עבודה זו מומנה על ידי גולף נגד סרטן, קרוליינה המרכז ננוטכנולוגיה אקסלנס פיילוט מענק, אוניברסיטת לחקר הסרטן הקרן בריאות ממלכתי המכון K-12 פיתוח פרס קריירה.

1. סינתזה של PLGA-B-PEG פולימר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולי (D, L-lactide-Co-glycolide) (PLGA) עם קבוצות carboxylate מסוף (PLGA-carboxylate) מומס כלשהו ממס עבור PLGA (כאמור בסעיף חומרים) בריכוז של 5 מ&quot;מ. PLGA יכול להיות מומס בריכוז הזה עם ערבוב עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני NHS (משקל מולקולרי 115.09) ו EDC (משקל מולקולרי 191.7) הם מומסים בתמיסה PLGA בריכוז של 25mm. (שניהם EDC לבין NHS מתווספים עודף stoichiometric של פי 5 לעומת PLGA). PLGA-carboxylate מומר PLGA-NHS ידי הוספת EDC ו NHS לפתרון PLGA-carboxylate עם ערבוב עדין במשך שעה בערך 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוצר התגובה PLGA-NHS הוא זירז את ידי הוספת מתנול פתרון כביסה. כ 10 פעמים עודף נפח של מתנול מתווסף הפתרון. הפתרון הוא centrifuged ב 2000 XG כדי לזרז את PLGA-NHS וזורקים supernatant (מסיר את עקבות EDC ו - NHS. הליך של כביסה עם מתנול הוא חזר לפחות שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PLGA-NHS גלולה הוא מיובש תחת בוואקום במשך 30 דקות כדי להסיר כל עקבות של פתרון הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PLGA-NHS גלולה כעת מחדש מומס הממס אותו בריכוז זהה ששימש בתחילה לפזר PLGA. PEG heterobifunctional (אמין-PEG-carboxylate) הוא הוסיף אז לפתרון PLGA בריכוז של 5 מ&quot;מ (יחס stoichiometric של 1:1). הפתרון הוא תערובת מודגרות למשך 24 שעות עם ערבוב מתמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, המוצר התגובה PLGA-B-PEG לחסום קופולימר הוא זירז את ידי הוספת מתנול פתרון כביסה עודף. חזור על התהליך כביסה צנטריפוגה כאמור שלוש פעמים. זו תסיר את כל PEG unreacted עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קופולימר PLGA-B-PEG לחסום הוא מיובש תחת ואקום. </li></ol> 2. PLGA-B-PEG nanoparticle הכנה חלקיקים עם ליבת PLGA מכוסה PEG על פני השטח ניתן להכין עם אלה קופולימרים diblock. מגוון של סמים שונים יכולים להיות הידרופובי הגלום חלקיקים כאלה. תרכובות פלורסנט ניתן הגלום חלקיקים או יכול להיות מצומדת כדי PLGA ובכך חלקיקים אלה יכולים לשמש עבור דימות פלואורסצנטי. שיטה Nanoprecipitation משמש כדי להפוך את חלקיקי במיוחד כאשר המטען הרצוי יהיה במארז הוא הידרופובי מאוד בטבע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PLGA-B-PEG לחסום קופולימר ואת התרופה / מטען (להיות במארז) הם מומסים כלשהו ממס אשר מתמוסס PLGA. PLGA יכול להיות מומס על ידי ממיסים משותפים רבים, כולל אצטוניטריל, DCM, tetrahydrofuran, אצטון או אתיל אצטט. הבחירה של ממס היא קריטית, כפי שהוא משפיע על המאפיינים של nanoparticle. לפיכך, ראוי ממס אמור לשמש בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת פולימר / התרופה ואז הוסיף dropwise ל 3-5 כרכים של ערבוב מים נותן ריכוז הפולימר הסופי של סביב 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל. (איור 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערבוב זה נמשך 2 שעות תחת לחץ מופחת, כדי לאפשר חלקיקים כדי ליצור ע&quot;י הרכבה עצמית ולהסיר עקבות של ממיס אורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיק וטיהור: חלקיקים מרוכזים מכן על ידי צנטריפוגה ב 2700 x g עבור 10 דקות באמצעות מסנן Amicon (MWCO 20KDa), התרחצתי, מחדש ב-PBS. זה מסיר את כל מטען בלתי וממולכד סמים /. אפיונים biophysical יסוד, כגון גודל, משטח