Diese Arbeit wurde von der Golfers Against Cancer, Carolina Zentrum für Nanotechnologie Excellence Pilot gewähren, University Cancer Research Fund und National Health Institute K-12 Career Development Award finanziert.

1. Synthese von PLGA-b-PEG-Polymer <ol><li> Poly (D, L-Lactid-co-Glycolid) (PLGA) mit Terminal Carboxylatgruppen (PLGA-Carboxylat) ist in jedem Lösungsmittel für PLGA (wie in Materialien Abschnitt erwähnt) in einer Konzentration von 5 mM aufgelöst. PLGA kann bei dieser Konzentration unter leichtem Rühren gelöst werden. </li><li> Beide NHS (Molekulargewicht 115,09) und EDC (Molekulargewicht 191,7) sind in den PLGA-Lösung bei einer Konzentration von 25 mM gelöst. (Beide EDC und NHS sind in einem stöchiometrischen Überschuß von 5-mal im Vergleich zu PLGA hinzugefügt). PLGA-Carboxylat in PLGA-NHS, indem EDC und NHS zu PLGA-Carboxylat-Lösung unter leichtem Rühren für ca. 1 Stunde umgerechnet. </li><li> Das Reaktionsprodukt PLGA-NHS wird durchgeführt, indem die Waschlösung Methanol ausgefällt. Etwa 10 mal Volumen Überschuss Methanol wird zu der Lösung gegeben. Die Lösung ist bei 2000 xg zentrifugiert auszufallen der PLGA-NHS und den Überstand verwerfen (entfernt die Spuren von EDC und NHS. Dieses Verfahren der Wäsche mit Methanol ist mindestens dreimal wiederholt. </li><li> Die PLGA-NHS Pellet wird unter Vakuum für 30 Minuten, um alle Spuren der Waschlösung zu entfernen getrocknet. </li><li> Die PLGA-NHS Pellet wird nun in dem gleichen Lösungsmittel in der gleichen Konzentration, die ursprünglich verwendet wurde, um PLGA aufzulösen wieder aufgelöst. Die hetero-PEG (Amin-PEG-Carboxylat) wird dann an den PLGA-Lösung bei einer Konzentration von 5 mM zugegeben (stöchiometrischen Verhältnis von 1:1). Die Mischung Lösung wird für 24 Stunden unter ständigem Rühren inkubiert. </li><li> Nach 24 Stunden wird das Reaktionsprodukt PLGA-b-PEG-Blockcopolymer durch Zugabe der Waschlösung Methanol im Überschuß gefällt. Wiederholen Sie die Wasch-und Zentrifugation wie oben dreimal erwähnt. Dadurch werden alle überschüssigen nicht umgesetzten PEG. </li><li> Die PLGA-b-PEG-Blockcopolymer wird unter Vakuum getrocknet. </li></ol> 2. PLGA-b-PEG-Nanopartikel Vorbereitung Nanopartikel mit PLGA Kern mit PEG an der Oberfläche bedeckt mit diesen Diblockcopolymere vorbereitet werden. Eine Vielzahl von unterschiedlichen hydrophoben Medikamente können in solchen Nanopartikeln verkapselt werden. Fluoreszierende Verbindungen können in den Nanopartikeln verkapselt werden oder konjugiert werden PLGA und damit diese Nanopartikel können für die Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden. Nanopräzipitation Methode wird verwendet, um Nanopartikel zu machen vor allem, wenn die gewünschte Ladung zu verkapselnden ist stark hydrophob in der Natur. <ol><li> Die PLGA-b-PEG-Blockcopolymer und das Medikament / Cargo (eingekapselt werden) sind in jedem Lösungsmittel, das PLGA löst aufgelöst. PLGA kann durch viele gebräuchliche Lösungsmittel, einschließlich Acetonitril, DCM, Tetrahydrofuran, Aceton oder Ethylacetat gelöst werden. Die Wahl des Lösungsmittels ist von entscheidender Bedeutung, da sie die Eigenschaften der Nanopartikel beeinflusst. Daher sollten geeignete Lösungsmittel in diesem Schritt verwendet werden. </li><li> Das Polymer / Wirkstoff-Gemisch wird dann tropfenweise auf 3-5 Bände Rühren Wasser eine endgültige Polymer-Konzentration von etwa 3 mg / ml zugegeben. (Abb. 2) </li><li> Das Rühren wird für 2 Stunden unter vermindertem Druck setzte, damit die Nanopartikel durch Selbstorganisation bilden, und entfernen Sie die Spuren des organischen Lösungsmittels. </li><li> Ernte und Reinigung: Die Nanopartikel werden dann durch Zentrifugation bei 2.700 x g für 10 min unter Verwendung einer Amicon-Filter (MWCO 20KDa), gewaschen konzentriert und rekonstituiert in PBS. Diese entfernt alle un-eingeschlossene Wirkstoff / Fracht. Grundlegende biophysikalischen Charakterisierungen, wie Größe, Oberflächenladung und Drogen Beladungseffizienz durchgeführt werden, um ein besseres Verständnis der Eigenschaften von Nanopartikeln werden. </li></ol> 3. Lagerung Die Gefriertrocknung