1. عزلة PBMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الدم (7،5-8،0 مل) في أنبوب دينار بحريني CPT Vacutainer إعداد الخلية مع هيبارين الصوديوم. أنبوب يحتوي على تخثر هيبارين الصوديوم والسوائل كثافة Ficoll - Hypaque ، بالإضافة إلى حاجز هلام البوليستر ، والذي يفصل بين السوائل اثنين. أنبوب الطرد المركزي / عينة الدم في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية) في الدوار الأفقي (سوينغ التدريجي الرأس) لمدة 20 دقيقة في ز س 1800. الطرد المركزي التبديل قبالة الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، وتسلسل طبقات يحدث على النحو التالي (ينظر من الأعلى إلى الأسفل) : البلازما) -- ب) الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) والصفائح الدموية -- ج) حل الكثافة -- د) هلام البوليستر -- ه) المحببة -- و) خلايا الدم الحمراء (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع جزء من طبقة البلازما ، وترك 5-10 ملم من البلازما فوق الطور البيني من دون إزعاج طبقة الخلايا. يمكن استخدام البلازما للثقافة (القسم 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الكسر المخصب (PBMC) في الطور البيني مع ماصة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل PBMC مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، عن طريق أنبوب للقلب 5 مرات ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق ثم في ز س 400. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من الغسيل مرتين ، ثم resuspend الكرية خلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني. تحديد عدد الخلايا. وعادة ما يتم استرداد 1.3 X10 6 خلايا من 1 مل من الدم الكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد وتيرة والنمط الظاهري من خلايا تي في γδ PBMC بواسطة التدفق الخلوي (القسم 3) (الشكل 2). </li></ol> 2. توسيع الخلايا التائية γδ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في أنابيب مخروطية 15 مل لمدة 5 دقائق في ز × 400 في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل supernatants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مستنبت (CM) وذلك بإضافة IL - 2 الإنسان (IL - 2) وzoledronate (Zometa) لتركيزات النهائي من 1000 وحدة دولية / مل و 5 ميكرومتر ، على التوالي. ALyS203 (علم الخلية ومعهد التكنولوجيا) أو OpTmizer (Invitrogen) وسائل الإعلام دعم التوسع جيدة من الخلايا التائية γδ (مزيد من المعلومات في المراجع 6 و 9). وتقدم Zometa في شكل سائل (4 mg/5-ml فيال). لإعداد حل ميكرومتر 5 ، إضافة ميكرولتر من 50 إلى 30 مل Zometa متوسطة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلية بيليه في المتوسط ​​الثقافة والتكيف مع الخلايا 1x10 6 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 1 مل من CM تحتوي 1x10 6 خلايا في كل بئر من لوحة ال 24 أيضا. على نطاق واسع الثقافات ، يمكن خلايا المصنف عند 0.5 X الخلايا 6 10 / سم 2 وفقا للمناطق الآبار السطحية للصفيحة ، صحن ، أو قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البلازما ذاتي (القسم 1.3) ، المجمعة الأمصال البشرية AB ، أو FCS بحيث يكون حوالي 10 ٪ من حجم ثقافة (100 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 24 أيضا). وضع لوحات في ترطيب 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 حاضنة لل24-48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الثقافة في مناطق ذات كثافة خلية من 0،5-2 × 10 6 خلية / مل. إضافة المتوسطة الطازجة تحتوي IL - 2 الإنسان (1000 وحدة دولية / مل) فقط (دون Zometa) كل 2-3 أيام ، ونقل الخلايا المستزرعة في آبار جديدة أو القوارير ، حسب الاقتضاء ، وفقا لدرجة من تكاثر الخلايا (الشكل 3). العرض البلازما أو مصل في المتوسط ​​حتى يمكن الحفاظ على تركيز المصل لا يقل عن 1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا حصاد يوم 14/12 ، وتحديد وتيرة والنمط الظاهري ، ووظائف الخلايا التائية التي γδ التدفق الخلوي (أنظر أدناه). </li></ol> 3. المظهري تحليل التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 200 عينة تحتوي على ميكرولتر 2 × 10 5 الخلايا لفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز س 400. ثم ، resuspend الكريات العازلة في 50 ميكرولتر FACS (PBS + 1 ٪ FCS أزيد الصوديوم + 0.1 ٪). إضافة 5 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة للعينات (يتم سرد الاجسام المضادة في الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 العازلة FACS مل لكل عينة ، ومن ثم الدوامة. عينات من أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز س 400 في 4 درجات مئوية. صب بعناية طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر FACS العازلة والدوامة. تحليل العينات على تدفق عداد الكريات (الشكل 2). </li></ol> 4. الإنترفيرون γ مقايسة إنتاج 10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من الفحص ، وإعداد الخلايا مشجعا بواسطة زراعة الخلايا 3-5 X10 داودي 5 / مل في المتوسط ​​1640 RPMI FCS زائد 10 ٪ (RPMI - 10) بين عشية وضحاها مع Zometa (5 ميكرومتر) (Z - المعينة الآخرة دودي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع Z - داودي وresuspend في RPMI - 10 في الخلايا 2x10 6 / مل. إضافة ميكرولتر من 100 Z - داودي (2x10 5) إلى كل بئر من لوحة الجولة القاع 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الخلايا التائية γδ في الخلايا 2x10 6 / مل في RPMI - 10 التي تحتوي على 20 ألف Brefeldin ميكروغرام / مل. نقل 100 ميكرولتر من γδ تعليق الخلايا التائية (2x10 5) إلى كل الخلايا التي تحتوي على Z - داودي جيدا أو للسيطرة على آبار (100 ميكرولتر من RPMI - 10 فقط ، أو RPMI - 10 مع 20 