אנו מבקשים להודות ש-Taneja Bageshwar, ק Beifuss, ש Kedroske, ו HC. סיאו לדיונים מועילים. עבודה זו מומנה על ידי סטארט אפ קרנות מהמחלקה TAMHSC לרפואה מולקולרית תאית. היקף המתחם דיסק ספינינג נרכשו במימון המחלקה לבין משרד TAMHSC של הדיקן. זנים מסוימים סופקו על ידי גנטיקה Caenorhabditis מרכז, אשר ממומנת על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר. pRF4 (רול-6 (su1006)) הייתה מתנה האש א.

1. הכנת DiI כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של DiI 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(Biotium, Inc, הייוורד, קליפורניה) ב DMF. DiI אור רגישים, כל כך להגן DiI מן האור על ידי לפפה בנייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור דילול העבודה של DiI ידי הוספת 0.6 μL מניות DiI ל 399.4 M9 μL לכל אוכלוסיית. זה אמור לתת דילול עובד הסופי של 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DiI ב M9. זה יכול להיות scaled עד מכתים עבור אוכלוסיות מרובות בו זמנית. מגן DiI מן האור על ידי עטיפת הצינור (ים) בנייר. </li></ol> 2. הכנת נמטודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צלחת 60 מ&quot;מ המכיל אוכלוסיית נמטודות מזוהמת. לשטוף חיות מהצלחת באמצעות פתרון של 0.5% טריטון X-100 במאגר M9 ידי בעדינות מתערבל נוזל בתנועה מעגלית על פני הצלחת לשחרר את כל החיות הזחל ואת הבוגר. העברת לשטוף לתוך צינור סטרילי 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד ספין למטה החיות בסל&quot;ד 2000 למשך 30 שניות. הסר וזורקים כמה supernatant ככל האפשר מבלי להפריע המונית של בעלי חיים בתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את טריטון שיורית X-100, יש לשטוף באמצעות בעלי חיים M9 חיץ, ספין, ולהסיר supernatant. חזור על פעולה זו פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 400 μL של פתרון DiI עובד M9 אל הצינור בקצרה מערבולת כדי resuspend חיות הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צינור ב 20 מעלות אופקית במשך 3 שעות ב 350 סל&quot;ד בסביבה אור המוגן. אם תרצה, בעלי חיים יכול להיות מודגרות עד 16 שעות מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את כמות צבע מאוגד, ספין למטה החיות בסל&quot;ד 2000 למשך 20 שניות. הסר וזורקים כמו supernatant האפשר מבלי להפריע המונית של בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים Resuspend במאגר 400 M9 μL ויוצקים נוזלי על חלק חיידק חינם של צלחת אגר NGM seeded עם OP50 E. coli. אפשר חיות להתאושש לפחות 30 דקות. בזמן התאוששות החיות צריך לזחול ולהתרחק הנוזל מכתים DiI ואל המזון. שלב זהמפחית את הקרינה הרקע DiI חינם. </li></ol> 3. הרכבה והתבוננות דגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אגר 4% במים באמצעות החיטוי או מיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מפרידי לשימוש חוזר, אשר ניתן להשתמש בהם על מנת להבטיח עובי אחיד של כרית אגר, על ידי שכבות שתי חתיכות של נייר במעבדה על זכוכית שקופית. בצע שתי שקופיות spacer מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר שקופיות זכוכית נקייה בין שתי שקופיות spacer. פיפטה כ - 150 μL (ארבע טיפות) של אגר 4% מותכת על המרכז של השקופית זכוכית נקייה. במהירות לכסות את אגר מותכת באמצעות שקופית נוספת כדי ליצור משטח אגר. בזהירות להסיר את השקופית לכסות, לשמור על כרית במרכז החלק העליון של השקופית גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה על μL 5 של נמטודות הרדמה (100 מיקרומטר - 1 levamisole מ&quot;מ, למשל) על גבי משטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 8-12 חיות ההרדמה ומכסים coverslip מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ המתחם או confocal מצויד objecti לפחות 40X<html> יש ו DSRed / TRITC (או אחרים תואם) לסנן. מרבית הקרינה של עירור DiI הוא 549 ננומטר שלה היא פליטה מרבי 565 ננומטר עבור צבע כבול (Biotium, Inc, הייוורד, קליפורניה). </li></ol> 4. נציג תוצאות כתמים DiI את הקוטיקולה של ג wild-type ו מוטנטים elegans. המשטח מכיל cuticular annuli מופרדים על ידי תלמים היקפיים ו, ​​בשלבים מסוימים, רכסי האורך נקרא alae. כל שלב התפתחותי יש מבנים cuticular עם קומפוזיציות שונות 2. רכסי או תלמי alae והן annuli fluorescently כתם, תלוי בהרכב פני השטח, לאורך כל שלבי הזחל לבין הבוגר נשארות גלויות עד יום אחד לאחר התאוששות באמצעות שיטה זו. Speckles רקע פלורסנט הם נצפו לעתים (איורים 2F, G), אך לא שגרתי (איור 1, איור 2A-E, H, I). כל התמונות צולמו עם דיסק confocal ספינינג או, כאשר ציין, widefield (WF) מיקרוסקופיה המתחם. אף אוזן גרון &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig1.jpg" /> באיור 1. כתמים DiI לציפורן ונוירונים חשופים לסביבה. L2 חיה הבמה. 630x ההגדלה. תמונה חלקי פסיפס נתפסו באמצעות iVision-Mac תוכנה (BioVision טכנולוגיות, Exton, הרשות הפלסטינית). תמונות הצטרפו באמצעות Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc, בסן חוזה, קליפורניה). בר סולם = 10 מיקרומטר. DiI גם fluorescently כתמים amphid ואת עצב סנסורי phasmid בראש הזנב בהתאמה (חיצים לסמן כמה). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig2.jpg" /> באיור 2. DiI fluorescently כתמים ג elegans לציפורן בכל שלבי הפיתוח שלאחר עובריים. 630x ההגדלה. בר סולם = 10 מיקרומטר. הכתמה של wild-type בעלי חיים) L1; B) L2; C) dauer: D) L3; E) L4, ו-F) בשלבים הבוגרים. רכסים alae ו טבעתי מוכתמות fluorescently בחיות L1 ו dauer (A, C). כתמים DiI רכסים טבעתי בחיות L2(B). טבעתי תלמים כתם L3 ו L4 בעלי חיים (D, E). תלמי alae ו annuli מוכתמות בבעלי חיים מבוגרים (FH). Alae מורכבים שנתיים, חמש או שלוש רכסים (ב L1, dauer, או בבעלי חיים מבוגרים, בהתאמה) כי בטווח של אורך החיה (חיצים) 16. Annuli ליצור רכסים ההיקפי סביב החיה (ראשי חץ, F ו-J). לציפורן של חיות מוטנטים מבוגר להציג מתונה פגמים ארגון cuticular (GH). G) רכסי alae הם רציפה (WF). H) רכסים alae העודפים הם התמזגו קנים או מפוצלת (WF). מוטנטים קולגן גן תערוכה alae פגמים ארגון טבעתי (IJ). אני) אצל בעלי חיים מהונדס overexpressing pRF4 (רול-6 (su1006)), רכסים של שקר alae בזווית לאורך של החיה. J) Annuli ב מהונדס חיות overexpressing pRF4 (רול-6 (su1006)) להציג דוגמה חריגה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig3.jpg" /> באיור 3. תלמיד חצונימבנים מורפולוגיים אל מוארים על ידי מכתים DiI. בהגדלה 630x. ברים סולם = 10 מיקרומטר. DiI גם מדגיש תכונות חיצוניות אחרות, כולל א &#39;) בוגר אנדרוגינוס הפות, ב) זכר בוגר קרני הזנב מעריץ, ו-C) אנדרוגינוס זנב ספייק (מפוצל ברקע הזה מוטציה). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig4.jpg" /> לציפורן איור 4. לוקח יותר זמן עם כתם DiI מאשר נוירונים חשופים לסביבה. 630x ההגדלה. בר סולם = 10 מיקרומטר. אחרי שעתיים של מכתים, amphid (לא מוצג) ו - עצב סנסורי phasmid (חיצים) מוכתמות דיו. לעומת זאת, לציפורן של בעלי חיים צעירים היא רק חלקית מוכתם בכתמים (ראש חץ). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לשטוף </td><td> פתרון כתמים (+ DiI) </td><td> זמן דגירה </td><td> לציפורן מוכתם </td></tr><tr><td> M9 + 0.5% Trעיתון X-100 </td><td> M9 + 0.5% טריטון X-100 </td><td> 2 שעות </td><td> לא </td></tr><tr><td> M9 + 0.5% טריטון X-100 </td><td> M9 + 0.5% טריטון X-100 </td><td> 3 שעות </td><td> לא </td></tr><tr><td> M9 + 0.5% טריטון X-100 </td><td> M9 </td><td> 2 שעות </td><td> חלקי </td></tr><tr><td> M9 + 0.5% טריטון X-100 </td><td> M9 </td><td> 3 שעות </td><td> כן </td></tr><tr><td> M9 + 0.5% טריטון X-100 </td><td> H 2 0 </td><td> 2 שעות </td><td> חלקי </td></tr><tr><td> M9 + 0.5% טריטון X-100 </td><td> H 2 0 </td><td> 3 שעות </td><td> כן </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מכתים Cuticular בתנאים שונים. הדגירה פתרונות שונים פעמים נבדקו כדי לייעל מכתים cuticular בבעלי חיים. H 2 0, מים מזוקקים סטריליים. צביעה חלקית מציין מכתים אחידה של לציפורן הזחל (איור 4), אם כי כתמי לציפורן מבוגר גonsistently.

<ol>
	<li>Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+of+Caenorhabditis+elegans:+its+isolation+and+partial+characterization.">Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).</li><li>Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle+of+Caenorhabditis+elegans.+II.+Stage-specific+changes+in+ultrastructure+and+protein+composition+during+postembryonic+development.">The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development.</a> Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).</li><li>Hall, D., Altun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans Atlas. , (2008).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> The C. elegans Research Community. , (2007).</li><li>Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sqt-1+gene+of+C.+elegans+encodes+a+collagen+critical+for+organismal+morphogenesis.">The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis.</a> Cell. 55, 555-565 (1988).</li><li>Mende, N. v. o. n., Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dpy-13:+a+nematode+collagen+gene+that+affects+body+shape.">dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape.</a> Cell. 55, 567-576 (1988).</li><li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+surface+proteins+of+wild+type+and+mutant+Caenorhabditis+elegans.">Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).</li><li>Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+actin+filaments+in+patterning+the+Caenorhabditis+elegans+cuticle.">The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle.</a> Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).</li><li>Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zona+Pellucida+domain+containing+proteins,+CUT-1,+CUT-3+and+CUT-5,+play+essential+roles+in+the+development+of+the+larval+alae+in+Caenorhabditis+elegans.">The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).</li><li>Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+collagen+genes.+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Genet. 16, 21-27 (2000).</li><li>Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+rol-6+gene,+which+interacts+with+the+sqt-1+collagen+gene+to+determine+organismal+morphology,+encodes+a+collagen.">The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen.</a> Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).</li><li>Thein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exoskeleton+collagen+COL-19:+an+adult-specific+marker+for+collagen+modification+and+assembly,+and+the+analysis+of+organismal+morphology.">Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology.</a> Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).</li><li>McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+sets+of+interacting+collagens+form+functionally+distinct+substructures+within+a+Caenorhabditis+elegans+extracellular+matrix.">Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).</li><li>Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+expression+of+male+copulatory+bursa+surface+markers+in+Caenorhabditis+elegans.">Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 103, 485-495 (1988).</li><li>Tong, Y. G., Burglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+dye-filling+of+sensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).</li><li>Singh, R. N., Sulston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans.">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148, 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

השיטה מכתים DiI המוצג כאן מאפשר דרך מהירה ונוחה יחסית לדמיין את הקוטיקולה של C. elegans. לפי repurposing וייעול שיטת נפוץ נוירונים תמונה חשופה לסביבה החושית 15,17, DiI ניתן להשתמש fluorescently כתם הן alae ומבנים טבעתי (איורים 1 ו -2), כמו גם את הפות, זנב זכר, אנדרוגינוס זנב ספייק (איו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים </td><td> מילים נרדפות </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DiI </td><td> 1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט </td><td> Biotium, Inc </td><td> 60010 </td><td> במלאי דילול: 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DMF דילול עובדים: 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Dimethylformamide </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> Octylphenoxypolyethoxyethanol </td><td> VWR הבינלאומי, LLC. </td><td> EM-9410 </td><td></td></tr><tr><td> M9 </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mM Na 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1mm MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NGM &lt;/ Td&gt; <td> צמיחה נמטודות בינוני </td><td> IPM מדעיים, Inc </td><td> 11006-501 </td><td> יכול להיות מוכן הבאים פרוטוקול NGM אגר 18 </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td></td><td> EMD כימיקלים, Inc </td><td> 1.01614 </td><td> 4% מים </td></tr><tr><td> Levamisole </td><td> Levamisole hydrochloride </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> 31742 </td><td> 100 מיקרומטר - 1 levamisole mM כנדרש </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td></td><td> VWR הבינלאומי, LLC. </td><td> 16005-106 </td><td></td></tr><tr><td> לכסות מיקרוסקופ משקפיים </td><td></td><td> VWR הבינלאומי, LLC. </td><td> 16004-302 </td><td></td></tr><tr><td> מתחם היקף </td><td></td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> A1m </td><td> השתמש המטרות כדי להתאים את הצרכים של הניסוי </td></tr><tr><td> המסנן תואם TRITC או אחרים </td><td> &amp;nbsp; </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> 49005 </td><td> ET - DSRed (TRITC/Cy3) גמגם להגדיר מסנן </td></tr></tbody></table>

visualization of caenorhabditis elegans cuticular structures using the lipophilic vital dye dii

לציפורן של C. elegans הוא מבנה עמיד מאוד שמקיפה את החיצוני של 1-4 בעלי חיים. לציפורן לא רק מגן על בעלי החיים מהסביבה, אלא גם קובעת את צורת הגוף ואת תפקיד תנועתיות 4-6. כמה שכבות מופרש על ידי תאים אפידרמיס מהווים את לציפורן, כולל שכבת השומנים החיצונית 7. רכסים ההיקפי לציפורן הנקרא דפוס annuli אורך החיה נוכחים במהלך כל שלבי ההתפתחות 8. Alae הם רכסי האורך שנמצאים בשלבים מסוימים של פיתוח, כולל L1, dauer, ובשלבים מבוגרים 2,9. מוטציות בגנים המשפיעים על הארגון קולגן cuticular יכול לשנות את מבנה הגוף החי cuticular מורפולוגיה 5,6,10,11. בעוד דימות באמצעות מיקרוסקופ cuticular מתחם עם אופטיקה DIC אפשרי, השיטות הקיימות המדגישות מבנים cuticular כוללים נורותאחוז transgene הביטוי 12, מכתים נוגדן 13, במיקרוסקופ אלקטרונים 1. תווית נבט חיטה agglutinin (WGA) שימש גם לדמיין גליקופרוטאינים cuticular, אבל היא מוגבלת בפתרון מבנים cuticular עדינה 14. הכתמה של פני השטח cuticular באמצעות צבע פלואורסצנטי נצפתה, אך מעולם לא מתאפיין בפירוט 15. אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן של חיים ג elegans באמצעות ניאון אדום lipophilic לצבוע DiI (1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט), אשר נמצא בשימוש נפוץ ב C. elegans לדמיין עצב חשוף לסביבה. זה פרוטוקול אופטימיזציה עבור מכתים DiI היא שיטה פשוטה, חזקים להדמיה ברזולוציה גבוהה הניאון של annuli, alae, הפות, זנב זכר, אנדרוגינוס זנב ספייק ב C. elegans.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI at JoVE.com

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן ב לחיות<em&gt; ג elegans</em&gt; באמצעות צבע אדום ניאון lipophilic DiI (1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט), אשר נפוץ<em&gt; ג elegans</em&gt; לדמיין עצב חשוף לסביבה. באמצעות פרוטוקול זה מותאם, alae ו טבעתי מבנים cuticular מוכתמים על ידי DiI והבחין באמצעות מיקרוסקופ המתחם.

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

visualization-caenorhabditis-elegans-cuticular-structures-using

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

17.0K Views.  Texas A&M University System Health Science Center, College of Medicine. אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן ב לחיות ג elegans באמצעות צבע אדום ניאון lipophilic DiI (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט), אשר נפוץ ג elegans לדמיין עצב חשוף לסביבה. באמצעות פרוטוקול זה מותאם, alae ו טבעתי מבנים cuticular מוכתמים על ידי DiI והבחין באמצעות ?...

Video: Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; Ambystoma מקסיקניום</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

דיסקציה ידנית של Caenorhabditis elegans מעיים

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures the interaction of homologous chromosomes is the assembly of the synaptonemal complex (SC) in meiotic prophase I. Even though there is little sequence homology between protein components within the SC among different species, the general structure of the SC has been highly conserved during evolution. In electron micrographs, the SC appears as a tripartite, ladder-like structure composed of lateral elements or axes, transverse filaments, and a central element. 
However, precisely identifying the localization of individual components within the complex by electron microscopy to determine the molecular structure of the SC remains challenging. By contrast, fluorescence microscopy allows for the identification of individual protein components within the complex. However, since the SC is only ~100 nm wide, its substructure cannot be resolved by diffraction-limited conventional fluorescence microscopy. Thus, determining the molecular architecture of the SC requires super-resolution light microscopy techniques such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated-emission depletion (STED) microscopy, or single-molecule localization microscopy (SMLM). 
To maintain the structure and interactions of individual components within the SC, it is important to observe the complex in an environment that is close to its native environment in the germ cells. Therefore, we demonstrate an immunohistochemistry and imaging protocol that enables the study of the substructure of the SC in intact, extruded Caenorhabditis elegans germline tissue with SMLM and STED microscopy. Directly fixing the tissue to the coverslip reduces the movement of the samples during imaging and minimizes aberrations in the sample to achieve the high resolution necessary to visualize the substructure of the SC in its biological context.

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-resolution microscopy can provide a detailed insight into the organization of components within the synaptonemal complex in meiosis. Here, we demonstrate a protocol to resolve individual proteins of the Caenorhabditis elegans synaptonemal complex.

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...