ist eine häufig verwendete Methode, um Nanopartikel 11 Bewahren. Die Gefriertrocknung wird die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Nanopartikel für die langfristige Stabilität 12 zu erhalten. Die Gefriertrocknung kann Stress auf die Partikel verursachen und zu destabilisieren die Formulierung, so Kryo-Schutzmittel (Schutz vor Einfrieren Stress) und Lyo-Schutzmittel (Schutz vor dem Austrocknen Stress) häufig verwendet werden. Die Wahl dieser Schutzmittel wird durch die gewünschte Länge der Lagerzeit 13 bestimmt. <ol><li> In der Gefriertrocknung, gibt es insgesamt Erstarrung der Probe durch Einfrieren unterhalb seines Tg. </li><li> In der Trocknung ist das Eis durch Sublimation entfernt. Temperatur und Druck sollten optimiert werden, um eine effiziente Gefriertrocknung zu erreichen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Charakterisierung von PLGA-b-PEG Di-Block-Copolymer Verschiedene Techniken können verwendet werden, um die erfolgreiche Konjugation von Polymeren zu bestätigen. Die Zusammensetzung der PLGA-b-PEG kann charakterisiert mit einem 400 MHz 1H Kernspinresonanz (NMR) werden. Molekulargewicht des gebildeten Produkts (PLGA-b-PEG) kann durch Gelpermeationschromatographie (GPC) nachgewiesen werden. Die PLGA-b - PEG Molekulargewicht Distribution-Kurve und Elutionszeit sollte sich von PLGA und PEG allein. In Kombination sollten diese Techniken prägen das gebildete Produkt und festzustellen, ob die Konjugationsreaktion erfolgreich war. Charakterisierung von PLGA-b-PEG-Nanopartikeln Partikelgröße und Größenverteilung kann durch dynamische Lichtstreuung gemessen werden. Verschiedene Parameter in der Nanopräzipitation Prozess beeinflussen die Größe der Partikel. Die Molekulargewichte der verwendeten Polymere zunächst (beide PLGA und PEG) auch Wirkung der Partikelgrößenverteilung. Transition-Elektronenmikroskopie (TEM) kann auch verwendet werden, um die Größenverteilung und Struktur der Nanopartikel, wie in Abbildung 3 zu sehen bestätigen. Die Partikelgröße liegt im Allgemeinen im nm-Bereich. Große Partikelgrößen mit ungleichen Größenverteilung könnte entweder auf einen Fehler in der Konjugationsreaktion oder Nanopräzipitation Methode benötigt Optimierung. Darüber hinaus kann die Oberfläche Zeta-Potential von ZetaPALS gemessen werden. Das Medikament / der Fracht Effizienz kann mit Standard-HPLC quantifiziert werden. Die Partikel werden in einem organischen Lösungsmittel und HPLC aufgelöst werden durchgeführt, um die Absorption des Medikaments / Fracht (Abb. 4) zu messen. Die Wirkstoff-Freisetzung kinetische Untersuchung kann getan werden, wo bekannte feste Größen der Nanopartikel in 30 Slide-A-Lyzer MINI Dialyse-Einheiten sind dialysiert werden. In festen zeitlichen Abständen wird der Inhalt in der Dialyse-Einheit gesammelt und gleichen Volumen an organischem Lösungsmittel zugesetzt wird, um die Nanopartikel zu lösen. HPLC wird an diesen Proben durchgeführt, um die Droge / cargo Inhalte zu quantifizieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" /> Abbildung 1. EDC / NHS-Chemie <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" /> Abbildung 2. Nanopräzipitation Verfahren zur Herstellung von polymeren Nanopartikeln. Die organische Lösung eines Lösungsmittels (Acetonitril oder DCM), die die PEG-PLGA Diblock und das Medikament oder der Ladung in die Teilchen geladen werden zugetropft auf 3-5 ml Rühren H 2 O. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" /> Abbildung 3. Transmission Electron Microscopy von nanopartices. Eine TEM-Aufnahme von PEG-PLGA-Nanopartikel enthalten wortamin. Phosphorwolframsäure wurde als Kontrastmittel verwendet. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" /> Abbildung 4. Kontrollierte Freisetzung von Medikamenten aus Nanopartikeln. Freisetzung von Paclitaxel aus Nanopartikeln nach der Dialyse in PBS. Am darauf hingewiesen Zeit wurden Partikel aus Dialyse-Kassetten entnommen und solubilisiert in Acetonitril. Die Lösung wurde mittels HPLC gemessen. Zwei Losen von Nanopartikeln wurden verglichen. <div id="myEventWatcherDiv"></div><div id="myEventWatcherDiv"></div>