نانوغرام / مل من phorbol 12 - 13 - myristate خلات[PMA] بالإضافة إلى 2 ميكروغرام / مل من ionomycin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 400 درجة مئوية في 4 و resuspend الكريات في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى أنابيب FACS. إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني الباردة وأنابيب أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز س 400 في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكريات في 50 ميكرولتر من FACS العازلة مع FITC - مترافق TCRVγ9 المضادة (5 ميكرولتر) وPE/Cy5-conjugated مكافحة CD3 خريطة موقع (2.5 ميكرولتر). احتضان محمية من الضوء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من كاشف IntraPrep 1 واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 4 مل من كل أنبوب إلى برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 400 في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بواسطة الطموح وإضافة 100 ميكرولتر من 2 كاشف IntraPrep. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون أن تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من PE - مترافق مكافحة IFN - γ خريطة موقع في أنبوب اختبار. احتضان محمية من الضوء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من كل أنبوب إلى برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 400 في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف بواسطة الطموح وresuspend الكرية خلية في 0.5 مل من FACS العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الخلايا عن طريق تدفق عداد الكريات. بوابة على خلايا + + CD3 TCRVγ9 ودراسة التعبير عن الإنترفيرون γ (الشكل 4). </li></ol> 5. ممثل النتائج : من المهم تحديد نسبة الخلايا التائية γδ في PBMC في الشروع في الثقافة. كما هو مبين في الشكل. 2 ألف ، نسبة TCRVγ9 + + CD3 كان γδ خلايا T في PBMC 1.6 ٪ في اليوم 0. وكان السكان المهيمن CD27 + + CD45RA ساذج أو CD27 CD45RA + -- الظواهر الذاكرة المركزية. تشكلت عندما كانت حفز بكفاءة γδ الخلايا التائية ، والتكتلات في أيام 3-5 (الشكل رقم 3 ألف وباء). عندما تأخر تشكيل كتلة ، ونمو أنواع الخلايا الأخرى ، مثل خلايا CD4 + أو + CD8 αβ خلايا تي أو الخلايا القاتلة الطبيعية ويمكن السيطرة على نمو الخلايا التائية γδ (الشكل 3 C و D). بعد 14 يوما من الثقافة ، وزيادة وتيرة الخلايا التائية γδ إلى أكثر من 93.8 ٪ من الخلايا المستزرعة في نجاح γδ الثقافات الخلايا التائية (الشكل 2 E). المثقف الخلايا التائية γδ NKG2D upregulated وCD69 التعبير (الشكل 2 G و H). عرضها CD27 -- CD45RA -- المستجيب النمط الظاهري الذاكرة (الشكل 2 F). تم تقييم وظائف الخلايا التائية γδ فيما يتعلق بالإنتاج وخلوى السمسة. والإنترفيرون γ الخلايا تلطيخ أثبتت أن تنتج الخلايا التائية γδ الإنترفيرون γ استجابة لسلطة النقد الفلسطينية / ionomycin المعاملة أو خلايا Z - IPP داودي التي تراكمت بعد العلاج zoledronate (الشكل 4). هذه النتائج تشير إلى أن zoledronate يمكن أن يحفز الكفاءة الوظيفية وتوسيع الخلايا التائية γδ. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> أنبوب </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> تنمية الطفولة المبكرة </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> الماوس IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> الماوس IgG1 </td><td> الماوس IgG1 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الاجسام المضادة المستخدمة في تلوين متعدد الألوان من الخلايا التائية γδ. ويرد مثال للتحليل المظهري من الخلايا التائية γδ أجريت في مختبر لدينا في الشكل. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. فصل PBMC. ويوجه الدم (7،5-8،0 مل) في أنبوب دينار بحريني CPT Vacutainer إعداد الخلية مع هيبارين الصوديوم وطرد مباشرة لمدة 20 دقيقة في ز س 1800. بعد الطرد المركزي ، مما أدى إلى طبقات كما رأينا من أعلى إلى بوttom : أ بلازما) -- ب) والصفائح الدموية PBMC -- حل الكثافة ج) -- د) هلام بوليستر -- ه) المحببة -- و) خلايا الدم الحمراء. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. نموذجي النمط الظاهري سطح الخلايا التائية γδ. وقد حفزت PBMC مع zoledronate وIL - 2 لمدة 14 يوما. تم صبغ الخلايا مع FITC ذات العلامات المضادة للTCR Vγ9 وPE/Cy5-labeled مكافحة CD3 لرصد التوسع في الخلايا التائية γδ (A و E). وقد تم تحديد الخلايا التائية التي γδ التعبير عنها من TCRVγ9 ، ودرست خلاله التعبير عنها من وCD45RA CD27 (B و F) ، NKG2D (C و G) ، أو CD69 (D و H). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. الممثل الخلايا التائية γδ الثقافات. وقد حفزت PBMC مع IL - 2 (1000 وحدة دولية / مل) ، وzoledronate (5 ميكرون). تظهر حقول ممثل (IX71 المجهر المقلوب [أوليمبوس] × 200). ويمكن ملاحظة التكتلات والتجمعات من الخلايا التائية γδ يوم 3 (أ) ويوم 5 (باء) ، عندما تم بنجاح موسع γδ خلايا تي. في المقابل ، لم يلاحظ أي كتل أو مجاميع عندما γδ نمو الخلايا التائية لم تكن كافية (C و D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. الإنترفيرون γ الإنتاج. وحضنت γδ خلايا T - 10 مع RPMI فقط (أ) أو سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin (B) أو Z - داودي (C) لمدة 4 ساعة. الأولى ، كانت ملطخة التعبير سطح TCRVγ9 ثم الإنترفيرون γ. تم فحص الانتاج داخل الخلايا الإنترفيرون γ تلطيخ <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="الشكل 5"/> الشكل 5. حركية γδ الثقافة الخلايا التائية. (أ) العدد المطلق للخلايا المستزرعة ، (ب) النسبة المئوية للخلايا T γδ ، و (ج) العدد المطلق للخلايا T γδ في النقاط الزمنية المشار إليها.

