אנו מודים קן איווטה (OSI Pharmaceuticals, ניו יורק, ארה&quot;ב) עבור ריאגנטים פרד מילר (ברברה אן Intitute Karmanos סרטן, דטרויט, ארה&quot;ב) על שורות תאים.

1. הכנת התמיסה methocel (500 מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי 6 גרם של methylcellulose בבקבוק 500 מ&quot;ל המכיל stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את methylcellulose ב 250 מ&quot;ל של DMEM/F12 שחומם מראש ללא בסרום (60 מעלות צלזיוס) במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 250 מ&quot;ל של DMEM/F12 (RT) המכילה סרום סוס 10%. מערבבים לילה (4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הפתרון על ידי צנטריפוגה (5000g, 2h, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פתרון צמיגה מאוד ברור צינור חדש (כ 90-95% של הפתרון המלאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 ° C עד השימוש. </li></ol> 2. Spheroid תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון methocel 20% (10 מ&quot;ל ו - 40 methocel צמיחה בינוני מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמיים עם PBS, להוסיף טריפסין 0.1% ותאי לדגור על 37 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בינוני צמיחה לספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה של 10 תאים לכל 000 מ&quot;ל ב methocel 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה תא 96 תחתית עגולה היטב suspension צלחות (100 μl לכל היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבדוק את היווצרות spheroid על צלחות ההשעיה. Spheroids יהיה מוכן לשימוש אחרי 1-3 ימים. </li></ol> 3. הכנה של קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן על הקרח פתרון של קולגן 8 מ&quot;ל, 1 מ&quot;ל PBS 10x, 1 מ&quot;ל 0.1 N NaOH ו - 3 טיפות 0.1 N HCl. בדוק אם ה-pH 7.4 ידי תצפית חלק מהפתרון על רצועות אינדיקטור pH. התאם את ה-pH אם מחוץ לטווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון קולגן לנטרל בבארות של צלחת 96 באר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C עד קולגן הוא ביסס (90 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן methocel-קולגן ליגנד פתרונות על הקרח: עבור כל חלק פיפטה 1 ליגנד של הפתרון קולגן. הוסף 20 ננוגרם לכל מ&quot;ל של קולגן TGF-β. לאחר דילול עם methocel ודיפוזיה על שכבות שונות, הריכוז הסופי של TGF-β יהיה 5 ng / ml מערבבים ידי vortexing. הוסף 1 חלק מהפתרון-methocel. מערבבים ידי vortexing. </li></ol> 4. Spheroid להטביעדינג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפ 200 μl אשר יש כ 5 מ&quot;מ של קצה לחתוך, על פיפטה 200 μl. תמצצי את אחד spheroid עם פיפטה ובזהירות לוותר על המדיום לתוך צלחת ריקה. צפה spheroid אם נשאר בתוך קצה. Spheroid נראה כנקודה לבנה. מבלי לשחרר את הבוכנה, להתחנף 100 תערובת μl קולגן methocel ולחלק spheroid בתערובת הקולגן לתוך מצופה קולגן-96 גם כן. עשו זאת במשך 12 spheroids לכל מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הקולגן לחזק לפחות 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בועות אוויר עם טיפ 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של המדיום עם סרום 1.6% ו מעכבי מומס DMSO. עבור SB-431542 להוסיף 4 μl של פתרון המניות (10 mM) ל 1 מ&quot;ל של מדיום. לאחר הקניה, את הריכוז הסופי של המעכב יהיה 10 מיקרומטר. TGF-β ו מעכבי יישאר את מהלך הניסוי. צלמו תמונות של spheroids תחת מיקרוסקופ באמצעות הגדלה 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48h של גירוי עם TGF-β ו / או מעכבי, לצלם spheroids תחת מיקרוסקופ באמצעות הגדלה 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את השטח של פולשים spheroids אחרי 2 ימים להחסיר את אזור ההתחלה. מדידת שטח של spheroid: פתח את התמונה מן spheroid ב-Adobe Photoshop Extended (דמות 2A) ובחר את הכלי בחירה מהירה (דמות 2B). מצביע העכבר משתנה לתוך מעגל עם &#39;פלוס&#39; (+) סימן (דמות 