This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. דור של Spheroids גידול בגודל reproducibly <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> monolayers לשטוף תאים סרטניים עם מי מלח שנאגרו פוספט (PBS; 5 מיליליטר ל25 סנטימטר 2 או 8 - 10 מיליליטר לבקבוק 2 75 סנטימטרים), להוסיף אנזים תא דיסוציאציה (1 מיליליטר ל25 סנטימטר 2 או 2 מיליליטר ל75 סנטימטר 2 בקבוק) ותאי דגירה בC ° 37 2 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו ניתוק תא תחת מיקרוסקופ ולנטרל אנזים ניתוק תא עם מדיום גידול שלם (5 מיליליטר לסנטימטר 25 2 או 8 מיליליטר לבקבוק 2 75 סנטימטרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, לחץ על הצינור מחדש להשעות תא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום גידול להשלים בעזרת פיפטה P1000. זה אמור להניב השעיה תא בודדת ללא צבירי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולדלל את ההשעיה התא להשיג 0.5-2 x 10 4 תאים / מיליליטר (צפיפות תאים אופטימלית צריכה להיקבע לשורה תאים כל אחד בoבצו להשיג spheroids גידול של 300-500 קוטר מיקרומטר 4 ימים לאחר זריעת תאי 12,13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא למאגר סטרילי ו, בעזרת פיפטה רבה, לוותר 200 μl / גם לתוך קובץ מצורף נמוך במיוחד (אולא) 96-גם צלחות תחתית עגולות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הצלחות לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 95%). ארבעה ימים לאחר מכן, באופן חזותי לאשר היווצרות אליפטית גידול ולהמשיך עם assay פלישת 3D. </li></ol> 2. גידול 3D Assay ספרואיד הפלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר BMM על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על ערכה של טיפים סינון סטרילי לP10, P200 וטפטפות P1000 וצינורות סטרילי (1.5 מיליליטר נפח גדול יותר או בהתאם לנפח כולל הנדרשים) ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צלחות 96-היטב אולא מכילות ישן spheroids 4 ימים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, להסיר בעדינות 100 μl / טוב של מדיום גידול מהצלחות אליפטית. לזווית שלב זה הטיפים לקראתיקיר nside של בארות U-התחתונה, הימנעות ממגע עם תחתית הבאר ואת המיקום של spheroids; למזער הפרעה של spheroids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טיפים קרים כקרח, להעביר BMM לצינורות קר כקרח. לפלישה מושרה ציטוקינים או למחקרי הערכת תרופה, להוסיף חומרים כימיים (ב2x הריכוז הסופי) לBMM באמצעות טיפים קרים כקרח. לדוגמא, השתמש גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כדי לעורר את הפלישה של קרצינומה של תאי קשקש CAL S וCAL R. מערבבים היטב על ידי מתערבל בעדינות, הימנעות היווצרותן של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לוותר על BMM 100 μl לתוך הבאר U-התחתונה, מכוון את הקצה לכיוון הקיר הפנימי של הבאר. צעד זה הוא קריטי ביותר כ, לניתוח תמונה אופטימלי, spheroids חייב להישאר במרכז גם 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.6 עבור כל הבארות הנדרשות, המאפשרות 5-6 חזרות / מצב. במידת צורך, לשנות לקצה טרי מצונן. הערה: כאשר מנוסה יותר, dispense BMM בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית, להסיר בועות, אם קיימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית לבדוק שspheroids נמצא במיקום מרכזי. אם לא, צנטריפוגות