Name: dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי בית החולים בריגהם &amp; נשים ואת מצעד של דיים. המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה הלבנה על תמיכתם ועצתם.

כל הניסויים axolotl בוצע בהתאם בית החולים בריגהם של נשים (BWH) מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. 1. הגדרת ניסוי perfusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים axolotl מבוגר במיכל פלסטיק מלא עם פתרון 0.1% tricaine (MS222) במשך 15-20 דקות או עד הרדים לחלוטין. ודא כי מיכל מלא פתרון tricaine מספיק כך axolotl הוא שקוע לחלוטין. הערה: יש לבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים. ב BWH, axolotl נחשב להרדים לחלוטין כאשר הוא נכשל מבחן רגל קמצוץ, כלומר אין תנועה רפלקסיבית כאשר כף הרגל הוא סחוט בעדינות. זהירות: למרות tricaine הוא חומר הרדמה המשמש במיוחד עבור אורגניזמים מימיים, מגע ישיר העור עם פתרון tricaine יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תחנת זלוף axolotl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אתמשטח סופג על משטח שטוח, שטוח עם הצד סופג כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חור במסגרת קצף פוליסטירן כי הוא בגודל המתאים ואת הצורה עבור axolotl הרדים להניח במצב שכיבה. מניחים את המסגרת על משטח סופג. הערה: ניתן למקם מגבות נייר נוספות מיד מתחת למסגרת לקבלת ספיגה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המשאבה peristaltic עם צינורות זלוף. הגדר את המשאבה בקצב זרימה של 0.7 מ&quot;ל / דקה, זורם בכיוון השעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרון מדולל עם 0.7x PBS ו 5% גלוקוז בתערובת 1: 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 מ&quot;ל של פתרון diluent עם 200 μL של פתרון המניות DiI בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי. כיפה ומערבבים על ידי היפוך. כיסוי זה צינור עם נייר אלומיניום לסכל כדי להגן על פתרון העבודה מחשיפה לאור. הערה: כרכים צריך להיות שונה בהתאם לגודל של axolotl באופן יחסי. ערכים אלה הם עבור axolotl כ 15 ס&quot;מ (אורך snout-to-tail). אנימלים בגודל זה אולי לא הגיעו לבגרות מינית מלאה ולכן המין החיה לא ייקבע בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל עם 0.7x PBS. הערה: PBS ישמש עבור תחול לולאה exxanguination axolotl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המחט 27-מד פר כדי סוף היציאה של צינורות זלוף. מקפלים את כנפי פרפר אחד על השני ומניחים בעמדה מהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקצה החופשי של צינורות זלוף בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי מלא 0.7x PBS ולהפעיל את משאבת זלוף עד צינורות כולו מלא פתרון. להשהות את המשאבה פעם את כל צינורות מלא PBS. הערה: ודא צינורות ללא בועות אוויר בכל עת, כמו אלה יגרום האוויר emboli ב axolotl ולמנוע זלוף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגבת נייר בצורת axolotl בצורת מסגרת קצף פוליסטירן. באמצעות פיפטה העברה, להשרות את המגבת עם פתרון tricaine. הערה: חותכים ריבוע קטן באמצע מגירת הנייראל כדי לאפשר ניקוז של נוזלים במהלך הליך זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שסתום axolotl הרדים על מגבת נייר בתוך מסגרת קצף פוליסטירן. </li></ol></li></ol> 2. פתיחת חזה האקסולוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לצבוט את העור לאורך הציר המרכזי של החזה של axolotl, ממש מתחת לקו הכתפיים. לַעֲקוֹר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לבצע חתך קטן שבו העור כבר משך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פיסת עור מרובעת על החזה כדי לחשוף שתי צלחות סחוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור כדי לפתוח חלון מעל חלל בית החזה גדול מספיק כדי לראות בבירור את הלב כ 5 מ&quot;מ של אבי העורקים הסתעפות של הלב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקרוע את רקמת החיבור באמצעות מלקחיים או מספריים סגורים על מנת למנוע חיתוך כל כלי הדם העיקריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם כל צלחת הסחוס בנפרד באמצעות מלקחיים ובלו אותם WIth את המספריים כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לצבוט את קרום הלב עם מלקחיים, למשוך למעלה, לנקב אותו באמצעות מספריים כירורגית; חתך