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	<li>Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Go&#235;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+polymers+in+pharmaceutical+and+biomedical+sciences.">Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).</li><li>Bulte, J. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).</li><li>Omid, C., Farokhzad, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Nanotechnology+on+Drug+Delivery.">Impact of Nanotechnology on Drug Delivery.</a> ACS NANO. 3, 16-20 (2009).</li><li>Li, Y. -. P., Pei, Y. -. Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+PLGA+nanoparticles+as+protein+carriers:+synthesis,+preparation+and+biodistribution+in+rats.">PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats.</a> Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate techniques. , (2008).</li><li>Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. 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M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Biocompatible+Nanoparticles+for+the+Delivery+of+(-)-Epigallocatechin+3-Gallate+to+Prostate+Cancer+Cells.">Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells.</a> J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).</li><li>Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-drying+of+nanoparticles:+Formulation,+process+and+storage+considerations.">Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).</li><li>Holzer, M., Vogel, V., M&#228;ntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physico-chemical+characterisation+of+PLGA+nanoparticles+after+freeze-drying+and+storage.">Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).</li><li>Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectants+for+Freeze+Drying+of+Drug+Nano-Suspensions:+Effect+of+Freezing+Rate.">Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).</li><li>Wang, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalized+targeted+nanoparticles+for+therapeutic+applications.">Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications.</a> Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).</li><li>Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+release+from+biodegradable+injectable+thermosensitive+hydrogel+of+PEG-PLGA-PEG+triblock+copolymers.">Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers.</a> J. Control Release. 63, 155-163 (2000).</li><li>Gref, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+long-circulating+polymeric+nanospheres.">Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres.</a> Science. 263, 1600-1603 (1994).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Nanopräzipitation Methode mit Diblock-Copolymeren stellt eine einfache, schnelle Methode, um polymere Nanopartikel Ingenieur. Die entstehenden Nanopartikel bestehen aus einem hydrophoben Kern, der für die Lieferung von schwer löslichen Verbindungen genutzt werden können zusammengesetzt. Die Oberfläche hydrophilen Schicht ermöglicht eine ausgezeichnete Löslichkeit in Wasser und gleichzeitig eine Einheit für mögliche weitere Konjugation an ein Targeting-Liganden. Es gibt viele Nan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> EDC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22980 </td><td> Konjugation Reagent </td></tr><tr><td> NHS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 24500 </td><td> Konjugation Reagent </td></tr><tr><td> Amin-PEG-Carboxylat </td><td> Laysan Bio Inc. </td><td> NH2-PEG-CM-5000 </td><td> Polymer (Kann jeder PEG MW zu verwenden, ist 5000 hier aufgeführt) </td></tr><tr><td> PLGA-carbxylate </td><td> Lactel </td><td> B6013-2 </td><td> Polymer </td></tr><tr><td> Dichlormethan (DCM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34856 </td><td> Lösungsmittel </td></tr><tr><td> Acetonitril&gt; 99% Reinheit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34851 </td><td> Lösungsmittel </td></tr><tr><td> Methanol&gt; 99% Reinheit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34860 </td><td> Waschen </td></tr></tbody></table>

formulation of diblock polymeric nanoparticles through nanoprecipitation technique

Nanotechnologie ist ein relativ neuer Zweig der Wissenschaft, die Nutzung beinhaltet die einzigartigen Eigenschaften von Teilchen, die Nanometer-Skala (Nanopartikel) sind. Nanopartikel können in einer präzisen Art und Weise, wo ihre Größe, Zusammensetzung und Oberflächenchemie sorgfältig kontrolliert werden können manipuliert werden. Dies ermöglicht eine beispiellose Freiheit, um einige der grundlegenden Eigenschaften ihrer Ladung, wie Löslichkeit, Diffusion, Gewebeverteilung Release-Eigenschaften und Immunogenität zu ändern. Seit ihrer Gründung haben Nanopartikel in vielen Bereichen der Naturwissenschaften und der Medizin, einschließlich Drug-Delivery-, Bildbearbeitungs-und Zellbiologie 1-4 verwendet worden. Es ist jedoch nicht vollständig außerhalb der &quot;Nanotechnologie Laboratorien&quot; durch wahrgenommene technische Barriere eingesetzt. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Methode, um eine Polymer-Nanopartikel, die ein breites Spektrum möglicher Anwendungen ist zu synthetisieren. Der erste Schritt ist, um ein Diblock Co-Polymer, das sowohl eine hydrophobe Domäne und hydrophilen Domäne zu synthetisieren. Mit PLGA und PEG als Modell Polymere, beschrieben wir eine Konjugationsreaktion mit EDC / NHS-Chemie 5 (Abb. 1). Wir diskutieren auch die Polymer-Reinigungsprozess. Die synthetisierten Diblock-Copolymer kann in Nanopartikel selbst zusammen in der Nanopräzipitation Prozess durch hydrophobe-hydrophile Wechselwirkungen. Die beschriebenen Polymer-Nanopartikel ist sehr vielseitig. Der hydrophobe Kern der Nanopartikel genutzt werden, um schwer löslichen Medikamenten für Drug-Delivery experiments6 tragen. Darüber hinaus können die Nanopartikel das Problem der toxischen Lösungsmittel für schwerlösliche Molekularbiologie Reagenzien, wie Wortmannin, die ein Lösungsmittel wie DMSO erfordert überwinden. Allerdings kann DMSO toxisch für Zellen und stören mit dem Experiment. Diese schwer löslichen Medikamenten und Reagenzien kann effektiv geliefert werden unter Verwendung von Polymer-Nanopartikeln mit minimaler Toxizität. Polymer-Nanopartikel können auch mit Fluoreszenzfarbstoff beladen und genutzt werden für intrazellulären Transport Studien. Schließlich können diese Polymer-Nanopartikel konjugiert werden, um Targeting-Liganden durch die Oberfläche PEG. Solche gezielten Nanopartikel können verwendet werden, um spezifische Epitope auf oder in Zellen 7-10 Label sein.

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Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Dieser Artikel beschreibt ein Nanopräzipitation Methode zur Polymer-Nanopartikel mit Diblock-Copolymere zu synthetisieren. Wir besprechen die Synthese von Di-Co-Polymeren, die Nanopräzipitation Technik und Einsatzmöglichkeiten.

Formulierung von Diblock Polymernanopartikel durch Nanopräzipitation Technik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

formulation-diblock-polymeric-nanoparticles-through-nanoprecipitation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

37.1K Aufrufe.  University of North Carolina School of Medicine. Dieser Artikel beschreibt ein Nanopräzipitation Methode zur Polymer-Nanopartikel mit Diblock-Copolymere zu synthetisieren. Wir besprechen die Synthese von Di-Co-Polymeren, die Nanopräzipitation Technik und Einsatzmöglichkeiten.

