoledronate ו אינטרלויקין -2 (IL-2). הרחבת בקנה מידה גדול של γδ בתאי T יכול להיות מיושם על חיסוני הסלולר עצמיים של סרטן.

Video: Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical testing, and cell-based therapies. In this study, a simple, novel protocol to isolate, activate, and expand T cells from PBMCs ex vivo is presented. This study utilizes functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology to isolate and activate T cells. Briefly, the protocol involves the positive selection of CD3+ cells from leukopak-derived PBMCs, followed by a 48 h co-stimulation with pre-conjugated anti-CD28-bound streptavidin microbubbles (SAMBs) prior to transduction in 24-well plates. Functionalized microbubbles offer a unique opportunity to buoyantly activate cells, leading to proliferative phenotypes that allow for expansion with minimal exhaustion. This technique offers reduced exhaustion because the co-stimulatory microbubbles remain buoyant and return to the top of the culture medium, thus reducing the amount of time that the expanding cells are in contact with the co-stimulatory factors. The results indicate that the isolated and cultured T cells receive enough stimulation to activate and proliferate but not to an extent that leads to overactivation, which then leads to exhaustion, as demonstrated by the presence of excessive PD-1.

The objective of this study is to demonstrate the feasibility of flotation-based separation to isolate, activate, and expand primary human T cells.

בידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מבוססי ציפה מדגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות מיקרו-בועות

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

הבחנה של אוסטאוקלסטים פונקציונליים ממונוציטים של דם היקפי אנושי CD14+

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

איסוף PBMC ואחסון Cryostorage לניתוח ביואנרגטיקה מיטוכונדריאלית

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases and aging. Oxidative phosphorylation plays a decisive role, as it is crucial for the maintenance of energetic homeostasis. PBMCs have been identified as a minimally invasive sample to measure mitochondrial function and have been shown to reflect disease conditions. However, measurement of mitochondrial bioenergetic function can be limited by several factors in human samples. Limitations are the amount of samples taken, sampling time, which is often spread over several days, and locations. Cryopreservation of the collected samples can ensure consistent collection and measurement of samples. Care should be taken to ensure that the parameters measured are comparable between cryopreserved and freshly prepared cells. Here, we describe methods for isolating and cryopreserving PBMCs from human blood samples to analyze the bioenergetic function of the mitochondria in these cells. PBMC cryopreserved according to the protocol described here show only minor differences in cell number and viability, adenosine triphosphate levels, and measured respiratory chain activity compared with freshly harvested cells. Only 8-24 mL of human blood is needed for the described preparations, making it possible to collect samples during clinical studies multicentrally and determine their bioenergetics on site.

מחבר זרקור: שימור פרמטרים ביואנרגטיים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים לאחר שימור בהקפאה 

Isolated peripheral blood mononuclear cells can be used for the analysis of immune functions and disorders, metabolic diseases, or mitochondrial functions. In this work, we describe a standardized method for the preparation of PBMCs from whole blood and the subsequent cryopreservation. Cryopreservation makes this time and place independent.

שימור קריוגני והערכה ביואנרגטית של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases ...