This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. דור של Spheroids גידול בגודל reproducibly <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> monolayers לשטוף תאים סרטניים עם מי מלח שנאגרו פוספט (PBS; 5 מיליליטר ל25 סנטימטר 2 או 8 - 10 מיליליטר לבקבוק 2 75 סנטימטרים), להוסיף אנזים תא דיסוציאציה (1 מיליליטר ל25 סנטימטר 2 או 2 מיליליטר ל75 סנטימטר 2 בקבוק) ותאי דגירה בC ° 37 2 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו ניתוק תא תחת מיקרוסקופ ולנטרל אנזים ניתוק תא עם מדיום גידול שלם (5 מיליליטר לסנטימטר 25 2 או 8 מיליליטר לבקבוק 2 75 סנטימטרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, לחץ על הצינור מחדש להשעות תא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום גידול להשלים בעזרת פיפטה P1000. זה אמור להניב השעיה תא בודדת ללא צבירי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולדלל את ההשעיה התא להשיג 0.5-2 x 10 4 תאים / מיליליטר (צפיפות תאים אופטימלית צריכה להיקבע לשורה תאים כל אחד בoבצו להשיג spheroids גידול של 300-500 קוטר מיקרומטר 4 ימים לאחר זריעת תאי 12,13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא למאגר סטרילי ו, בעזרת פיפטה רבה, לוותר 200 μl / גם לתוך קובץ מצורף נמוך במיוחד (אולא) 96-גם צלחות תחתית עגולות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הצלחות לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 95%). ארבעה ימים לאחר מכן, באופן חזותי לאשר היווצרות אליפטית גידול ולהמשיך עם assay פלישת 3D. </li></ol> 2. גידול 3D Assay ספרואיד הפלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר BMM על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על ערכה של טיפים סינון סטרילי לP10, P200 וטפטפות P1000 וצינורות סטרילי (1.5 מיליליטר נפח גדול יותר או בהתאם לנפח כולל הנדרשים) ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צלחות 96-היטב אולא מכילות ישן spheroids 4 ימים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, להסיר בעדינות 100 μl / טוב של מדיום גידול מהצלחות אליפטית. לזווית שלב זה הטיפים לקראתיקיר nside של בארות U-התחתונה, הימנעות ממגע עם תחתית הבאר ואת המיקום של spheroids; למזער הפרעה של spheroids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טיפים קרים כקרח, להעביר BMM לצינורות קר כקרח. לפלישה מושרה ציטוקינים או למחקרי הערכת תרופה, להוסיף חומרים כימיים (ב2x הריכוז הסופי) לBMM באמצעות טיפים קרים כקרח. לדוגמא, השתמש גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כדי לעורר את הפלישה של קרצינומה של תאי קשקש CAL S וCAL R. מערבבים היטב על ידי מתערבל בעדינות, הימנעות היווצרותן של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לוותר על BMM 100 μl לתוך הבאר U-התחתונה, מכוון את הקצה לכיוון הקיר הפנימי של הבאר. צעד זה הוא קריטי ביותר כ, לניתוח תמונה אופטימלי, spheroids חייב להישאר במרכז גם 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.6 עבור כל הבארות הנדרשות, המאפשרות 5-6 חזרות / מצב. במידת צורך, לשנות לקצה טרי מצונן. הערה: כאשר מנוסה יותר, dispense BMM בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית, להסיר בועות, אם קיימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית לבדוק שspheroids נמצא במיקום מרכזי. אם לא, צנטריפוגות הצלחת ב XG 300 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס. זה יבטיח כי spheroids נמצאים במיקום מרכזי בכל טוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת לחממה על 37 מעלות צלזיוס ולאפשר BMM כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שעה מאוחר יותר, בעזרת פיפטה רבה, בעדינות להוסיף 100 μl / טוב של מדיום גידול שלם. ללימודי פלישה או הערכת תרופה מושרה ציטוקינים, כוללים ציטוקינים או מעכבים במדיום (1X ריכוז סופי). לחלופין, אם ריאגנטים לא התווספו לBMM בשלב 2.5, להוסיף אותם למדיום בשלב זה (3x הריכוז הסופי הרצוי). </li></ol> תמונה אוטומטית 3. רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות סריקה בcytometer (למפרטים ראו טבלה של ציוד וחומרים) בSTA מרווחיםrting מהזמן אפס (t0 = יום של assay הפלישה הקים, מייד לאחר שלב 2.10 עד 72 שעות, או 96 שעות לשורות תאי גידול פולשים איטיות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את היישום &#39;Confluence&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שאליפטית היא בפוקוס ו, במידת הצורך, להתאים באופן ידני ולתקן את &quot;הפוקוס יצא-&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;הגדרות דגימה&#39;, בחרו לסרוק שדה מרכזי אחד של תצוגה (FOV). בעקבות בנוסף BMM, spheroids גידול צריך נותר בעמדה מרכזית, ובכך אין צורך לסרוק את כולו גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, להגדיר את הבארות לסריקה על ידי הדגשה אותם על מפת הצלחת. לחץ על &quot;התחל סריקה&quot;. הערה: הסריקה תישמר באופן אוטומטי וניתן לסקור מאוחר יותר off-line. </li></ol> 4. ניתוח תמונה אוטומטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר יישום &#39;Confluence&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;ניתוח&#39;, להתאים ישימיםהגדרות ני (למשל, &quot;דיוק&quot;: נמוך, רגיל, גבוה; &quot;סף עוצמה&quot;: 1 - 15) כדי לייצר פילוח מדויק סביב אליפטית, כוללים תהליכים בתא וinvadopodia הארכה לBMM (ראה איור 1). התאם את ההגדרות עבור כל שורת תאים סרטניים ו / או בנקודות זמן שונות. אמצעי &#39;Confluence&#39; יישום% מהשטח גם מכוסה על ידי התאים הפולשים, בFOV נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהגדרות הניתוח מתאימות (כלומר, הפילוח מדויק) לspheroids האחר בצלחת על ידי לחיצה על כמה בארות שונות. אם הפילוח לא מדויק להתוות אליפטית, להתאים את הגדרות יישום נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל ניתוח&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;התוצאות&#39;, לבדוק בארות מרובות כדי לוודא את איכות ניתוח. &quot;הנתונים ובכן רמה &#39;יצוא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Repeaניתוח לא לכל נקודות הזמן. חשב את מפגש% הממוצע לבארות לשכפל ופלישת עלילה (מפגש%) נגד זמן בתרשים בר, באמצעות גרפים מדעיים ותוכנות סטטיסטיות של בחירה. </li></ol> 5. תמונה ידנית רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט תמונה לכל אליפטית גידול במרווחים החל מt = 0 עד 72-96 שעות, בהתאם למהירות של פלישה של הקו הסלולרי בשאלה, באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (לצלחת 96-היטב זה לוקח בערך 20 - 30 דק &#39;). השתמש אובייקטיבי 10X. השתמש אובייקטיבי 4X כאשר האזור פלש גדול מדי כדי לנפול בפח לחלוטין בתחום 10X מבט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל את כל תמונה בנפרד רכשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכיול, לקחת תמונות של רשת הגאוגרפית שלב (1 מ&quot;מ) בשתי מטרות 10X ו4X (ולשמור את התמונות). </li></ol> 6. ניתוח תמונה ידני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונות רשת הגאוגרפית שלב לתוך תוכנת ניתוח תמונה של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את gratמדידות icule, היחידות (מיקרומטר), מטרות שימוש (10X או 4X) ולבצע את הכיול. צעד זה נדרש רק פעם אחת. לניתוח תמונה שלאחר מכן, פשוט לטעון מחדש את הגדרות כיול הנדרשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונות assay פלישה ובחר את הגדרות הכיול בהתאם למטרת מיקרוסקופ (10X או 4X) משמש כדי לקבל את התמונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לייבא תמונות שהתקבלו בהדמית cytometer (שלב 3) ולנתח באופן ידני, כפי שתוארו עבור תמונות המתקבלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (ראה תוצאות מוצגות באיור 3 ואיור 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את השטח המכוסה על ידי spheroids. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה המשמשת כאן לנציגי התוצאות (למפרטים ראו טבלה של ציוד וחומרים), ללכת ל&#39;מדוד &#39;ובחר&#39; רוזן / גודל &quot;. בחרת &#39;קובץ&#39; ולאחר מכן &#39;הגדרות טען&#39; ובחר אסא-שנקבע מראשהגדרות y. לאחר מכן בחר &#39;רוזן&#39;. אליפטית אמורה להיות מפולח בצורה מדויקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין ללכת ל&#39;ערוך &#39;ולאחר מכן&#39; צייר / מיזוג אובייקטים &quot;לפתוח חלון&quot; שרביט קסמים / עקבות &#39;. השתמש בסמן השרביט ללחץ על תמונת אליפטית ולקבל פילוח. בחירה &#39;עקבות&#39; (בחלון &#39;שרביט הקסמים&#39;) מתאר באופן ידני אליפטית באמצעות עכבר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות יצוא של פרמטרים שונים (אזור, קוטר, היקף וכו &#39;) לגיליון אלקטרוני. שיא בגיליון האלקטרוני המידע על תמונה הרלוונטית (למשל, גם מספר, נקודת זמן היחסית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה האזור הממוצע של spheroids לשכפל (פלישה) לעומת זמן באמצעות גרפים מדעיים ותוכנה סטטיסטית. לחלופין, לחשב את השינוי בשטח אליפטית בכל נקודת זמן, יחסית לאזור בזמן t = 0. ואז פלישת עלילה (t0%) לעומת זמן כמו הגר&quot;א ליניאריph. </li></ol>

<ol>
	<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays.">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li><li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma:+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling.">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device.">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).</li><li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+the+microenvironment:+plasticity+and+reciprocity.">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li><li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion.">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415 (2009).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems:+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model.">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li><li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li><li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells.">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).</li><li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels.">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation.">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li></ol>

כל המחברים מצהירים שום ניגוד מתחרה של עניין.

שני דגמי הגידול מתוארים כאן (גליובלסטומה וSCCHN) נבחרו במיוחד כדי להדגים assay 3D שלנו כפי שהם קליניים סרטן פולשני המקומי רלוונטי עם צורך מסופק לטיפולים יעילים 12. בעקבות טיפול תרופתי, הערכה במבחנה שינויי pharmacodynamic סמן ביולוגי (PD) יכול להתבצע בקלות על ידי כתם או immunoassays של lysates המערביים בעקבות השימוש בחומרים כימי זמינים מסחרי ספציפיים כדי לאפשר התאוששות תא מBMM ו / או ניתוח immunofluorescent של פלישת spheroids גידול על ידי כל צביעת הר. assay הפלישה זוהי טכניקה שימושית להערכה מהירה ושחזור של פלישת תאים סרטניים למדיום מוצק למחצה, ולכן מתאימה במיוחד לעתיד בהקרנת סמים מבחנה. תאים סרטניים לפלוש המטריצה ​​באופן 3D כפי שהם פרושים מ&quot; מיקרו-גידול &quot;, מיוצג על ידי אליפטית הגידול, ולהרחיב לextracellulסביבה כמו מטריקס-AR. תלת-ממדית האמיתית של assay ניכר במורפולוגיה התא, שהוא שונה מהמורפולוגיה השטוחה, תאים חסיד להניח בעת מעבר על מצע מוצק. התואר של פלישה הוא לכמת בקלות תוך שימוש בהדמיה cytometer, המאפשר אוטומטי לקריאה החוצה, או על ידי שימוש במיקרוסקופ רגיל בשילוב עם תוכנת הדמיה. יתר על כן, שיטה זו מתאימה להדמיה ניאון 13 (לדוגמא עם שורות תאים לבטא חלבונים או ניאון מראש שכותרתו עם צבעי ניאון). השיטה היא פשוטה לביצוע עם השלב הקריטי רק מיוצג על ידי התוספת של BMM, כאשר קיים סיכון של הפרעה לעמדה של אליפטית במרכז בצורה U-היטב. זה יכול לגרום לניתוח תמונה הכי מוצלח, עם spheroids במטוסי מוקד שונים. לכן זה קריטי כדי להוסיף BMM בזהירות ולאט לאט זה טוב. לאחר תוספת BMM רצוי כדי לבדוק את הצלחתתחת מיקרוסקופ ואם הלוקליזציה נחשבת מקובלת, זה ניתן לתיקון על ידי צנטריפוגה העדינה. עם ניסיון, זה רק לעתים נדירות יש צורך. בעוד ששיטה זו היא חזקה ומאוד לשחזור, וריאציה בין-ניסיונית עלולה להתרחש עם קבוצות שונות של BMM. כדי להימנע מכך, מומלץ לרכוש BMM מספיק מתצווה אחת כדי להשלים סדרה של מחקרים. מגבלה של השיטה (כמו לכל מבחני כאלה) היא הקושי בהבחנה בין הפלישה והתפשטות, שתאי הגידול צפויים לעבור במהלך מסגרת זמן assay. למרות זמן ההכפלה של תאים יכול להילקח בחשבון, או מעכבי מחזור התא כגון cytochalasin D הציגו, זה לא קל לשלוט או בבירור להבחין בין שני היבטים שונים אלה של התקדמות גידול, במיוחד לתאי גידול גדלו במהירות ועבור אלה ש יש דפוס יותר &quot;רחב&quot;, ולא הסתנן, פלישה. מהסיבה הזוהוא הציע שassay צמיחת 3D מקביל מתבצע כדי לבדוק את ההשפעות ספציפיות של כל סוכנים מעכבים או גירוי. אם מחקרי תגובת מינון זהיר מבוצעים, זה עשוי להיות אפשרי כדי לבחור ריכוזים שלמזער את ההשפעות על התפשטות. לדוגמא שהראינו כי Hsp90 מעכב 17-AAG מעכב U-87 פלישת אליפטית גידול MG 3D כבר בשעה 24 ובריכוזים נמוכים ריכוז עיכוב צמיחת 3D ב -50% (GI 50) 12. מצד השני, את המשמעות של assay זה בהשוואה למבחני פלישה סטנדרטית אחרים (למשל, מבחני סינון מבוסס או פלישה של תאים בודדים למטריצות 1 3D), הוא שתאים סרטניים לפלוש לתוך המטריצה ​​מקיפה מאליפטית, שדומה &quot; מיקרו-גידול &quot;או&quot; מיקרו-גרורות &quot;, ולכן לוקח בחשבון היבטים חשובים של הפתופיזיולוגיה של מסת גידול. אנו מציגים השיטה מספקת מידע עלהתנהגות קולקטיבית של תאים סרטניים, כאשר בתחילה לעזוב את spheroids, וגם באופן אישי, כאשר תאים בודדים להגיע אזורים מרוחקים יותר בBMM. בנוסף, תאים בתוך הגידול spheroids עלולים לחוות מחסור היפוקסיה ומזין אשר, דרך שינויים בביטוי גנים, יכול לקדם את ההגירה ופלישה; תכונות כגון נעדרות במבחני 2D. יתר על כן, כל זה הוא זמין בפורמט תפוקה גבוהה באמצעות השימוש בלוחות 96-גם ספציפיים וטכנולוגיית ההדמיה האחרונה, מאפשר assay 3D מורכב יותר לשמש בקלות ביעד אימות וגילוי תרופות. אנו מציגים שיטה יכולה להכיל יישומים נוספים כדי לטפל בהיבטים נוספים של פלישת תאים סרטניים. בפרט, מורכבות נוספת ניתן בחזון על ידי התוספת של תאי מארח, כגון fibroblasts ו / או בתאי האנדותל, לעצמו או אליפטית המטריצה ​​שמסביב. זה גם יכול להיות שונה, לא רק במונחים של נוקשות (על ידי השימוש בשיתוף שונהncentrations של BMM), אלא גם במונחים של הרכב (על ידי התוספת של רכיבים אחרים תלויים ברקמה / איבר המסוים של המודל שאומץ על הגידול: למשל, tenascin לסרטן המוח 16 וקולגן לסרטן השד 17). הגדרה דומה (דור של spheroids והדמיה) יכולה גם להיות מותאם כדי להעריך פלישת רקמה ב3D, שבו spheroids גידול הוא שיתוף תרבותי עם גופי embryoid הדומים רקמה מורכבת 12 או עם organoids תא ספציפי אחר (למשל, האסטרוציטים ל תרבויות גליומה 18 או קריפטה לסרטן במערכת העיכול), אבל עבודה נוספת נדרשת על מנת לאפשר ניתוח תמונה אוטומטי.

פיתוח תרופות נגד הסרטן קלאסי הוא ממוקד במידה רבה על השימוש במבחני חוץ גופייה מבוסס תאים למסך לחומרים ציטוטוקסיים המעכבים התפשטות תאים סרטנית ו / או לקדם מוות מתוכנת של תאים (אפופטוזיס). לאחרונה, מאמצים עברו לטיפולים ממוקדים בפיתוח מעכבי הגורמים המולקולריים שבבסיס של התפשטות תאים ממארת. למרות כמה תוצאות מרהיבות, סוכנים כאלה הקשורים לעתים קרובות עם ההתפתחות המהירה של עמידות לתרופות. בהתחשב בכך שזה הפוטנציאל פולשני וגרורתי של תאים סרטניים שאחראית למרבית מקרי מוות מסרטן, וכי מחלת הישנות לעתים קרובות מציגה פנוטיפ אגרסיווי יותר, זה הגיוני גם לשקול משלים במודלים ניסיוניים מבחנה 1,2 לזהות רומן סוכנים שימנעו &quot;סימני ההיכר&quot; אלה נוספים מפתח של הסרטן. במהלך התקדמות ממארת, תאי גידול לרכושהיכולת לפלוש לרקמות שמסביב ו / או להפיץ לאיברים מרוחקים (גרורות). תאים סרטניים לחדור את הקרום במרתף על ידי ההיווצרות של invadopodia 3,4. מבנים אלה מועשרים בסיבים אקטין, חלבוני הדבקה ספציפיים וproteinases וקולקטיביים אחראים לתנועתיות של תאי גידול והשפלה של מטריקס (ECM) 5. Invadopodia להאריך לתוך ECM והם האמינו להיות חשובים לפלישת תאים סרטניים וגם extravasation לערוצי כלי דם, להקל hematogenous הפצה (או הלימפה) וגרורות. שיטות מקובלות כיום להעריך פלישת תאים סרטניים במבחנה כוללת את הבאים. מבוסס transwell או מבחני קאמריים בוידן 2,6 בי השעיות תא בודדות הם זורעים על גבי מסנן מצופה בשכבה עבה של חלבונים המופק מECM. תאים אז לפלוש ולעבור לתא התחתון בתגובה לכימותרפיה-attractant. ECM הנפוץחלבונים הם סוג אני קולגן, או מטריצת מרתף כמו קרום (BMM, למשל, Matrigel, הנגזרת מהגידול EHS 7) המחקה את ההרכב הטבעי של ממברנות מרתף. כחלופה למבחני סוג תא וידן מבוססת מסנן 8, יכולים להיות שנזרעו תאים על גבי ג&#39;ל ECM (שניתן להוסיף fibroblasts) שבו הם יוצרים monolayer ולאחר מכן בנפרד או ביחד לפלוש לתוך הג&#39;ל. פלישה ניתן למדוד במונחים של מספר התאים פולשים ו / או מרחק שעובר ממשטח ג&#39;ל 9. תאים סרטניים יכולים גם להיות מוטבעים לחלוטין לתוך מטריצה ​​או כהשעית תא בודדת או כspheroids - בדרך כלל ממוקם בין שתי שכבות של ג&#39;ל ECM מאפשרות לתאים לפלוש מחוץ למסת הגידול לתוך המטריצה ​​מקיפה 2,6,10,11. Assay תלת ממדי (3D) אליפטית גידול הפלישה המתוארת כאן מספק מערכת מהירה, automatable פלישה באמצעות highlשיטת y לשחזור, סטנדרטית 12 בפורמט צלחת 96-היטב עם אליפטית אחד בכל טוב. BMM מתווסף כל גם ישירות לספק מטריצת חצי מוצקה שאליו תאים סרטניים לפלוש מהגוף אליפטית. של פלישת תאים סרטני המידה מנוטרת במרווחים על פני תקופה של 72-96 שעות. שיטה זו מספקת את היתרונות הבאים על מבחני פלישה הנוכחיים במבחנה שהוזכרו לעיל: גידול תאים מאורגנים במבנה 3D מחקה מייקר אזור גידול או מיקרו-גרורות; spheroids הגידול הוא מאוד לשחזור בגודל; assay הפלישה מתבצע באתר באותה הצלחת כמו פיתוח אליפטית גידול, ללא הצורך להעביר אותם לצלחות המשניות; השיטה, בשילוב עם הטכנולוגיות החדישות ביותר של ניתוח תמונה אוטומטי, מאפשרת הן תכולה גבוהה ותפוקה גבוהה מנתח של פלישת תאים סרטניים. ניתוח התמונה מתבצע באמצעות הדמיה cytometer, אשר סורק 96-היטבצלחת בתוך 10 דקות. על ידי שימוש ביישום המפגש, השיעור של פלישת המידה ולהשיג גם על ידי תאים בודדים או על ידי צבירי תאים מתפשטים החוצה מspheroids הגידול ופולש לתוך המטריצה ​​ניתן למדוד באופן דינמי. לתפוקה נמוכה יותר, שיטה חלופית לניתוח תמונה מוצגת, המבוססת על השימוש במיקרוסקופ הפוכה ותוכנת הדמיה סטנדרטית.

<table><tbody><tr><td>Corning Matrigel basement membrane matrix</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Corning</a></td><td>354234</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td></tr><tr><td>Cultrex basement membrane extract, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment 96-well plate</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>Add 100 &amp;mu;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &amp;mu;g EGF. To 25 &amp;mu;l of this, add 4,975 &amp;mu;l RHB-A medium to give a 5 &amp;mu;g/ml working stock. Aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RHB-A medium</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>For diluting EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>Heat at 56 &amp;deg;C to inactivate complement before use</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>Cell dissociation solution</td></tr><tr><td>Celigo cytometer</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td></tr><tr><td>IX70 inverted microscope</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>Used with camera for manual image capture</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>Attached to microscope for manual image capture</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Software used to control camera and microscope for manual image capture</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>Scientific graphing and statistical software</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>Scientific graphing and statistical software</td></tr></tbody></table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

פלישה של רקמות הסובבות נורמליות נחשבת בדרך כלל להיות סימן היכר מרכזי של ממאיר (בניגוד לשפיר) גידולים. לסוגים מסוימים של סרטן בפרט (לדוגמא, גידולים במוח כגון multiforme גליובלסטומה וקרצינומה של תאי קשקש של הראש וצוואר -. SCCHN) הוא סיבה לתחלואה קשה ויכולים להיות גם בהיעדרו של גרורות מרוחקות סכנת חיים. בנוסף, סרטן שההישנות לאחר טיפול למרבה הצער לעתים קרובות נוכחי עם פנוטיפ אגרסיווי יותר. לכן, יש הזדמנות למקד את התהליך של פלישה לספק טיפולים חדשניים שיכול להיות משלימים לסוכנים אנטי-שגשוג סטנדרטיים. עד עכשיו, אסטרטגיה זו כבר הקשתה על ידי חוסר מבחני חזקים, שחזור מתאימים לניתוח מפורט של פלישה ולהקרנת סמים. כאן אנו מספקים שיטת מיקרו-צלחת פשוטה (המבוסס על מדים, spheroids גידול 3D להרכבה עצמית) שיש לו פוטנציאל גדול לסטו כגוןמת. אנחנו מדגימים את פלטפורמת assay באמצעות קו אנושי תא גליובלסטומה וגם מודל SCCHN בי הפיתוח של התנגדות נגד הקולטן לגורם צמיחת אפידרמיס ממוקד מעכבים (EGFR) קשור עם פוטנציאל מטריצה ​​פולשנית משופר. כמו כן אנו מספקים שתי שיטות חלופיות של כימות חצי אוטומטי: אחת באמצעות הדמיה cytometer ושני שפשוט דורש ללכוד מיקרוסקופיה ותמונה רגילה עם ניתוח תמונה דיגיטלי.

פלישת אליפטית גידול 3D נבחנת באמצעות שיטה פשוטה, לשחזור, אוטומטית מאוירת באופן סכמטי באיור 1: spheroids גידול reproducibly בגודל מתקבל על ידי תאי ציפוי לאולא 96-גם צלחות תחתית עגולות. spheroids הודעה הייזום-4 ימים מוטמע בBMM. זה מספק מבנה מוצק למחצה לתוכו תאים סרטניים לפלוש ופרושים של אליפטית. Spheroids נמצא במיקום מרכזי בבסיס של כל טוב והפלישה לBMM מנוטר בקלות במרווחים החל מt = 0 עד 72-96 שעות באמצעות הדמיה cytometer. זה יכול לספק ניתוח תמונה אוטומטי לחלוטין. דוגמאות לסוגים שונים של פלישת תאים הסרטניים של מומחשות באיורים 2 -. 4 multiforme גליובלסטומה אדם הקו הממאיר ביותר (GBM) התא U-87 MG, יוצר מבנה 3D הדוק, כדורי ומשמש כאן כדי להדגים גידולים במוח שבו מקומי פלישה היא סכנת חיים מפתחתכונה. משובץ ברגע בBMM, ​​תאים מspheroids U-87 MG התפשט עם דפוס פלישה טיפוסי &quot;מספרים&quot; 12. תאי גידול להאריך רדיאלית לתוך המטריצה ​​שבה הם שומרים על צורה 3 ממדים. התהליך אחרי על פני תקופה של 72 שעות, כפי שמוצג באיור 2 לU-87 spheroids MG, כאשר היקף פלישת תאים סרטניים, עם פרטים של התהליכים התאיים וinvadopodia הארכה לBMM הוא ברור מאליו. באופן מלא אוטומטי ניתוח תמונה באמצעות תמונה cytometer מאפשר כימות מדויק של פלישת התאים הסרטניים לאורך זמן. הכימות באיור 2 מתקבל כפי שמודגם באיור 1, שבו הניתוח האוטומטי מייצר פילוח סביב בליטות תא הארכה לBMM מ- 87 U MG גוף אליפטית. שים לב שעבור קו תא זה, גוף אליפטית הגידול נכלל במדידה של האזור פלש. דפוס של invas שונההיון הוצג על ידי שורות תאי הסרטן אנושיות קשקש של ראש וצוואר. CAL S וCAL R הוא isogenic אבל CAL S הוא רגיש ל, וCAL R עמיד למעכבי טירוזין קינאז EGFR 14. בהעדר EGF, שורת תאים לא פלשה לBMM (איור 3) עם זאת, כריכוז של EGF הוגדל (2.5 ng / ml), spheroids נראה &#39;ניצן&#39;. בריכוזים גבוהים יותר של EGF (מיליליטר / 40 ו- 80 ng) את מידת הפלישה הופחת. זה עולה בקנה אחד עם התגובה הקלסית דמוי פעמון המינון לEGF במונחים של פלישה שכבר דווחה בעבר 15. ב 20 ng / ml EGF, בליטות כמו אצבע-נמתחים מהגוף העיקרי של spheroids CAL R תוך תאי CAL S היו פחות פולשני לאחר 72 שעות (איור 3). פלישת ההפרש הזה הייתה ברורה 48 שעות לאחר spheroids הונח לBMM (המכיל 20 ng / ml EGF להבחנה המרבית בין שורות תאים) והגדול ביותר אחרי 72 שעות (איור 4). תמונות אלה נרכשו במהירות באמצעות הדמיה cytometer, כלU-87 MG. עם זאת, במקרה זה, כדי להדגים שיטה חלופית, את מידת הפלישה הייתה לכמת באופן ידני באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עצמאית ומוצגת באופן גרפי (איורים 3 ו -4). תוצאות אלו ממחישות את הבדל בין תאי פנוטיפי תרופה רגישים ו-resistant שיכול להיות מנוצל כדי להקרין לתרכובות שדווקא שנאה מצד פנוטיפ עמיד, פולשני הסמים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> איור 1. סקירה סכמטי של assay פלישת אליפטית גידול 3D. העבודה מציגה את שלבי השיטה כרוכה כולל תמונות נציג של spheroids U-87 MG גליובלסטומה רק לאחר ההטבעה לתוך BMM (פנל עליון; t = 0) ולאחר פלישה<html> לBMM (פנל תחתון; t = 72 שעות) עם ובלי הפילוח המודד את האזור המכוסה על ידי התאים הפולשים. בר = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> כימות איור 2. זמן-במהלך פלישת U-87 MG אליפטית גליובלסטומה לBMM. U-87 MG אליפטית פלישת 3D לBMM הייתה פיקוח ולכמת עד 72 שעות באמצעות הדמיה cytometer. () תמונות ונציג (ב) פלישת תאים סרטניים מוצגת. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מחדש 3 &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 52,686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. CAL R (עמיד) וCAL S פלישה (רגישה) אליפטית גידול. (א) נציג תמונות וכימות ידני של R EGF תלוי מינון CAL ופלישת אליפטית גידול CAL S (B) מוצגים. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> איור 4. תאים מCAL R spheroids (עמיד) הם יותר חודרני מאשר S spheroids גידול CAL (רגיש) כאשר הניחו BMM. עם spheroids גידול גירוי EGF CAL R להראות פלישה בולטת יותר מאשר כאל S. (א) נציג תמונות וכימות ידני של פלישה (B) מוצג. בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

57.0K Views.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Video: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Cancer Research

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

מודלים תלת-ממדיים בביולוגיה של סרטן: דינמיקת פלישה בהטרוספרואידים

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

מחבר זרקור: פענוח ההצלבה בין סרטן לתאי מערכת החיסון במהלך התקדמות סרטן הראש והצוואר

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D