הצלחת ב XG 300 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס. זה יבטיח כי spheroids נמצאים במיקום מרכזי בכל טוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת לחממה על 37 מעלות צלזיוס ולאפשר BMM כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שעה מאוחר יותר, בעזרת פיפטה רבה, בעדינות להוסיף 100 μl / טוב של מדיום גידול שלם. ללימודי פלישה או הערכת תרופה מושרה ציטוקינים, כוללים ציטוקינים או מעכבים במדיום (1X ריכוז סופי). לחלופין, אם ריאגנטים לא התווספו לBMM בשלב 2.5, להוסיף אותם למדיום בשלב זה (3x הריכוז הסופי הרצוי). </li></ol> תמונה אוטומטית 3. רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות סריקה בcytometer (למפרטים ראו טבלה של ציוד וחומרים) בSTA מרווחיםrting מהזמן אפס (t0 = יום של assay הפלישה הקים, מייד לאחר שלב 2.10 עד 72 שעות, או 96 שעות לשורות תאי גידול פולשים איטיות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את היישום &#39;Confluence&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שאליפטית היא בפוקוס ו, במידת הצורך, להתאים באופן ידני ולתקן את &quot;הפוקוס יצא-&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;הגדרות דגימה&#39;, בחרו לסרוק שדה מרכזי אחד של תצוגה (FOV). בעקבות בנוסף BMM, spheroids גידול צריך נותר בעמדה מרכזית, ובכך אין צורך לסרוק את כולו גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, להגדיר את הבארות לסריקה על ידי הדגשה אותם על מפת הצלחת. לחץ על &quot;התחל סריקה&quot;. הערה: הסריקה תישמר באופן אוטומטי וניתן לסקור מאוחר יותר off-line. </li></ol> 4. ניתוח תמונה אוטומטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר יישום &#39;Confluence&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;ניתוח&#39;, להתאים ישימיםהגדרות ני (למשל, &quot;דיוק&quot;: נמוך, רגיל, גבוה; &quot;סף עוצמה&quot;: 1 - 15) כדי לייצר פילוח מדויק סביב אליפטית, כוללים תהליכים בתא וinvadopodia הארכה לBMM (ראה איור 1). התאם את ההגדרות עבור כל שורת תאים סרטניים ו / או בנקודות זמן שונות. אמצעי &#39;Confluence&#39; יישום% מהשטח גם מכוסה על ידי התאים הפולשים, בFOV נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהגדרות הניתוח מתאימות (כלומר, הפילוח מדויק) לspheroids האחר בצלחת על ידי לחיצה על כמה בארות שונות. אם הפילוח לא מדויק להתוות אליפטית, להתאים את הגדרות יישום נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל ניתוח&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;התוצאות&#39;, לבדוק בארות מרובות כדי לוודא את איכות ניתוח. &quot;הנתונים ובכן רמה &#39;יצוא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Repeaניתוח לא לכל נקודות הזמן. חשב את מפגש% הממוצע לבארות לשכפל ופלישת עלילה (מפגש%) נגד זמן בתרשים בר, באמצעות גרפים מדעיים ותוכנות סטטיסטיות של בחירה. </li></ol> 5. תמונה ידנית רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט תמונה לכל אליפטית גידול במרווחים החל מt = 0 עד 72-96 שעות, בהתאם למהירות של פלישה של הקו הסלולרי בשאלה, באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (לצלחת 96-היטב זה לוקח בערך 20 - 30 דק &#39;). השתמש אובייקטיבי 10X. השתמש אובייקטיבי 4X כאשר האזור פלש גדול מדי כדי לנפול בפח לחלוטין בתחום 10X מבט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל את כל תמונה בנפרד רכשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכיול, לקחת תמונות של רשת הגאוגרפית שלב (1 מ&quot;מ) בשתי מטרות 10X ו4X (ולשמור את התמונות). </li></ol> 6. ניתוח תמונה ידני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונות רשת הגאוגרפית שלב לתוך תוכנת ניתוח תמונה של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את gratמדידות icule, היחידות (מיקרומטר), מטרות שימוש (10X או 4X) ולבצע את הכיול. צעד זה נדרש רק פעם אחת. לניתוח תמונה שלאחר מכן, פשוט לטעון מחדש את הגדרות כיול הנדרשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונות assay פלישה ובחר את הגדרות הכיול בהתאם למטרת מיקרוסקופ (10X או 4X) משמש כדי לקבל את התמונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לייבא תמונות שהתקבלו בהדמית cytometer (שלב 3) ולנתח באופן ידני, כפי שתוארו עבור תמונות המתקבלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (ראה תוצאות מוצגות באיור 3 ואיור 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את השטח המכוסה על ידי spheroids. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה המשמשת כאן לנציגי התוצאות (למפרטים ראו טבלה של ציוד וחומרים), ללכת ל&#39;מדוד &#39;ובחר&#39; רוזן / גודל &quot;. בחרת &#39;קובץ&#39; ולאחר מכן &#39;הגדרות טען&#39; ובחר אסא-שנקבע מראשהגדרות y. לאחר מכן בחר &#39;רוזן&#39;. אליפטית אמורה להיות מפולח בצורה מדויקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין ללכת ל&#39;ערוך &#39;ולאחר מכן&#39; צייר / מיזוג אובייקטים &quot;לפתוח חלון&quot; שרביט קסמים / עקבות &#39;. השתמש בסמן השרביט ללחץ על תמונת אליפטית ולקבל פילוח. בחירה &#39;עקבות&#39; (בחלון &#39;שרביט הקסמים&#39;) מתאר באופן ידני אליפטית באמצעות עכבר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות יצוא של פרמטרים שונים (אזור, קוטר, היקף וכו &#39;) לגיליון אלקטרוני. שיא בגיליון האלקטרוני המידע על תמונה הרלוונטית (למשל, גם מספר, נקודת זמן היחסית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה האזור הממוצע של spheroids לשכפל (פלישה) לעומת זמן באמצעות גרפים מדעיים ותוכנה סטטיסטית. לחלופין, לחשב את השינוי בשטח אליפטית בכל נקודת זמן, יחסית לאזור בזמן t = 0. ואז פלישת עלילה (t0%) לעומת זמן כמו הגר&quot;א ליניאריph. </li></ol>

<ol>
	<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays.">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li><li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma:+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling.">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device.">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).</li><li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+the+microenvironment:+plasticity+and+reciprocity.">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li><li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion.">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415 (2009).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems:+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model.">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li><li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li><li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells.">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).</li><li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels.">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation.">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li></ol>