מטען, וטעינה יעילות התרופה ניתן לבצע כדי להבין טוב יותר את המאפיינים של חלקיקים. </li></ol> 3. אחסון הקפאת ייבוש היא שיטה הנפוצה לאחסון חלקיקים 11. הקפאת ייבוש תשמור על תכונות פיסיקליות וכימיות של חלקיקים ליציבות ארוכת טווח 12. תהליך הקפאה וייבוש יכול לגרום ללחץ על חלקיקים ו לערער את הניסוח, כך cryo-protectants (הגנה מפני מתח הקפאה) ו-איו protectants (הגנה מפני מתח ייבוש) משמשים בדרך כלל. הבחירה של protectants אלה נקבע לפי אורך הזמן הרצוי אחסון 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת ייבוש, הקפאה, יש מיצוק הכולל של המדגם על ידי הקפאת מתחת Tg שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הייבוש, הקרח הוא הוסר על ידי סובלימציה. הטמפרטורה והלחץ צריך להיות מותאם על מנת להשיג תהליך יעיל להקפיא ייבוש. </li></ol> 4. נציג התוצאות: אפיון קופולימר PLGA-B-Di-PEG לחסום טכניקות שונות שניתן להשתמש בהם כדי לאשר את נטיה מוצלח של פולימרים. הרכב PLGA-B-PEG ניתן לאפיין באמצעות 400 MHz 1H תהודה מגנטית גרעינית (NMR). משקל מולקולרי של המוצר שנוצר (PLGA-B-PEG) ניתן לאמת באמצעות ג&#39;ל כרומטוגרפיה חלחול (GPC). PLGA-b - PEG משקל מולקולרי distributioעקומת n זמן elution צריך להיות שונה PLGA ו - PEG לבד. בשילוב, טכניקות אלו יש לאפיין את המוצר נוצרו לקבוע אם התגובה נטיה היה מוצלח. אפיון PLGA-B-PEG חלקיקים גודל החלקיקים והפצה גודל ניתן למדוד על ידי פיזור אור דינאמי. פרמטרים שונים בתהליך nanoprecipitation להשפיע על גודל החלקיקים. משקולות מולקולרית של פולימרים המשמשים בתחילה (הן PLGA ו - PEG) גם השפעת חלוקת גודל החלקיקים. מעבר במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) יכול לשמש גם כדי לאשר את התפלגות גודל ומבנה של חלקיקים כפי שניתן לראות באיור 3. טווח גודל החלקיקים היא בדרך כלל בטווח ננומטר. גודל החלקיקים גדול עם התפלגות גודל אחיד יכול להצביע או שגיאה התגובה נטיה או שיטת nanoprecipitation אופטימיזציה הצרכים. בנוסף, פוטנציאל זטה פני השטח ניתן למדוד ZetaPALS. יעילות התרופה / מטען טוען ניתן לכמת עם תקן HPLC. החלקיקים הם מומסים אורגניים ממס HPLC ניתן לבצע כדי למדוד את ספיגת התרופה / מטען (איור 4). שחרור התרופה המחקר הקינטית ניתן לעשות בו כמויות ידוע קבוע של חלקיקים הם dialyzed ביחידות 30 Slide-A-MINI Lyzer דיאליזה. במרווחי זמן קבועים, התוכן ביחידת דיאליזה נאסף נפח שווה של ממס אורגני נוסף לפזר את חלקיקי. HPLC נעשית על דגימות אלה לכמת את התוכן סמים / מטען. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" /> באיור 1. EDC / NHS כימיה <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" /> איור 2. שיטה Nanoprecipitation להכנת חלקיקים פולימריים. הפתרון של ממס אורגני (אצטוניטריל או DCM) המכיל את PEG-PLGA diblock ואת התרופה או מטען להיות טעון לתוך חלקיק מתווסף dropwise כדי ערבוב של 3-5 מ&quot;ל H 2 O. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" /> איור 3. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים של nanopartices. תמונת TEM של PEG-PLGA חלקיקים המכילים wortamin. חומצה Phosphotungstic שימש כסוכן ניגוד. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" /> איור 4. שחרור מבוקר של התרופה מן nanoparticle. פקליטקסל שחרור חלקיקים לאחר דיאליזה ב PBS. באותה עת ציינה, חלקיקים הוצאו קלטות דיאליזה solublized ב אצטוניטריל. הפתרון היה נמדד על ידי HPLC. שני מגרשים נפרדים של חלקיקים הושוו. <div id="myEventWatcherDiv" style=";text-align:right;direction:rtl"></div><div id="myEventWatcherDiv" style=";text-align:right;direction:rtl"></div>