זה צריך להיות רק מספיק עמוק כדי לנקב את קרום הלב דק מאוד צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר הסרת קרום הלב. הקפד לא לחתוך את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בעדינות את קרום הלב כדי לחשוף את הלב ואת אבי העורקים. הערה: באמצעות פיפטה העברה, מעת לעת לשטוף את חלל החזה ואת הזימים עם פתרון tricaine לשמור על האזור ברור ולשמור על axolotl הרדים. </li></ol> 3. זלוף של Axolotl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עמדת מהדק עם מחט פרפר טעון ליד מסגרת קצף פוליסטירן, כך זרוע של מהדק יכול בקלות להיות מניפולציה כדי להכניס את המחט לתוך אבי העורקים axolotl. הצבע את קצה המחט לכיוון היבט מקורי של החיה במהלך ההכנסה ולשמור על המחט מקבילים אבי העורקים, כדי למנוע ניקוב זה דרך opצד חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה peristaltic. 0.7x PBS צריך להמשיך לזרום דרך צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך אבי העורקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק את מלקחיים מתחת לקשת אבי העורקים ולמשוך מעט כדי לאפשר גישה קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן את שילוב מחט המחט כך המחט פועל לאורך אורך של אבי העורקים, מצביע לכיוון הראש. הכנס את המחט תוך שימוש במלקחיים עבור תמיכה מאחורי אבי העורקים. הערה: המחט צריך להיות מוכנס עמוק מספיק לתוך אבי העורקים כדי להבטיח שזה לא יחליק החוצה במהלך זלוף. זה יכול להיות על 5 מ&quot;מ עבור 15 ס&quot;מ axolotl. ודא כי המחט היא באופן מושלם בקנה אחד עם אבי העורקים, כדי למנוע לנקב מוחלט של כלי השיט. באמצעות ו-נקבים יכול לגרום דימום מסיבי ולהפחית את שיעורי ההצלחה של זלוף. ההכנסה מוצלחת ניתן לאשר על ידי הגדלה גלוי של אטריה של הלב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר laterate אטריום אחד עם sciSsors ולאפשר דם להתרוקן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף עם פתרון tricaine כדי למנוע הצטברות דם היווצרות קריש בחלל החזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את axolotl עם כ 20-30 מ&quot;ל של PBS. הבהמה צריכה להשתנות מ ורוד בהיר בצבע לבן על זלוף מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את המשאבה peristaltic ולהזיז את הקצה החופשי של צינורות לתוך צינור 15 מ&quot;ל של פתרון DiI. הפעל מחדש את המשאבה, היזהר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את axolotl עם מלאי העבודה כולו של DiI. הערה: ב זלוף מוצלח, axolotl עם שינוי צבע ורוד בהיר של DiI. זה יהיה בולט ביותר הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את המשאבה לאחר זלוף עם DiI הושלם במקום סוף חינם של צינורות לתוך פתרון Paraformaldehyde 4% (PFA) לתקן את הרקמה. הפעל מחדש את המשאבה ואת perfuse לפחות 10 מ&quot;ל של PFA. זהירות: PFA הוא רעיל צריך להיות מטופלים ו dispoSed של כראוי. כפפות וכוסות בטיחות צריך להיות משוחק, ופתרונות צריך להיעשות בתוך מכסה המנוע קטר. זלוף של axolotl עם PFA לתקן את הרקמה תוצאות המוות של החיה. </li></ol> 4. סיום זלוף ההכנה ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic ולהסיר את המחט מן האאורטה axolotl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את axolotl על צלחת פלסטיק. הערה: שימוש של חצי צלחת פטרי גדול עובד היטב ומאפשר לשפוך כמות קטנה של Tricaine או PBS על axolotl כדי לשמור על העור רטוב ולשפר את איכות הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך את כל החומרים בשימוש בפחים פסולת המתאימים. נקי כלים כירורגיים עם אתנול 70%, לחטא באמצעות מעקר זכוכית חרוז בין בעלי חיים, וכן לעקר ידי מעוקר בעקבות ההליך. צנרת צינורות עם פתרון PBS ולאחר מכן לנקז, יבש לחלוטין, ולאחסן לשימוש נוסף. </li></ol> 5. ויזואליזציה של Axolotl perfused <oL&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את axolotl תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות כמו הדמיה של כלי מוכתם DiI הוא מונע על ידי האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ירוק הקרינה הקרינה פליטה קוביית ( למשל ET-CY3) עם מיקרוסקופ confocal לדמיין את כלי הדם של axolotl. השתמש אור עירור 545 ננומטר. הערה: כדי להשיג תמונה באיכות גבוהה, ניתן להשתמש בפרמטרים הבאים: חשיפה ל -1.1 s, רווח של 1x, רוויה של 1.0, הגדלה של 2X. </li></ol>

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ויזואליזציה של כלי הדם של axolotl ניתן להשיג בהצלחה באמצעות זלוף עם צבע lbophilic carbocyanine, DiI. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול חדש עבור זלוף של axolotl עם DiI באמצעות משאבת peristaltic. כמו כן, אנו מראים את ההדמיה שלאחר מכן של vasculature axolotl באמצעות מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. פרוטוקול זה היה הס...

ויזואליזציה של כלי הדם משחק תפקיד חיוני בהבנת המבנה והתפקוד של אורגניזמים על פני מינים רבים. החל מהמאה ה -16 עם לאונרדו דה וינצ&#39;י, נחקרו מודלים וייצוגים גרפיים של המחזור. באמצעות שעווה ותבניות גומי, רקמות היו perfused כדי ליצור מודלים תלת מימדיים של כלי הדם, אשר אפשרה את המחקר של אורגנוזה ו פתוגנזה 1 , 2 . שרפים ושעווה היו בצבע עם צבעים כגון הודו דיו או אדום carmine כדי לאפשר להדמיה קלה שלהם 1 , 2 . עם זאת, טכניקות אלה גרמו לבעיות רבות בגלל צמיגות גבוהה שלהם מנעו זלוף מלא של הרקמה של עניין 1 . ככל שהשדה נעשה מתוחכם יותר, השימוש במיקרוסקופים קונפוקליים ואלקטרוניים נכנס לפעולה, והעביר את הטכנולוגיות של הזלוף<html> Ues במרחק של תבניות יצוק לעבר נוזלים נוזלי של כלי הדם, שחלקם מותר זלוף הדמיה של כלי הדם מבלי להרוס את הרקמה הראשונית 3 . DiI, צבע קרבוזינין פלואורסצנטי, הוא כתם אחד כזה המאפשר זלוף של בעלי חיים ללא נזק לרקמות כלי הדם. צבעים Carbocyanine הם צבעים lipophilic המשלבים לתוך קרום התא על המגע. צבעים אלה מאפשרים מכתים קל מיידית של תאים אנדותל כלי דם, אשר לאחר מכן ניתן לצפות תחת מיקרוסקופ confocal ניאון. DiI נע דרך דיפוזיה לרוחב בקרום השומנים של תאים, כפי שמוצג תיוג ואת מעקב של נוירונים 4 . מבחינה כימית, שתי שרשראות אלקיל של DiI לתת לצבוע את זיקה גבוהה של קרום התא, בעוד שני טבעות מצומדות מ fluorochrome אשר אחראי על פליטת אור אדום אדום כאשר נרגש על ידי מסנני אור פלואורסצנטי ירוק&gt; 4. DiI כבר מנוצל יכולות רבות, כולל תיוג מוצלח של קרום פלזמה וגם אנטרוגרד ו תיוג מדרדר נוירונים 5 , 6 . DiI בעבר נעשה שימוש בפרוטוקולים זלוף תוך הדמיה vasculature של עכברים 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) הם סלמנדרס שחיים אך ורק אגמים מליחים ליד מקסיקו סיטי, מקסיקו. בעלי חיים אלה הפכו למודל חשוב להבנת תהליכי התחדשות, שכן הם יכולים ליצור מחדש את הגפיים המלאות, הזנב (כולל כבל עצב), חלקים של הלב ואיברים פנימיים אחרים, וחלקים בעין כמבוגרים 8 , 9 . בנוסף, עם היישום האחרון של כלים גנטיים ב axolotls, תובנה חסרת תקדים של מולקולות ותאים המניעים תהליכים אלה כעת אפשרי 8 . את regen מוצלחהקצבה של איבר שלם דורש תהליך רחב של רה-וסקולריזציה, אשר עשוי לשחק תפקיד משמעותי התחדשות מעבר פשוט את הפונקציות המסורתיות של כלי הדם במתן חמצן וחומרים מזינים. הבנת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות רקמות היא הכרחית. כלי הדם Axolotl בעבר דמיינו באמצעות הודו דיו, בעוד התוצאות היו מסקרנות, תהליך זה לא היה revisited בעשורים הבאים 10 . ביקשנו להתאים פרוטוקול Diusion זלוף שפותחה לשימוש יונקים כדי לאפשר זלוף מלא ויזואליזציה של כלי הדם axolotl 7 . פרוטוקול זה מתאר את הצעדים שננקטו בהצלחה perfuse ולאחר מכן לדמיין את זרימת axolotl עם טכניקה מכתים DiI. הליך זה יאפשר הדמיה מדויקת של כלי הדם הפטנט ברקמות הומיאוסטיות, כמו גם ברקמות התחדשות, ומספק שיטה חדשה visualisatioN וניתוח של תהליך רה-וסקולריזציה ב axolotl.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Marshall Scientific&amp;nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion tubing</td><td>Excelon Lab &amp;amp; Vacuum Tubing</td><td>436901705</td><td>size S1A</td></tr><tr><td>27g butterfly needle</td><td>EXELint Medical Products</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-Dioctadecyl-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100% vol/vol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Surgical foreceps&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene foam frame</td><td></td><td></td><td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&amp;nbsp; cut out</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent underpad</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard disposable transfer pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Clamp stand</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricaine powder</td></tr><tr><td>Adult axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tanks</td><td></td><td></td><td>Varying size appropriate for the axolotl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Fluorescent Filter</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

טכניקות זלוף שימשו במשך מאות שנים כדי להמחיש את זרימת הרקמות. Axolotl (Ambystoma mexicanum) הוא מין של סלמנדרה שהתגלתה כמודל חיוני ללימודי התחדשות. מעט ידוע על איך מתרחשת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות אצל בעלי חיים אלו. כאן אנו מדווחים על שיטה פשוטה להדמיה של כלי הדם ב axolotl באמצעות זלוף של 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI הוא צבע lbophilic carbocyanine כי מוסיף לתוך קרום פלזמה של תאים האנדותל באופן מיידי. זלוף נעשה באמצעות משאבת peristaltic כך DiI מזין את זרימת הדם דרך אבי העורקים. במהלך זלוף, צבע זורם דרך כלי הדם של axolotl ומשלב לתוך bilayer השומנים של תאים אנדותל כלי הדם על קשר. הליך זלוף לוקח בערך שעה אחת עבור axolotl שמונה אינץ &#39;. מיד לאחר זלוף wiDiI, axolotl ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ה- DiI פולט אור בטווח כתום אדום כאשר מתרגש עם מסנן פלואורסצנטי ירוק. הליך זה זלוף Di ניתן להשתמש כדי לדמיין את המבנה של כלי הדם של axolotls או להדגים דפוסים של רה-וסקולריזציה ברקמות התחדשות.

<html> עם מכתים DiI, vasculature של axolotl ניתן דמיינו בקלות. כלי דם של בעלי חיים perfused עם צבע lipophilic נראים מיד תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. איור 1-1-1.5 הוא ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזלוף. לאחר זלוף עם צבע ורוד בהיר, axolotl perfused בהצלחה יופיע ור?...

Watch this Scientific Journal Video about DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum at JoVE.com

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם.

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; Ambystoma מקסיקניום</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K Views.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם. 