כל המחברים מצהירים שום ניגוד מתחרה של עניין.

שני דגמי הגידול מתוארים כאן (גליובלסטומה וSCCHN) נבחרו במיוחד כדי להדגים assay 3D שלנו כפי שהם קליניים סרטן פולשני המקומי רלוונטי עם צורך מסופק לטיפולים יעילים 12. בעקבות טיפול תרופתי, הערכה במבחנה שינויי pharmacodynamic סמן ביולוגי (PD) יכול להתבצע בקלות על ידי כתם או immunoassays של lysates המערביים בעקבות השימוש בחומרים כימי זמינים מסחרי ספציפיים כדי לאפשר התאוששות תא מBMM ו / או ניתוח immunofluorescent של פלישת spheroids גידול על ידי כל צביעת הר. assay הפלישה זוהי טכניקה שימושית להערכה מהירה ושחזור של פלישת תאים סרטניים למדיום מוצק למחצה, ולכן מתאימה במיוחד לעתיד בהקרנת סמים מבחנה. תאים סרטניים לפלוש המטריצה ​​באופן 3D כפי שהם פרושים מ&quot; מיקרו-גידול &quot;, מיוצג על ידי אליפטית הגידול, ולהרחיב לextracellulסביבה כמו מטריקס-AR. תלת-ממדית האמיתית של assay ניכר במורפולוגיה התא, שהוא שונה מהמורפולוגיה השטוחה, תאים חסיד להניח בעת מעבר על מצע מוצק. התואר של פלישה הוא לכמת בקלות תוך שימוש בהדמיה cytometer, המאפשר אוטומטי לקריאה החוצה, או על ידי שימוש במיקרוסקופ רגיל בשילוב עם תוכנת הדמיה. יתר על כן, שיטה זו מתאימה להדמיה ניאון 13 (לדוגמא עם שורות תאים לבטא חלבונים או ניאון מראש שכותרתו עם צבעי ניאון). השיטה היא פשוטה לביצוע עם השלב הקריטי רק מיוצג על ידי התוספת של BMM, כאשר קיים סיכון של הפרעה לעמדה של אליפטית במרכז בצורה U-היטב. זה יכול לגרום לניתוח תמונה הכי מוצלח, עם spheroids במטוסי מוקד שונים. לכן זה קריטי כדי להוסיף BMM בזהירות ולאט לאט זה טוב. לאחר תוספת BMM רצוי כדי לבדוק את הצלחתתחת מיקרוסקופ ואם הלוקליזציה נחשבת מקובלת, זה ניתן לתיקון על ידי צנטריפוגה העדינה. עם ניסיון, זה רק לעתים נדירות יש צורך. בעוד ששיטה זו היא חזקה ומאוד לשחזור, וריאציה בין-ניסיונית עלולה להתרחש עם קבוצות שונות של BMM. כדי להימנע מכך, מומלץ לרכוש BMM מספיק מתצווה אחת כדי להשלים סדרה של מחקרים. מגבלה של השיטה (כמו לכל מבחני כאלה) היא הקושי בהבחנה בין הפלישה והתפשטות, שתאי הגידול צפויים לעבור במהלך מסגרת זמן assay. למרות זמן ההכפלה של תאים יכול להילקח בחשבון, או מעכבי מחזור התא כגון cytochalasin D הציגו, זה לא קל לשלוט או בבירור להבחין בין שני היבטים שונים אלה של התקדמות גידול, במיוחד לתאי גידול גדלו במהירות ועבור אלה ש יש דפוס יותר &quot;רחב&quot;, ולא הסתנן, פלישה. מהסיבה הזוהוא הציע שassay צמיחת 3D מקביל מתבצע כדי לבדוק את ההשפעות ספציפיות של כל סוכנים מעכבים או גירוי. אם מחקרי תגובת מינון זהיר מבוצעים, זה עשוי להיות אפשרי כדי לבחור ריכוזים שלמזער את ההשפעות על התפשטות. לדוגמא שהראינו כי Hsp90 מעכב 17-AAG מעכב U-87 פלישת אליפטית גידול MG 3D כבר בשעה 24 ובריכוזים נמוכים ריכוז עיכוב צמיחת 3D ב -50% (GI 50) 12. מצד השני, את המשמעות של assay זה בהשוואה למבחני פלישה סטנדרטית אחרים (למשל, מבחני סינון מבוסס או פלישה של תאים בודדים למטריצות 1 3D), הוא שתאים סרטניים לפלוש לתוך המטריצה ​​מקיפה מאליפטית, שדומה &quot; מיקרו-גידול &quot;או&quot; מיקרו-גרורות &quot;, ולכן לוקח בחשבון היבטים חשובים של הפתופיזיולוגיה של מסת גידול. אנו מציגים השיטה מספקת מידע עלהתנהגות קולקטיבית של תאים סרטניים, כאשר בתחילה לעזוב את spheroids, וגם באופן אישי, כאשר תאים בודדים להגיע אזורים מרוחקים יותר בBMM. בנוסף, תאים בתוך הגידול spheroids עלולים לחוות מחסור היפוקסיה ומזין אשר, דרך שינויים בביטוי גנים, יכול לקדם את ההגירה ופלישה; תכונות כגון נעדרות במבחני 2D. יתר על כן, כל זה הוא זמין בפורמט תפוקה גבוהה באמצעות השימוש בלוחות 96-גם ספציפיים וטכנולוגיית ההדמיה האחרונה, מאפשר assay 3D מורכב יותר לשמש בקלות ביעד אימות וגילוי תרופות. אנו מציגים שיטה יכולה להכיל יישומים נוספים כדי לטפל בהיבטים נוספים של פלישת תאים סרטניים. בפרט, מורכבות נוספת ניתן בחזון על ידי התוספת של תאי מארח, כגון fibroblasts ו / או בתאי האנדותל, לעצמו או אליפטית המטריצה ​​שמסביב. זה גם יכול להיות שונה, לא רק במונחים של נוקשות (על ידי השימוש בשיתוף שונהncentrations של BMM), אלא גם במונחים של הרכב (על ידי התוספת של רכיבים אחרים תלויים ברקמה / איבר המסוים של המודל שאומץ על הגידול: למשל, tenascin לסרטן המוח 16 וקולגן לסרטן השד 17). הגדרה דומה (דור של spheroids והדמיה) יכולה גם להיות מותאם כדי להעריך פלישת רקמה ב3D, שבו spheroids גידול הוא שיתוף תרבותי עם גופי embryoid הדומים רקמה מורכבת 12 או עם organoids תא ספציפי אחר (למשל, האסטרוציטים ל תרבויות גליומה 18 או קריפטה לסרטן במערכת העיכול), אבל עבודה נוספת נדרשת על מנת לאפשר ניתוח תמונה אוטומטי.

פיתוח תרופות נגד הסרטן קלאסי הוא ממוקד במידה רבה על השימוש במבחני חוץ גופייה מבוסס תאים למסך לחומרים ציטוטוקסיים המעכבים התפשטות תאים סרטנית ו / או לקדם מוות מתוכנת של תאים (אפופטוזיס). לאחרונה, מאמצים עברו לטיפולים ממוקדים בפיתוח מעכבי הגורמים המולקולריים שבבסיס של התפשטות תאים ממארת. למרות כמה תוצאות מרהיבות, סוכנים כאלה הקשורים לעתים קרובות עם ההתפתחות המהירה של עמידות לתרופות. בהתחשב בכך שזה הפוטנציאל פולשני וגרורתי של תאים סרטניים שאחראית למרבית מקרי מוות מסרטן, וכי מחלת הישנות לעתים קרובות מציגה פנוטיפ אגרסיווי יותר, זה הגיוני גם לשקול משלים במודלים ניסיוניים מבחנה 1,2 לזהות רומן סוכנים שימנעו &quot;סימני ההיכר&quot; אלה נוספים מפתח של הסרטן. במהלך התקדמות ממארת, תאי גידול לרכושהיכולת לפלוש לרקמות שמסביב ו / או להפיץ לאיברים מרוחקים (גרורות). תאים סרטניים לחדור את הקרום במרתף על ידי ההיווצרות של invadopodia 3,4. מבנים אלה מועשרים בסיבים אקטין, חלבוני הדבקה ספציפיים וproteinases וקולקטיביים אחראים לתנועתיות של תאי גידול והשפלה של מטריקס (ECM) 5. Invadopodia להאריך לתוך ECM והם האמינו להיות חשובים לפלישת תאים סרטניים וגם extravasation לערוצי כלי דם, להקל hematogenous הפצה (או הלימפה) וגרורות. שיטות מקובלות כיום להעריך פלישת תאים סרטניים במבחנה כוללת את הבאים. מבוסס transwell או מבחני קאמריים בוידן 2,6 בי השעיות תא בודדות הם זורעים על גבי מסנן מצופה בשכבה עבה של חלבונים המופק מECM. תאים אז לפלוש ולעבור לתא התחתון בתגובה לכימותרפיה-attractant. ECM הנפוץחלבונים הם סוג אני קולגן, או מטריצת מרתף כמו קרום (BMM, למשל, Matrigel, הנגזרת מהגידול EHS 7) המחקה את ההרכב הטבעי של ממברנות מרתף. כחלופה למבחני סוג תא וידן מבוססת מסנן 8, יכולים להיות שנזרעו תאים על גבי ג&#39;ל ECM (שניתן להוסיף fibroblasts) שבו הם יוצרים monolayer ולאחר מכן בנפרד או ביחד לפלוש לתוך הג&#39;ל. פלישה ניתן למדוד במונחים של מספר התאים פולשים ו / או מרחק שעובר ממשטח ג&#39;ל 9. תאים סרטניים יכולים גם להיות מוטבעים לחלוטין לתוך מטריצה ​​או כהשעית תא בודדת או כspheroids - בדרך כלל ממוקם בין שתי שכבות של ג&#39;ל ECM מאפשרות לתאים לפלוש מחוץ למסת הגידול לתוך המטריצה ​​מקיפה 2,6,10,11. Assay תלת ממדי (3D) אליפטית גידול הפלישה המתוארת כאן מספק מערכת מהירה, automatable פלישה באמצעות highlשיטת y לשחזור, סטנדרטית 12 בפורמט צלחת 96-היטב עם אליפטית אחד בכל טוב. BMM מתווסף כל גם ישירות לספק מטריצת חצי מוצקה שאליו תאים סרטניים לפלוש מהגוף אליפטית. של פלישת תאים סרטני המידה מנוטרת במרווחים על פני תקופה של 72-96 שעות. שיטה זו מספקת את היתרונות הבאים על מבחני פלישה הנוכחיים במבחנה שהוזכרו לעיל: גידול תאים מאורגנים במבנה 3D מחקה מייקר אזור גידול או מיקרו-גרורות; spheroids הגידול הוא מאוד לשחזור בגודל; assay הפלישה מתבצע באתר באותה הצלחת כמו פיתוח אליפטית גידול, ללא הצורך להעביר אותם לצלחות המשניות; השיטה, בשילוב עם הטכנולוגיות החדישות ביותר של ניתוח תמונה אוטומטי, מאפשרת הן תכולה גבוהה ותפוקה גבוהה מנתח של פלישת תאים סרטניים. ניתוח התמונה מתבצע באמצעות הדמיה cytometer, אשר סורק 96-היטבצלחת בתוך 10 דקות. על ידי שימוש ביישום המפגש, השיעור של פלישת המידה ולהשיג גם על ידי תאים בודדים או על ידי צבירי תאים מתפשטים החוצה מspheroids הגידול ופולש לתוך המטריצה ​​ניתן למדוד באופן דינמי. לתפוקה נמוכה יותר, שיטה חלופית לניתוח תמונה מוצגת, המבוססת על השימוש במיקרוסקופ הפוכה ותוכנת הדמיה סטנדרטית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Web address</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354234</td>
			<td>http://www.corning.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td style="width:161px;">Trevigen</td>
			<td style="width:135px;">3432-005-01</td>
			<td>http://www.trevigen.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultra-low attachment 96-well plate</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">7007</td>
			<td>http://www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">EGF</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-093-825</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com 
			Add 100 &#181;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &#181;g EGF. To 25 &#181;l of this, add 4,975 &#181;l RHB-A medium to give a 10 &#181;g/ml working stock. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RHB-A medium</td>
			<td style="width:161px;">Stem Cells Inc.</td>
			<td style="width:135px;">SCS-SF-NB-01</td>
			<td>http://www.stemcellsinc.com 
			For diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">31966-021</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Biosera</td>
			<td style="width:135px;">1001/500</td>
			<td>http://www.biosera.com 
			Heat at 56 &#176;C to inactivate complement before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">12605</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">Celigo cytometer</td>
			<td style="width:161px;">Nexcelom Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.nexcelom.com 
			Specialist equipment for image capture and analysis.&#160; Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IX70 inverted microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.olympus.co.uk/ 
			Used with camera for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:297px;">Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td>
			<td style="width:161px;">Qimaging</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.qimaging.com/ 
			Attached to microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Software used to control camera and microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Analyzer 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:161px;">Microsoft</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.microsoft.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:161px;">GraphPad</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.graphpad.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

פלישה של רקמות הסובבות נורמליות נחשבת בדרך כלל להיות סימן היכר מרכזי של ממאיר (בניגוד לשפיר) גידולים. לסוגים מסוימים של סרטן בפרט (לדוגמא, גידולים במוח כגון multiforme גליובלסטומה וקרצינומה של תאי קשקש של הראש וצוואר -. SCCHN) הוא סיבה לתחלואה קשה ויכולים להיות גם בהיעדרו של גרורות מרוחקות סכנת חיים. בנוסף, סרטן שההישנות לאחר טיפול למרבה הצער לעתים קרובות נוכחי עם פנוטיפ אגרסיווי יותר. לכן, יש הזדמנות למקד את התהליך של פלישה לספק טיפולים חדשניים שיכול להיות משלימים לסוכנים אנטי-שגשוג סטנדרטיים. עד עכשיו, אסטרטגיה זו כבר הקשתה על ידי חוסר מבחני חזקים, שחזור מתאימים לניתוח מפורט של פלישה ולהקרנת סמים. כאן אנו מספקים שיטת מיקרו-צלחת פשוטה (המבוסס על מדים, spheroids גידול 3D להרכבה עצמית) שיש לו פוטנציאל גדול לסטו כגוןמת. אנחנו מדגימים את פלטפורמת assay באמצעות קו אנושי תא גליובלסטומה וגם מודל SCCHN בי הפיתוח של התנגדות נגד הקולטן לגורם צמיחת אפידרמיס ממוקד מעכבים (EGFR) קשור עם פוטנציאל מטריצה ​​פולשנית משופר. כמו כן אנו מספקים שתי שיטות חלופיות של כימות חצי אוטומטי: אחת באמצעות הדמיה cytometer ושני שפשוט דורש ללכוד מיקרוסקופיה ותמונה רגילה עם ניתוח תמונה דיגיטלי.

פלישת אליפטית גידול 3D נבחנת באמצעות שיטה פשוטה, לשחזור, אוטומטית מאוירת באופן סכמטי באיור 1: spheroids גידול reproducibly בגודל מתקבל על ידי תאי ציפוי לאולא 96-גם צלחות תחתית עגולות. spheroids הודעה הייזום-4 ימים מוטמע בBMM. זה מספק מבנה מוצק למחצה לתוכו תאים סרטניים לפלוש ופרושים של אליפטית. Spheroids נמצא במיקום מרכזי בבסיס של כל טוב והפלישה לBMM מנוטר בקלות במרווחים החל מt = 0 עד 72-96 שעות באמצעות הדמיה cytometer. זה יכול לספק ניתוח תמונה אוטומטי לחלוטין. דוגמאות לסוגים שונים של פלישת תאים הסרטניים של מומחשות באיורים 2 -. 4 multiforme גליובלסטומה אדם הקו הממאיר ביותר (GBM) התא U-87 MG, יוצר מבנה 3D הדוק, כדורי ומשמש כאן כדי להדגים גידולים במוח שבו מקומי פלישה היא סכנת חיים מפתחתכונה. משובץ ברגע בBMM, ​​תאים מspheroids U-87 MG התפשט עם דפוס פלישה טיפוסי &quot;מספרים&quot; 12. תאי גידול להאריך רדיאלית לתוך המטריצה ​​שבה הם שומרים על צורה 3 ממדים. התהליך אחרי על פני תקופה של 72 שעות, כפי שמוצג באיור 2 לU-87 spheroids MG, כאשר היקף פלישת תאים סרטניים, עם פרטים של התהליכים התאיים וinvadopodia הארכה לBMM הוא ברור מאליו. באופן מלא אוטומטי ניתוח תמונה באמצעות תמונה cytometer מאפשר כימות מדויק של פלישת התאים הסרטניים לאורך זמן. הכימות באיור 2 מתקבל כפי שמודגם באיור 1, שבו הניתוח האוטומטי מייצר פילוח סביב בליטות תא הארכה לBMM מ- 87 U MG גוף אליפטית. שים לב שעבור קו תא זה, גוף אליפטית הגידול נכלל במדידה של האזור פלש. דפוס של invas שונההיון הוצג על ידי שורות תאי הסרטן אנושיות קשקש של ראש וצוואר. CAL S וCAL R הוא isogenic אבל CAL S הוא רגיש ל, וCAL R עמיד למעכבי טירוזין קינאז EGFR 14. בהעדר EGF, שורת תאים לא פלשה לBMM (איור 3) עם זאת, כריכוז של EGF הוגדל (2.5 ng / ml), spheroids נראה &#39;ניצן&#39;. בריכוזים גבוהים יותר של EGF (מיליליטר / 40 ו- 80 ng) את מידת הפלישה הופחת. זה עולה בקנה אחד עם התגובה הקלסית דמוי פעמון המינון לEGF במונחים של פלישה שכבר דווחה בעבר 15. ב 20 ng / ml EGF, בליטות כמו אצבע-נמתחים מהגוף העיקרי של spheroids CAL R תוך תאי CAL S היו פחות פולשני לאחר 72 שעות (איור 3). פלישת ההפרש הזה הייתה ברורה 48 שעות לאחר spheroids הונח לBMM (המכיל 20 ng / ml EGF להבחנה המרבית בין שורות תאים) והגדול ביותר אחרי 72 שעות (איור 4). תמונות אלה נרכשו במהירות באמצעות הדמיה cytometer, כלU-87 MG. עם זאת, במקרה זה, כדי להדגים שיטה חלופית, את מידת הפלישה הייתה לכמת באופן ידני באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עצמאית ומוצגת באופן גרפי (איורים 3 ו -4). תוצאות אלו ממחישות את הבדל בין תאי פנוטיפי תרופה רגישים ו-resistant שיכול להיות מנוצל כדי להקרין לתרכובות שדווקא שנאה מצד פנוטיפ עמיד, פולשני הסמים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> איור 1. סקירה סכמטי של assay פלישת אליפטית גידול 3D. העבודה מציגה את שלבי השיטה כרוכה כולל תמונות נציג של spheroids U-87 MG גליובלסטומה רק לאחר ההטבעה לתוך BMM (פנל עליון; t = 0) ולאחר פלישה<html> לBMM (פנל תחתון; t = 72 שעות) עם ובלי הפילוח המודד את האזור המכוסה על ידי התאים הפולשים. בר = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> כימות איור 2. זמן-במהלך פלישת U-87 MG אליפטית גליובלסטומה לBMM. U-87 MG אליפטית פלישת 3D לBMM הייתה פיקוח ולכמת עד 72 שעות באמצעות הדמיה cytometer. () תמונות ונציג (ב) פלישת תאים סרטניים מוצגת. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מחדש 3 &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 52,686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. CAL R (עמיד) וCAL S פלישה (רגישה) אליפטית גידול. (א) נציג תמונות וכימות ידני של R EGF תלוי מינון CAL ופלישת אליפטית גידול CAL S (B) מוצגים. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> איור 4. תאים מCAL R spheroids (עמיד) הם יותר חודרני מאשר S spheroids גידול CAL (רגיש) כאשר הניחו BMM. עם spheroids גידול גירוי EGF CAL R להראות פלישה בולטת יותר מאשר כאל S. (א) נציג תמונות וכימות ידני של פלישה (B) מוצג. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

56.8K Views.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Video: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

הדפסה תלת-ממדית של סטייה אבי העורקים מורכבים

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...