<ol>
	<li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;+T+cell+effector+functions:+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity.">&#947; T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li><li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+(E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+&#947;&#948;+T+cells+in+Escherichia+coli.">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human &#947;&#948; T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li><li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+cell+receptor+&#947;&#948;+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells.">Human T cell receptor &#947;&#948; cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li><li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology.">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li><li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP/DMAPP.">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li><li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+&#947;&#948;+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo.">Induction of &#947;&#948; T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+&#947;&#948;+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy.">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional &#947;&#948; T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li><li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate,+a+potent+stimulator+of+human+&#947;&#948;+T+cells.">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human &#947;&#948; T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li><li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+&#947;&#948;+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma:+a+pilot+study.">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using &#947;&#948; T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li><li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+antigen-specific+CD8+T+cells:+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection.">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li><li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy.">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li><li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V&#947;9+&#947;&#948;T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma.">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated V&#947;9 &#947;&#948;T-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li><li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+&#947;&#948;+T+cells.">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous &#947;&#948; T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الطريقة المعروضة هنا يمكن التوسع كفاءة الخلايا التائية γδ من PBMC. γδ تنشيط خلايا تي وتوسعت بنسبة zoledronate IL - 2 وتطوير وظائف المستجيب كاملة ، والتي تعكسها والإنتاج خلوى السمسة. وقد أفيد أن bromohydrin phosphoantigens الاصطناعية بيروفوسفات (BrHPP) و 2 ميثيل - 3 - butenyl - 1 - بيروفوسفات (2M3B1PP) أيض?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> نوفارتيس فارما K. K </td><td></td><td> zoledronate </td></tr><tr><td> PROLEUKIN </td><td> نوفارتس للادوية </td><td></td><td> المؤتلف الإنسان IL - 2 </td></tr><tr><td> دينار بحريني خلية CPT Vacutainer أنبوب التحضير مع هيبارين الصوديوم </td><td> دينار بحريني </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203 المتوسطة </td><td> علم الخلية ومعهد التكنولوجيا </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> brefeldin A </td><td> سيغما </td><td> B5936 - 200UL </td><td></td></tr><tr><td> phorbol 12 - 13 - myristate خلات (PMA) </td><td> سيغما </td><td> P1585 - 1MG </td><td></td></tr><tr><td> ionomycin </td><td> سيغما </td><td> 13909 - 1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD3 - FITC أو PE/Cy5 </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD4 - ECD </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD8-PE/Cy5 </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD14-PE/Cy5 </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD19 - PE </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD45 - ECD </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD56-PE/Cy5 </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان TCRαβ - PE </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان Vγ9 TCR - FITC </td><td> بيكمان كولتر </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD27-PE/Cy5 </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة CD45RA الإنسان ، تنمية الطفولة المبكرة </td><td> بيكمان كولتر </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان CD69 - PE </td><td> دينار بحريني </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان NKG2D - PE </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة humal IFNγ - PE </td><td> بيكمان كولتر </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> فأرة التحكم IgG1 isotype - PE </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> الماوس IgG1 isotype التحكم تنمية الطفولة المبكرة أو PE/Cy5 </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