2C). בעוד גרירת הסמן מעל spheroid, Photoshop יכירו את גבולות spheroid. אם האזור שמחוץ spheroid נבחר, באזור זה ניתן לשלול מהרשימה על ידי לחיצה על מקש Alt או באמצעות כלי הבחירה השלילית אשר מסומנת על ידי - סימן בסרגל הכלים (). השינויים הסמן לתוך מעגל עם &#39;מינוס&#39; (-) לחתום על ידי גרירת הסמן מעל האזור הנבחר שלא בצדק, בתחום זה היא להסיר את הבחירה (דמות 2D). אם יש צורך, באזורים מרובים ניתן לבחור על ידי לחיצה על שכפתור IFT. כדי לעבוד בצורה מדויקת יותר, בגודל של מצביע העכבר יכול להיות מותאם על ידי שינוי קוטר המברשת בסרגל הכלים (2E דמות). כאשר spheroid כל נבחרת, אזור הבחירה מחושב דרך למדוד ניתוח בשורת התפריטים או על ידי לחיצה על Ctrl + Shift + M (דמות 2F). חלון ההקלטה מדידה יופיעו מראה את שם הקובץ ואת השטח של הבחירה בפיקסלים, כמו גם נתונים אחרים (דמות 2G). אם בחירות מרובות נמדדים, השורה הראשונה מציגה את הסכום של כל האזורים. המדידות של בחירות הפרט מוצגים קווי להלן. הנתונים של כל המדידות ניתן לייצא לקובץ טקסט ופתח ב-Excel. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמה של assay spheroid עם MCF10A1 (M1) בתאי אפיתל השד נורמלי, הפך H-RAS MCF10AneoT (M2) תאים M2-derived MCF10CA1a (M4) ניתנת באיור 3. תאים M1 הראו רק פלישה חלש ללאגירוי, אבל פלש באופן משמעותי יותר על ידי גירוי TGF-β. לעומת זאת, RAS-טרנספורמציה M1-M2 נגזרת פלשו כבר וביעילות ללא תוספת של גירויים, וזה היה גדל עוד יותר פי 4-5 על טיפול TGF-β. תאים M4 הראה את הפלישה החזק ביותר, עם או בלי תוספת TGF-β. בשלב הבא, בחנו אם נוכל להפריע הפלישה TGF-β-Induced במודל זה spheroid באמצעות מעכבי כימיים. לשם כך השתמשנו SB-431542, אנלוגי ו-ATP מעכב סלקטיבי של פעילות קינאז של TβRI, כמו גם סוג activin IB קולטן (ActRIB) ו activin קולטן כמו קינאז (ALK) 7 12. כצפוי, SB-431542 potently עכבות TGF-β-Induced הפלישה של M1, M2 ו M4 התאים (איור 4), המציין כי הפלישה TGF-β-Induced הוא TβRI-kinase תלויים. בנוסף, הפלישה הבסיס של spheroids היה גם מאוד עכבות, מה שמראה כי הפלישה הבסיס הוא גם דהתלוי על TGF-β. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" /> 1. תרשים זרימה תרשים של assay spheroid 3D. ראשית, התאים הלא מצופה תחת חסיד התנאים u בצורת צלחות השעיות. תאים aggregrate לתוך spheroids multcellular והוא יכול להיות מוטבע לתוך מטריצה ​​קולגן. למטריצה ​​זו קולגן, הם יכולים לפלוש. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" /> באיור 2. כימות שטח של spheroids באמצעות Adobe Photoshop Extended. (א) התמונה של spheroid הוא נפתח לבחירה Adobe Photoshop (ב) Extendend של הכלי בחירה מהירה (C) לגרור את הסמן מעל spheroid כדי לבחור את האזור של להסרת (ד) spheroid אזור כלול wongly באמצעות כלי Quick Selection שלילי (E) התאמת גודל המברשת של הכלי בחירה מהירה יותר מדויק לבחור את האזור (F) בחירה שלמדידה הפקודה להקלטה (G) דוגמה של רשומה המדידה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" /> באיור 3. TGF-β-Induced הפלישה spheroids של MCF10A1 הונצח באופן ספונטני (M1) (א), RAS-טרנספורמציה MCF10AneoT (M2 (B) נגזרת גרורתי שלה MCF10CA1a (M4) (ג). M1, M2 ו M4 spheroids מוטבע לתוך קולגן טופלו 5ng/ml של TGF-β עבור 48h כמצוין. AC תמונות נציג נלקחה ב יום הטבעה וכעבור יומיים. הפלישה D יחסית היה לכמת כהפרש באזור ביום יום מינוס 2 0. התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן מעובד מתוך 13. <img alt="איור 4 א" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" /> <img alt="תרשים 4 ב" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" /> איור 4. הפלישה spheroid הבסיס, TGF-β-Induced מעוכבת בy SB-431542. Spheroids M1, M2 ו M4 היו מוטבע קולגן שטופלו 5ng/ml TGF-β ו / או 10 מיקרומטר SB-431542, כמצוין. נציג תמונות שצולמו לאחר 2 ימים (א &#39;). הפלישה היתה יחסית לכמת כהפרש שטח ביום יום מינוס 2 0 (B). התוצאות הן כפי שבאה לידי ביטוי ממוצע ± סטיית תקן מעובד מתוך 13.

<ol>
	<li>Akhurst, R. J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling+in+cancer--a+double-edged+sword.">TGF-&#946; signaling in cancer--a double-edged sword.</a> Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).</li><li>Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+in+Cancer.">TGF-&#946; in Cancer.</a> Cell. 134, 215-215 (2008).</li><li>Ghellal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+TGF-&#946;1+and+TGF-&#946;+in+human+breast+carcinoma.">Prognostic significance of TGF-&#946;1 and TGF-&#946; in human breast carcinoma.</a> Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).</li><li>Sheen-Chen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+levels+of+transforming+growth+factor-&#946;1+in+patients+with+breast+cancer.">Serum levels of transforming growth factor-&#946;1 in patients with breast cancer.</a> Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).</li><li>ten Dijke, P., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+TGF-&#946;-Smad+signaling.">New insights into TGF-&#946;-Smad signaling.</a> Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).</li><li>Moustakas, A., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Smad+TGF-&#946;+signals.">Non-Smad TGF-&#946; signals.</a> J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).</li><li>Soule, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+human+breast+epithelial+cell+line,+MCF-10.">Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10.</a> Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).</li><li>Strickland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+premalignant+MCF10AT+generates+heterogeneous+malignant+variants+with+characteristic+histologic+types+and+immunohistochemical+markers.">Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers.</a> Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).</li><li>Santner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells.">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).</li><li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+multicellular-mediated+resistance+to+alkylating+agents+in+cancer.">Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).</li><li>Inman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-b+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+(ALK)+receptors+ALK4,+ALK5,+and+ALK7.">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).</li><li>Wiercinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGF-&#946;/Smad+pathway+induces+breast+cancer+cell+invasion+through+the+up-regulation+of+matrix+metalloproteinase+2+and+9+in+a+spheroid+invasion+model+system.">The TGF-&#946;/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system.</a> Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).</li><li>Tang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression.">TGF-&#946; switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).</li><li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC. Med. 6, 11-11 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors.">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).</li><li>Lee, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).</li><li>Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> 30, 256-256 (2011).</li><li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p21-Activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer.">p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> 10, 314-314 (2011).</li><li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors.">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים.

הקמנו מודל spheroid שבו MCF10A1 תאים ממאירים ונגזרות שלו לפלוש לתוך מטריצה ​​קולגן בצורה TGF-β תלויים. ראשית, spheroids נוצרות 96-בארות ההשעיה בסיבוב צלחות התחתונה בנוכחות methylcellulose. כמובן, גם בצורת U מרובה המה צלחות מצופה יכול לשמש למטרה זו. Methylcellulose דרושה לחלוטין בשלב זה, שכן התאים ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> מתיל צלולוזה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> מתקדם Biomatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> אינדיקטור pH רצועות </td><td> מרק </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96, גם השעיה צלחות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96-TC גם הידבקות צלחות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

spheroid assay to measure tgf-&#946;-induced invasion

TGF-β יש המתנגדים תפקידים התקדמות סרטן השד על ידי מתנהג כמו מדכאי גידול בשלב הראשוני, אבל מגרה הפלישה גרורות ב 1,2 בשלב מאוחר יותר. יתר על כן, TGF-β הוא overexpressed לעתים קרובות סרטן השד וביטויו בקורלציה עם תחזית גרועה וגרורות 3,4. המנגנונים שבאמצעותם TGF-β גורם הפלישה אינם מובנים היטב. TGF-β מעורר תגובות הסלולר שלה באמצעות TGF-β מסוג II (TβRII) ואת סוג I (TβRI) קולטנים. עם היווצרות TGF-β-Induced מורכב heteromeric, TβRII phosphorylates TβRI. TβRI מופעל יוזם מסלול איתות תאיים הקנונית שלה על ידי Smads קולטן phosphorylating (R-Smads), כלומר Smad2 ו Smad3. אלה מופעלים R-Smads טופס מתחמי heteromeric עם Smad4, אשר מצטברים בגרעין ולווסת את שעתוק של גני מטרה 5. בנוסף ד בעברמסלול Smad escribed, הפעלת קולטן תוצאות ההפעלה של מספר אי - Smad מסלולים אחרים איתות, למשל Mitogen הופעל חלבון kinase (MAPK) 6 מסלולים. כדי לחקור את תפקידה של TGF-β בשלבים שונים של סרטן השד, עשינו שימוש במערכת תא MCF10A. מערכת זו מורכבת הנציח ספונטני MCF10A1 (M1) בתאי אפיתל השד 7, הפך את H-M1-RAS נגזרת MCF10AneoT (M2), אשר מייצרת נגעים טרום ממאיר בעכברים 8, ו-M2 נגזרת MCF10CA1a (M4), אשר הוקמה מ xenografts M2 וצורות קרצינומות ציון גבוה עם היכולת ליצור גרורות לריאות 9. סדרה זו MCF10A מציע את האפשרות ללמוד את תגובותיהם של תאים עם דרגות שונות של ממאירות שאינם מוטים על ידי רקע גנטי שונה. ניתוח הפלישה TGF-β-Induced, אנחנו שנוצר homotypic MCF10A embe תרבויות spheroid תאdded במטריצה ​​קולגן 3D במבחנה (איור 1). מודלים כאלה דומים גידולים אנושיים in vivo על ידי הקמת שיפוע של חמצן וחומרים מזינים, וכתוצאה מכך התאים פעיל פולשני על תאים בחוץ שקט או אפילו נמקי בפנים של 10 spheroid. מבחני מבוסס Spheroid יש גם הוכח בצורה טובה יותר לסכם את עמידות לתרופות מאשר תרבויות monolayer 11. מערכת זו MCF10 מודל 3D אפשרה לנו לחקור את ההשפעה של איתות TGF-β על המאפיינים פולשני של תאים השד בשלבים שונים של ממאירות.

Watch this Scientific Journal Video about Spheroid Assay to Measure TGF-Î²-induced Invasion at JoVE.com

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג&#39;ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

spheroid-assay-to-measure-tgf-induced-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

21.7K Views.  Leiden University Medical Centre. Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים א?...

Video: Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Method to Measure Tone of Axial and Proximal Muscle

The control of tonic muscular activity remains poorly understood. While abnormal tone is commonly assessed clinically by measuring the passive resistance of relaxed limbs1, no systems are available to study tonic muscle control in a natural, active state of antigravity support. We have developed a device (Twister) to study tonic regulation of axial and proximal muscles during active postural maintenance (i.e. postural tone). Twister rotates axial body regions relative to each other about the vertical axis during stance, so as to twist the neck, trunk or hip regions. This twisting imposes length changes on axial muscles without changing the body's relationship to gravity. Because Twister does not provide postural support, tone must be regulated to counteract gravitational torques. We quantify this tonic regulation by the restive torque to twisting, which reflects the state of all muscles undergoing length changes, as well as by electromyography of relevant muscles. Because tone is characterized by long-lasting low-level muscle activity, tonic control is studied with slow movements that produce "tonic" changes in muscle length, without evoking fast "phasic" responses. Twister can be reconfigured to study various aspects of muscle tone, such as co-contraction, tonic modulation to postural changes, tonic interactions across body segments, as well as perceptual thresholds to slow axial rotation. Twister can also be used to provide a quantitative measurement of the effects of disease on axial and proximal postural tone and assess the efficacy of intervention.

We have developed a device (Twister) to study the regulation of tonic muscle activity during active postural maintenance. Twister measures torsional resistance and muscular responses in standing subjects during twisting of the body axis. The device can be flexibly configured to study various aspects of tonic control across the neck, trunk, and/or hips.

שיטה למדוד טון של שרירים נטיית ציר וסמוך

The control of tonic muscular activity remains poorly understood.  While abnormal tone is commonly assessed clinically by measuring the passive resistance ...

Accuracy in Dental Medicine, A New Way to Measure Trueness and Precision

Reference scanners are used in dental medicine to verify a lot of procedures. The main interest is to verify impression methods as they serve as a base for dental restorations. The current limitation of many reference scanners is the lack of accuracy scanning large objects like full dental arches, or the limited possibility to assess detailed tooth surfaces. A new reference scanner, based on focus variation scanning technique, was evaluated with regards to highest local and general accuracy. A specific scanning protocol was tested to scan original tooth surface from dental impressions. Also, different model materials were verified. The results showed a high scanning accuracy of the reference scanner with a mean deviation of 5.3 &#177; 1.1 &#181;m for trueness and 1.6 &#177; 0.6 &#181;m for precision in case of full arch scans. Current dental impression methods showed much higher deviations (trueness: 20.4 &#177; 2.2 &#181;m, precision: 12.5 &#177; 2.5 &#181;m) than the internal scanning accuracy of the reference scanner. Smaller objects like single tooth surface can be scanned with an even higher accuracy, enabling the system to assess erosive and abrasive tooth surface loss. The reference scanner can be used to measure differences for a lot of dental research fields. The different magnification levels combined with a high local and general accuracy can be used to assess changes of single teeth or restorations up to full arch changes.

Accuracy is a major demand in dental medicine. To verify accuracy, reference scanners are needed. This article presents a new reference scanner with an adjusted scanning method to acquire a broad variety of dental morphologies with high trueness and precision.

דיוק ברפואת שיניים, הדרך חדשה למדוד את האמיתות ודיוק

Reference scanners are used in dental medicine to verify a lot of procedures. The main interest is to verify impression methods as they serve as a base ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

טלמטריה תוך רחמי למדידת לחץ עכבר התכווצות<em&gt; In vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

חומוס לב הפלישה Assay עבור בדיקת הפולשנות של תאי סרטן והפעילות של תרכובות פוטנציאלית אנטי-פולשנית

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the lung. Barometric plethysmography is a classic technique to evaluate the lung volume with a long history of clinical use. Volumetric capnography utilizes the profile of exhaled carbon dioxide to determine the volume of the conducting airways, or dead space, and provides an index of airways homogeneity. These techniques may be used independently, or in combination to evaluate the dependence of airways volume and homogeneity on lung volume. This paper provides detailed technical instructions to replicate these techniques and our representative data demonstrates that the airways volume and homogeneity are highly correlated to lung volume. We also provide a macro for the analysis of capnographic data, which can be modified or adapted to fit different experimental designs. The advantage of these measures is that their advantages and limitations are supported by decades of experimental data, and they can be made repeatedly in the same subject without expensive imaging equipment or technically advanced analysis algorithms. These methods may be particularly useful for investigators interested in perturbations that change both the functional residual capacity of the lung and airways volume.

Here, we describe two measures of pulmonary function &#8211; barometric plethysmography, which allows the measurement of lung volume, and volumetric capnography, a tool to measure the anatomic dead space and airways uniformity. These techniques may be used independently or combined to assess airways function at different lung volumes.

שילוב Capnography נפח Plethysmography הברומטרי כדי למדוד את מערכת היחסים מבנה-פונקציית ריאות

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...