<ol>
	<li>Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Go&#235;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+polymers+in+pharmaceutical+and+biomedical+sciences.">Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).</li><li>Bulte, J. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).</li><li>Omid, C., Farokhzad, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Nanotechnology+on+Drug+Delivery.">Impact of Nanotechnology on Drug Delivery.</a> ACS NANO. 3, 16-20 (2009).</li><li>Li, Y. -. P., Pei, Y. -. Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+PLGA+nanoparticles+as+protein+carriers:+synthesis,+preparation+and+biodistribution+in+rats.">PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats.</a> Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate techniques. , (2008).</li><li>Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+block+copolymers+as+injectable+drug-delivery+systems.">Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems.</a> Nature. 388, 860-862 (1997).</li><li>Yoo, H. S., Park, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+targeted+biodegradable+polymeric+doxorubicin+micelles.">Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles.</a> Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).</li><li>Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+Functionalized+PLGA-PEG+Nanoparticles+for+In+Vivo+Targeted+Drug+Delivery.">Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery.</a> Biomaterials. 28, 869-876 (2007).</li><li>Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+engineering+of+targeted+nanoparticles+by+using+self-assembled+biointegrated+block+copolymers.">Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).</li><li>Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Biocompatible+Nanoparticles+for+the+Delivery+of+(-)-Epigallocatechin+3-Gallate+to+Prostate+Cancer+Cells.">Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells.</a> J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).</li><li>Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-drying+of+nanoparticles:+Formulation,+process+and+storage+considerations.">Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).</li><li>Holzer, M., Vogel, V., M&#228;ntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physico-chemical+characterisation+of+PLGA+nanoparticles+after+freeze-drying+and+storage.">Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).</li><li>Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectants+for+Freeze+Drying+of+Drug+Nano-Suspensions:+Effect+of+Freezing+Rate.">Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).</li><li>Wang, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalized+targeted+nanoparticles+for+therapeutic+applications.">Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications.</a> Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).</li><li>Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+release+from+biodegradable+injectable+thermosensitive+hydrogel+of+PEG-PLGA-PEG+triblock+copolymers.">Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers.</a> J. Control Release. 63, 155-163 (2000).</li><li>Gref, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+long-circulating+polymeric+nanospheres.">Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres.</a> Science. 263, 1600-1603 (1994).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה nanoprecipitation באמצעות diblock שיתוף פולימרים מייצג שיטה פשוטה, מהירה מהנדס חלקיקים פולימריים. חלקיקים וכתוצאה מכך מורכבים ליבה הידרופובי אשר יכול להיות מנוצל עבור משלוח של תרכובות מסיסים היטב. שכבת הקרקע הידרופילי מאפשר מסיסות מימית מעולה תוך מתן מחצית עבור נטיה נוס?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> EDC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22980 </td><td> נטיה מגיב </td></tr><tr><td> NHS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 24500 </td><td> נטיה מגיב </td></tr><tr><td> אמין-PEG-carboxylate </td><td> Laysan ביו בע&quot;מ </td><td> NH2-PEG-CM-5000 </td><td> פולימר (ניתן להשתמש בכל MW PEG, 5000 מופיע כאן) </td></tr><tr><td> PLGA-carbxylate </td><td> Lactel </td><td> B6013-2 </td><td> פולימר </td></tr><tr><td> Dichloromethane (DCM) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 34856 </td><td> ממס </td></tr><tr><td> אצטוניטריל&gt; טוהר 99% </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 34851 </td><td> ממס </td></tr><tr><td> מתנול&gt; טוהר 99% </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 34860 </td><td> לשטוף </td></tr></tbody></table>

formulation of diblock polymeric nanoparticles through nanoprecipitation technique

הננוטכנולוגיה היא ענף חדש יחסית של המדע כרוכה רתימת התכונות הייחודיות של החלקיקים הם ננומטר סולם (חלקיקים). חלקיקים יכולים להיות מהונדסים בצורה מדויקת שבה כימיה, גודל הרכב פני השטח שלהם ניתן לשלוט בקפידה. זה מאפשר חופש חסר תקדים לשנות כמה מן התכונות הבסיסיות של המטען שלהם, כגון, מסיסות diffusivity, biodistribution, מאפיינים לשחרר immunogenicity. מאז ראשית שלהם, חלקיקים כבר נוצלו בתחומים רבים של המדע והרפואה, כולל אספקת סמים, הדמיה, ביולוגיה של התא 1-4. עם זאת, לא נוצל במלואו מחוץ &quot;מעבדות הננוטכנולוגיה&quot; בשל מחסום טכני נתפס. במאמר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לסנתז פלטפורמה פולימר nanoparticle מבוסס כי יש מגוון רחב של יישומים פוטנציאליים. הצעד הראשון הוא לסנתז diblock שיתוף פולימר שיש לו גם תחום הידרופובי תחום הידרופילי. שימוש PLGA ו PEG כמו פולימרים מודל תיארנו תגובה נטיה באמצעות EDC / NHS כימיה 5 (איור 1). כמו כן, אנו דנים את תהליך טיהור פולימר. Diblock מסונתז שיתוף פולימר יכול עצמית להרכיב לתוך חלקיקים בתהליך nanoprecipitation דרך הידרופובי, הידרופילי אינטראקציות. Nanoparticle פולימר תיאר הוא מאוד תכליתי. ליבת הידרופובי של nanoparticle יכול להיות מנוצל כדי לשאת תרופות מסיס גרוע עבור משלוח הסמים experiments6. יתר על כן, חלקיקים יכולים להתגבר על הבעיה של ממיסים רעילים עבור מסיסים גרוע ריאגנטים לביולוגיה מולקולרית, כגון wortmannin, המחייב ממס כמו DMSO. עם זאת, DMSO יכול להיות רעיל לתאים ולהפריע הניסוי. תרופות אלו מסיסים גרוע ריאגנטים יכול להיות מועברת באופן יעיל באמצעות חלקיקי הפולימר עם רעילות מינימלית. חלקיקי הפולימר יכול גם להיות טעון עם צבע פלואורסצנטי מנוצל ללימודי סחר תאיים. לבסוף, אלו חלקיקים פולימר ניתן מצומדות כדי מיקוד ligands דרך PEG פני השטח. חלקיקים ממוקדת כזה יכול להיות מנוצל כדי תווית epitopes ספציפי או בתאים 7-10.

Watch this Scientific Journal Video about Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique at JoVE.com

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

מאמר זה מתאר שיטה nanoprecipitation לסנתז פולימר מבוסס חלקיקים באמצעות diblock שיתוף פולימרים. אנו נדון את הסינתזה של diblock שיתוף פולימרים, הטכניקה nanoprecipitation, יישומים פוטנציאליים.

גיבוש חלקיקים פולימריים Diblock באמצעות טכניקה Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

formulation-diblock-polymeric-nanoparticles-through-nanoprecipitation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

37.1K Views.  University of North Carolina School of Medicine. מאמר זה מתאר שיטה nanoprecipitation לסנתז פולימר מבוסס חלקיקים באמצעות diblock שיתוף פולימרים. אנו נדון את הסינתזה של diblock שיתוף פולימרים, הטכניקה nanoprecipitation, יישומים פוטנציאליים.