Serie: Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Forschung

Biotechnik

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Herstellung Superhydrophobe Polymere Materialien für biomedizinische Anwendungen

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise regulation of gene activity. In particular, novel stimuli-responsive materials with improved spatiotemporal control over gene expression would unlock translatable platforms in drug discovery and regenerative medicine technologies. Furthermore, an enhanced ability to control nucleic acid release from materials would enable the development of streamlined methods to predict nanocarrier efficacy a priori, leading to expedited screening of delivery vehicles. Herein, we present a protocol for predicting gene silencing efficiencies and achieving spatiotemporal control over gene expression through a modular photo-responsive nanocarrier system. Small interfering RNA (siRNA) is complexed with mPEG-b-poly(5-(3-(amino)propoxy)-2-nitrobenzyl methacrylate) (mPEG-b-P(APNBMA)) polymers to form stable nanocarriers that can be controlled with light to facilitate tunable, on/off siRNA release. We outline two complementary assays employing fluorescence correlation spectroscopy and gel electrophoresis for the accurate quantification of siRNA release from solutions mimicking intracellular environments. Information gained from these assays was incorporated into a simple RNA interference (RNAi) kinetic model to predict the dynamic silencing responses to various photo-stimulus conditions. In turn, these optimized irradiation conditions allowed refinement of a new protocol for spatiotemporally controlling gene silencing. This method can generate cellular patterns in gene expression with cell-to-cell resolution and no detectable off-target effects. Taken together, our approach offers an easy-to-use method for predicting dynamic changes in gene expression and precisely controlling siRNA activity in space and time. This set of assays can be readily adapted to test a wide variety of other stimuli-responsive systems in order to address key challenges pertinent to a multitude of applications in biomedical research and medicine.

We present a novel method that uses photo-responsive block copolymers for more efficient spatiotemporal control of gene silencing with no detectable off-target effects. Additionally, changes in gene expression can be predicted using straightforward siRNA release assays and simple kinetic modeling.

Vorhersage des Gen-Silens durch die räumlich-zeitliche Kontrolle der siRNA-Freisetzung von photoreaktiven polymeren Nanocarriern

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Schnelle, skalierbare Montage und Beladung von bioaktiven Proteinen und Immunstimulantien in diversen synthetischen darin über Flash-Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

Protein Kinase C-Delta-Inhibitor Peptid Formulierung mit Gold-Nanopartikeln

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash-NanoPrecipitation für die Kapselung der hydrophoben und hydrophilen Verbindungen in Polymeren Nanopartikel

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical success for treating previously &#8216;undruggable&#8217; hepatic disease targets with siRNA has been achieved. However, efficient tumor siRNA delivery necessitates additional pharmacokinetic design considerations, including long circulation time, evasion of clearance organs (e.g., liver and kidneys), and tumor penetration and retention. Here, we describe the preparation and in vitro physicochemical/biological characterization of polymeric nanoparticles designed for efficient siRNA delivery, particularly to non-hepatic tissues such as tumors. The siRNA nanoparticles are prepared by electrostatic complexation of siRNA and the diblock copolymer poly(ethylene glycol-b-[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-butyl methacrylate]) (PEG-DB) to form polyion complexes (polyplexes) where siRNA is sequestered within the polyplex core and PEG forms a hydrophilic, neutrally-charged corona. Moreover, the DB block becomes membrane-lytic as vesicles of the endolysosomal pathway acidify (&#60; pH 6.8), triggering endosomal escape and cytosolic delivery of siRNA. Methods to characterize the physicochemical characteristics of siRNA nanoparticles such as size, surface charge, particle morphology, and siRNA loading are described. Bioactivity of siRNA nanoparticles is measured using luciferase as a model gene in a rapid and high-throughput gene silencing assay. Designs which pass these initial tests (such as PEG-DB-based polyplexes) are considered appropriate for translation to preclinical animal studies assessing the delivery of siRNA to tumors or other sites of pathology.

Methods to prepare and characterize the physicochemical properties and bioactivity of neutrally-charged, pH-responsive siRNA nanoparticles are presented. Criteria for successful siRNA nanomedicines such as size, morphology, surface charge, siRNA loading, and gene silencing are discussed.

Vorbereitung von Neutral-aufgeladenen, pH-responsiven polymischen Nanopartikeln für zytosolische siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...