expansion of human peripheral blood  &gamma;&delta; t cells using zoledronate

يمكن الإنسان γδ الخلايا التائية الاعتراف والاستجابة لطائفة واسعة من التوتر الناجم عن المستضدات ، وتطوير نشاط واسع وبالتالي الفطرية المضادة للورم ومكافحة العدوى. 1 غالبية الخلايا التائية γδ في الدم المحيطي لديها مستقبلات الخلايا التائية Vγ9Vδ2. هذه الخلايا الاعتراف المستضد بطريقة معقدة رئيسية مستقلة التوافق النسيجي وتطوير وظائف قوية والمستجيب لحل الخلايا مثل TH1 - 1 لذلك ، γδ الخلايا هي خلايا تي مرشحا جذابا المستجيب للعلاج مناعي السرطان. Vγ9Vδ2 خلايا تي الاستجابة لphosphoantigens مثل (E) - 4 - 3 - هيدروكسي ميثيل لكن - 2 - enyl بيروفوسفات (HMBPP) ، الذي يتم تصنيعه في البكتيريا عبر isoprenoid الحيوي ؛ 2 و بيروفوسفات isopentenyl (IPP) ، والتي يتم إنتاجها في الخلايا حقيقية النواة من خلال مسار mevalonate. 3 في حالة فسيولوجية ، وتوليد IPP في الخلية nontransformed لا يكفي لتنشيط الخلايا T γδ. التقلبات في مسار mevalonate في الخلايا السرطانية يؤدي إلى تراكم IPP وتنشيط خلايا تي γδ 3 لأن aminobisphosphonates (مثل pamidronate أو zoledronate) تمنع farnesyl سينسيز بيروفوسفات (FPPS) ، انزيم يعمل المصب من IPP في مسار mevalonate ، ومستويات من الخلايا ويمكن IPP sensitibity إلى الاعتراف γδ زيادة الخلايا التائية التي aminobisphosphonates علاجيا. IPP تراكم أقل كفاءة في خلايا nontransfomred من الخلايا السرطانية مع التركيز عقاقيري ذات الصلة من aminobisphosphonates ، التي تسمح لنا العلاج المناعي للسرطان عن طريق تنشيط خلايا تي γδ مع aminobisphosphonates 4 المثير للاهتمام ، IPP يتراكم في حيدات عندما يتم التعامل مع PBMC aminobisphosphonates ، وذلك بسبب كفاءة امتصاص الدواء من قبل هذه الخلايا. 5 حيدات التي تتراكم تصبح IPP مستضد تقديم الخلايا ويحفز الخلايا التائية Vγ9Vδ2 في الدم المحيطي. 6 وبناء على هذه الآليات ، قمنا بتطوير تقنية لتوسيع نطاق واسع من الثقافات γδ باستخدام الخلايا التائية zoledronate وانترلوكين -2 (IL - 2). 7 طرق أخرى لتوسيع نطاق الاستفادة من الخلايا التائية γδ في bromohydrin phosphoantigens الاصطناعية بيروفوسفات (BrHPP) 8 أو 2 - 3 - الميثيل - butenyl - 1 - بيروفوسفات (2M3B1PP) 9 وجميع هذه الأساليب تسمح السابقين فيفو التوسع ، مما أدى إلى أعداد كبيرة من الخلايا التائية γδ لاستخدامها في العلاج المناعي بالتبني. ومع ذلك ، zoledronate الوحيد هو كاشف وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير متوفرة تجاريا. Zoledronate الموسع γδ الخلايا التائية عرض CD27 -- CD45RA -- المستجيب النمط الظاهري الذاكرة ويمكن تقييم وظيفتها بواسطة الإنترفيرون γ مقايسة الإنتاج 7.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Human Peripheral Blood  Î³Î´ T Cells using Zoledronate at JoVE.com

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

تم وصف طريقة لتوسيع الخلايا التائية γδ من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC). يتم تحفيز PBMC المستمدة من الخلايا التائية γδ وتوسيع استخدام zoledronate وانترلوكين 2 (IL - 2). ويمكن تطبيق توسيع نطاق كبير من الخلايا المناعية تي γδ لالخلوية ذاتي من السرطان.

التوسع في الدم المحيطي الإنسان خلايا T γδ باستخدام Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

expansion-of-human-peripheral-blood-t-cells-using-zoledronate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

26.4K Views.  University of Tokyo Hospital. تم وصف طريقة لتوسيع الخلايا التائية γδ من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC). يتم تحفيز PBMC المستمدة من الخلايا التائية γδ وتوسيع استخدام zoledronate وانترلوكين 2 (IL - 2). ويمكن تطبيق توسيع نطاق كبير من الخلايا المناعية تي γδ لالخلوية ذاتي من السرطان.

Video: Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

تقييم الواجهة متشابك لخلايا تي البشرية الأولية من الدم والأنسجة اللمفاوية

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical testing, and cell-based therapies. In this study, a simple, novel protocol to isolate, activate, and expand T cells from PBMCs ex vivo is presented. This study utilizes functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology to isolate and activate T cells. Briefly, the protocol involves the positive selection of CD3+ cells from leukopak-derived PBMCs, followed by a 48 h co-stimulation with pre-conjugated anti-CD28-bound streptavidin microbubbles (SAMBs) prior to transduction in 24-well plates. Functionalized microbubbles offer a unique opportunity to buoyantly activate cells, leading to proliferative phenotypes that allow for expansion with minimal exhaustion. This technique offers reduced exhaustion because the co-stimulatory microbubbles remain buoyant and return to the top of the culture medium, thus reducing the amount of time that the expanding cells are in contact with the co-stimulatory factors. The results indicate that the isolated and cultured T cells receive enough stimulation to activate and proliferate but not to an extent that leads to overactivation, which then leads to exhaustion, as demonstrated by the presence of excessive PD-1.

The objective of this study is to demonstrate the feasibility of flotation-based separation to isolate, activate, and expand primary human T cells.

عزل الخلايا التائية القائمة على التعويم وتنشيطها وتوسيعها من عينات خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية باستخدام الفقاعات الدقيقة

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

تمايز الخلايا العظمية الوظيفية من الخلايا الوحيدة CD14 + للدم المحيطي البشري

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

مجموعة PBMC والتخزين بالتبريد لتحليل الطاقة الحيوية للميتوكوندريا

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases and aging. Oxidative phosphorylation plays a decisive role, as it is crucial for the maintenance of energetic homeostasis. PBMCs have been identified as a minimally invasive sample to measure mitochondrial function and have been shown to reflect disease conditions. However, measurement of mitochondrial bioenergetic function can be limited by several factors in human samples. Limitations are the amount of samples taken, sampling time, which is often spread over several days, and locations. Cryopreservation of the collected samples can ensure consistent collection and measurement of samples. Care should be taken to ensure that the parameters measured are comparable between cryopreserved and freshly prepared cells. Here, we describe methods for isolating and cryopreserving PBMCs from human blood samples to analyze the bioenergetic function of the mitochondria in these cells. PBMC cryopreserved according to the protocol described here show only minor differences in cell number and viability, adenosine triphosphate levels, and measured respiratory chain activity compared with freshly harvested cells. Only 8-24 mL of human blood is needed for the described preparations, making it possible to collect samples during clinical studies multicentrally and determine their bioenergetics on site.

تسليط الضوء على المؤلف: الحفاظ على معلمات الطاقة الحيوية في خلايا الدم أحادية النواة المحيطية بعد الحفظ بالتبريد 

Isolated peripheral blood mononuclear cells can be used for the analysis of immune functions and disorders, metabolic diseases, or mitochondrial functions. In this work, we describe a standardized method for the preparation of PBMCs from whole blood and the subsequent cryopreservation. Cryopreservation makes this time and place independent.

الحفظ بالتبريد وتقييم الطاقة الحيوية لخلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases ...