אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

קבוצת המחקר שלנו מתמקדת בעיקר ביחסי הגומלין בין סרטן לבין תאי מערכת החיסון. אנו שואפים לחקור את ההשפעה של מנגנונים ביולוגיים שונים על האבולוציה של סרטן הראש והצוואר באמצעות אפנון חסינות הגידול. מטרת פרוטוקול זה היא להעריך פלישה בתוך מטריצה חוץ-תאית וקולוקליזציה מרחבית של סוגי תאים שונים בהקשר רב-שכבתי.

היתרון של פרוטוקול זה הוא השימוש בהטרוספרואידים המשלבים שני סוגי תאים רלוונטיים שאינם ניאופלסטיים לצד תאים סרטניים כדי לנתח פלישה עם מטריצה חוץ-תאית לכיוון קרום מיקרו-נקבובי וגירויים כימוטקסיסיים. כדי להתחיל, הוסיפו ננו-חלקיקים מגנטיים לתרחיף התא וערבבו 10 פעמים. צנטריפוגו את התאים בטמפרטורה של 400 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, וערבבו 10 פעמים כדי להשהות מחדש את התאים.

לאחר מכן העבירו וערבבו את כל התאים בצינור חדש לתרבית משותפת, ושחררו 100 מיקרוליטר של תאים בתרבית משותפת לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד. הכנס את השדה המגנטי של כונן הספרואיד מתחת ללוח כדי לגרום לצבירה והיווצרות ספרואידים ומקם אותו באינקובטור למשך שלוש שעות. באמצעות קצה של 200 מיקרוליטר, הוסף 50 מיקרוליטר של ECM למרכז קרום מיקרו-נקבובי של 24 בארות.

הסר בועות עם מחט סטרילית, להבטיח כי המטריצה מכסה באופן שווה את פני הממברנה. לדגור על הממברנה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ליצירת ג'ל. כדי להתחיל, להכין את תרבית התא 3D ואת הממברנה microporous מצופה מטריצה חוץ-תאית.

הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית, בתוספת סרום בקר עוברי 10% לתא התחתון של הקרום המיקרונקבובי כמושך כימו. לאחר מכן בזהירות להסיר את המדיום מן heterospheroids שנוצרו, בעדינות להוסיף 50 מיקרוליטר של מדיום טרי ללא תוספת לכל באר מעל spheroid. בעזרת מספריים סטריליים, חותכים את הקצה של קצה 200 מיקרוליטר בעל שימור נמוך ואוספים את הספרואידים, יחד עם 50 מיקרוליטר מדיום.

מניחים בעדינות את הספרואיד על גבי המטריצה החוץ תאית. לאחר מכן להוסיף בזהירות 150 מיקרוליטר של טיפה אחר טיפה בינונית ללא תוספת כדי להגיע נפח כולל של 200 מיקרוליטר. מניחים את הצלחת באינקובטור למשך 48 שעות.

לחץ על קובץ בתוכנת הניתוח. בחר פתח, ולאחר מכן בחר את התמונה ולחץ על אישור. לאחר מכן לחץ על ניתוח, ואחריו הגדר מדידות לבחירת שטח, צפיפות משולבת ותווית תצוגה.

לחץ על אישור. לבסוף לחץ על ניתוח, ולאחר מכן למדוד. תמונות השדה הבהיר מייצגות לוקליזציה של ספרואידים או תאים, המזוהים על ידי קונגלומרטים כהים או שחורים.

תמונות של התאים השונים הציגו שונות בעוצמת הפלואורסצנטיות ובכמות על פני תמונות שונות לאורך ציר Z, מה שמצביע על דפוסים שונים של התפשטות ופלישה בין תאים. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, שכבו ערוצים שונים להדמיית דפוסי קולוקליזציה במהלך הפלישה. ניתוח תמונות של התוצאות המייצגות שהוצגו הצביע על כך שמונוציטים פולשים ראשונים, אחריהם תאים ניאופלסטיים, ופיברובלסטים הם התאים האחרונים שפולשים למטריצה החוץ תאית.