Video: Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

תאי גזע תכנות טיפולי אנגיוגנזה שימוש אורגניים פולימריים חלקיקים

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

ייצור מערך microneedle פולימרית יתוגרפיה

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

בודה חומרים פולימריים עבור יישומים ביו-הידרופובי

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise regulation of gene activity. In particular, novel stimuli-responsive materials with improved spatiotemporal control over gene expression would unlock translatable platforms in drug discovery and regenerative medicine technologies. Furthermore, an enhanced ability to control nucleic acid release from materials would enable the development of streamlined methods to predict nanocarrier efficacy a priori, leading to expedited screening of delivery vehicles. Herein, we present a protocol for predicting gene silencing efficiencies and achieving spatiotemporal control over gene expression through a modular photo-responsive nanocarrier system. Small interfering RNA (siRNA) is complexed with mPEG-b-poly(5-(3-(amino)propoxy)-2-nitrobenzyl methacrylate) (mPEG-b-P(APNBMA)) polymers to form stable nanocarriers that can be controlled with light to facilitate tunable, on/off siRNA release. We outline two complementary assays employing fluorescence correlation spectroscopy and gel electrophoresis for the accurate quantification of siRNA release from solutions mimicking intracellular environments. Information gained from these assays was incorporated into a simple RNA interference (RNAi) kinetic model to predict the dynamic silencing responses to various photo-stimulus conditions. In turn, these optimized irradiation conditions allowed refinement of a new protocol for spatiotemporally controlling gene silencing. This method can generate cellular patterns in gene expression with cell-to-cell resolution and no detectable off-target effects. Taken together, our approach offers an easy-to-use method for predicting dynamic changes in gene expression and precisely controlling siRNA activity in space and time. This set of assays can be readily adapted to test a wide variety of other stimuli-responsive systems in order to address key challenges pertinent to a multitude of applications in biomedical research and medicine.

We present a novel method that uses photo-responsive block copolymers for more efficient spatiotemporal control of gene silencing with no detectable off-target effects. Additionally, changes in gene expression can be predicted using straightforward siRNA release assays and simple kinetic modeling.

חיזוי השתקת ג &#39;ין באמצעות שליטה Spatiotemporal של siRNA שחרור מ תגובה תגובה פולימרית פולימרית

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

הרכבה מהירה, מדרגי וטעינה של חלבונים ביו, Immunostimulants לתוך Nanocarriers סינתטי מגוונות באמצעות פלאש Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

חלבון קינאז C-דלתא מעכב פפטיד ניסוח באמצעות חלקיקי זהב

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

פלאש NanoPrecipitation בשביל העטיפה של תרכובות הידרופוביות, הידרופילית חלקיקים פולימרים

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical success for treating previously &#8216;undruggable&#8217; hepatic disease targets with siRNA has been achieved. However, efficient tumor siRNA delivery necessitates additional pharmacokinetic design considerations, including long circulation time, evasion of clearance organs (e.g., liver and kidneys), and tumor penetration and retention. Here, we describe the preparation and in vitro physicochemical/biological characterization of polymeric nanoparticles designed for efficient siRNA delivery, particularly to non-hepatic tissues such as tumors. The siRNA nanoparticles are prepared by electrostatic complexation of siRNA and the diblock copolymer poly(ethylene glycol-b-[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-butyl methacrylate]) (PEG-DB) to form polyion complexes (polyplexes) where siRNA is sequestered within the polyplex core and PEG forms a hydrophilic, neutrally-charged corona. Moreover, the DB block becomes membrane-lytic as vesicles of the endolysosomal pathway acidify (&#60; pH 6.8), triggering endosomal escape and cytosolic delivery of siRNA. Methods to characterize the physicochemical characteristics of siRNA nanoparticles such as size, surface charge, particle morphology, and siRNA loading are described. Bioactivity of siRNA nanoparticles is measured using luciferase as a model gene in a rapid and high-throughput gene silencing assay. Designs which pass these initial tests (such as PEG-DB-based polyplexes) are considered appropriate for translation to preclinical animal studies assessing the delivery of siRNA to tumors or other sites of pathology.

Methods to prepare and characterize the physicochemical properties and bioactivity of neutrally-charged, pH-responsive siRNA nanoparticles are presented. Criteria for successful siRNA nanomedicines such as size, morphology, surface charge, siRNA loading, and gene silencing are discussed.

הכנת מנטרל-טעון, pH-מגיבים חלקיקים פולימריים עבור משלוח ציטוזה מסירה

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...