Video: DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

גידול של טטרה מקסיקנית Astyanax mexicanus עבור ניתוח של Post-larval פנוטיפים ואת כולה-הר אימונוהיסטוכימיה

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Genetics

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Developmental Biology

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The cerebral vasculature dynamically responds to various pathophysiological states and it exhibits considerable differences between strains and under conditions of genetic manipulations. Essentially, a reliable technique for intracranial vessel staining is essential in order to study the pathogenesis of ischemic stroke. Until recently, a set of different techniques has been employed to visualize the cerebral vasculature including injection of low viscosity resin, araldite F, gelatin mixed with various dyes1 (i.e. carmine red, India ink) or latex with2 or without3 carbon black. Perfusion of white latex compound through the ascending aorta has been first reported by Coyle and Jokelainen3. Maeda et al.2 have modified the protocol by adding carbon black ink to the latex compound for improved contrast visualization of the vessels after saline perfusion of the brain. However, inefficient perfusion and inadequate filling of the vessels are frequently experienced due to high viscosity of the latex compound4. Therefore, we have described a simple and cost-effective technique using a mixture of two commercially available carbon black inks (CB1 and CB2) to visualize the cerebral vasculature in a reproducible manner5. We have shown that perfusion with CB1+CB2 in mice results in staining of significantly smaller cerebral vessels at a higher density in comparison to latex perfusion5. Here, we describe our protocol to identify the anastomotic points between the anterior (ACA) and middle cerebral arteries (MCA) to study vessel variations in mice with different genetic backgrounds. Finally, we demonstrate the feasibility of our technique in a transient focal cerebral ischemia model in mice by combining CB1+CB2-mediated vessel staining with TTC staining in various degrees of ischemic injuries.

Analysis of rodent cerebrovascular anatomy plays an important role in experimental stroke research. In this context, intravascular perfusion with colored latex has been considered as a standard tool for several years. However, this technique implies distinct technical limitations, which undermine its reproducibility. Here, we describe a simple method to visualize cerebral vessels in a reproducible manner. Injection of a mixture of two commercially available carbon black inks through the left myocardial ventricle results in adequate filling of cerebral vessels with high contrast visualization. We have successfully applied this technique to identify anastomotic points between cerebral vascular territories of mice with different genetic backgrounds. We finally give evidence that this novel and simple method for vessel staining can be combined with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining - a widely used tool to observe and analyze infarct volumes in mice.

זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The ...

Neuroscience

הכנת מודל מיקרו-גידולי וסקולרי אנושי מבוסס מיקרופלואידיקה

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

מחבר זרקור: יצירת מיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים כמודלים לחקר סרטן תרגומי 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Cancer Research

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioengineering

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model species such as zebrafish and salamanders that are capable of intrinsic heart regeneration hold promise for future regenerative therapies for human patients. To evaluate the outcome of cardioregenerative experiments it is imperative that heart function can be monitored. The axolotl salamander (A. mexicanum) represents a well-established model species in regenerative biology attaining sizes that allows for evaluation of cardiac function. The purpose of this protocol is to establish methods to reproducibly measure cardiac function in the axolotl using echocardiography. The application of different anesthetics (benzocaine, MS-222, and propofol) is demonstrated, and the acquisition of two-dimensional (2D) echocardiographic data in both anesthetized and unanesthetized axolotls is described. 2D echocardiography of the three-dimensional (3D) heart can suffer from imprecision and subjectivity of measurements, and to alleviate this phenomenon a solid method, namely intra/inter-operator/observer analysis, to measure and minimize this bias is demonstrated. Finally, a method to acquire 3D echocardiographic data of the beating axolotl heart at a very high spatiotemporal resolution and with pronounced blood-to-tissue contrast is described. Overall, this protocol should provide the necessary methods to evaluate cardiac function and model anatomy, and flow dynamics in the axolotl using ultrasound imaging with applications in both regenerative biology and general physiological experiments.

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl Ambystoma Mexicanum

Here we present echocardiography protocols for two-dimensional and three-dimensional image acquisition of the beating heart of the axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), a model species in heart regeneration. These methods allow for longitudinal evaluation of cardiac function at a high spatiotemporal resolution.

אקוקרדיוגרפיה מימד ב אקסולוטל מקסיקני (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model ...

Medicine

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל במודל נמק הינדלימב מורין

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גידול של טטרה מקסיקנית Astyanax mexicanus עבור ניתוח של Post-larval פנוטיפים ואת כולה-הר אימונוהיסטוכימיה

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב

זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

אקוקרדיוגרפיה מימד ב אקסולוטל מקסיקני (Ambystoma Mexicanum)

הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל במודל נמק הינדלימב מורין

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster