Wir danken Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) für den Kopf-Bauweise. Die Arbeit wurde von NIH Auszeichnungen wurden auf SD (R01DA026325 und P30AI078498 und Stiftung Stipendien an KK (Dana Foundation Brain and Immunoimaging Programm, American Heart Association 0635595T und der ALS Association [# 1112)]) unterstützt.

1. Vorbereitung der Tiere für die Bildgebung Hinweis: Wir verwenden erwachsene C57BL Mäusen. Verschiedene transgene Stämme können je nach Fragestellung werden. Mikrovaskuläre Praxen und Pulsoximetrie sind bei Mäusen mit weißem Pelz (zB FVB-Stamm) erleichtert. <ol><li> Bereiten Sie das Operationsgebiet an der Werkbank. Alle chirurgischen Instrumente müssen autoklaviert oder mit 70% Ethanol desinfiziert werden. </li><li> Legen Sie eine rektale Sonde, und messen kontinuierlich den Körper des Tieres Temperatur während des gesamten Verfahrens </li><li> Betäuben die Maus mit anfänglich 5% Isofluran. In 15 bis 30 s, wenn das Tier bewegt sich nicht, legen Sie es auf einem Heizkissen (37 ° C), und tragen Sie eine Gesichtsmaske für die kontinuierliche Lieferung von Luft mit 1,3 bis 1,5% Isofluran). Stellen Sie sicher, dass das Tier reagiert nicht auf einen Schmerzreiz (zB Schwanz Prise). </li><li> Verwenden Sie künstliche Tränenflüssigkeit Gel auf die Maus in die Augen bedecken, um die Exposition gegenüber trockener Luft zu verhindern. </li><li> Mit einem elektrischen Rasierer, Haare zu entfernen fROM den Kopf und aus beiden Oberschenkeln. Bewerben Haarentferner (zB Nair) zum Oberschenkel für 2 min, und wischen Sie es sorgfältig, um die restlichen Haare zu entfernen. Dieser Schenkel wird für Oximetrie verwendet werden. </li><li> Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einer 10% Povidon-Jod-Lösung und 70% Ethanol. </li></ol> 2. Vorbereiten des offenen Schädel Schädel-Fenster <ol><li> Ab 5 mm kaudal der Schädelbasis, einen Einschnitt in der Kopfhaut mit einer Schere und einem Zentimeter vorrücken. Bewegen Haut an den Seiten, um den Schädel freizulegen. </li><li> Um die Membranen auf der Oberseite des Schädels entfernen gelten 10% Eisenchloridlösung an die Spitze des Schädels. Wischen Sie die überschüssige Lösung, und kratzen die Membranen weg mit 45 °-Winkel Nr. 5 Pinzette. Es ist wichtig, um die Site sorgfältig vorzubereiten, um sicherzustellen, daß die Kopfplatte sicher an dem Schädel befestigt werden (Schritte # 4-6). </li><li> Mit einem Dissektionsmikroskop, identifizieren den Bereich von Interesse. Beachten Sie, dass die Schädelnähte vermieden werden, da der Schädel cein unvorhersehbar brechen in dieser Richtung. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht des schnellen Kleber (zB Loctite 454) an den Rändern des Fensters von der Kopfplatte (Abbildung 1). Positionieren der Kopfplatte in einer solchen Weise, dass der Bereich von Interesse in dem Fenster freigelegt. Wenden Sie leichten Druck auf der Kopfplatte. Eine kleine Menge von Zahnzement, um den Klebstoff schnell polymerisieren. Halten Sie für 10 Sekunden, während der Leim Polymerisation. </li><li> Eine kleine Menge des schnellen Leim auf den Rändern des Fensters, um die Kopfplatte und den Schädel zu versiegeln. Schrauben Sie die Kopfplatte an das Tier Halterung unter dem Sezieren Umfang. </li><li> Mit dem Bohrer MicroTorque II bei 6000 Umdrehungen pro Minute und einer IRF 005 Bohrer gesetzt, entfernen Sie alle zusätzlichen Klebstoff aus dem Schädel und aus der Kopfplatte. Ein verbleibender Klebstoff auf der Kopfplatte sollte entfernt werden, da es sonst mit der Befestigung der Glasabdeckung stören. </li><li> Setzen Sie den Bohrer bei 1000 rpm, und starten Sie den Schädel bohren, indem Sie einen Kreis innerhalb der Kopfplatte Fenster, Durchmesser ca. 5 mm. Verwenden Sie leichte kreisenden Bewegungen, als ob Sie mit einem sehr weichen Bleistift zeichnen sind. Stop Bohren alle 20-30 Sekunden, um Knochen Staub mit Druckluft zu entfernen. Hinweis: Die Form der Öffnung in der Kopfplatte können zusätzliche Zugang für den Bohrer (für links und rechtshändige Chirurg), die es leichter, einen kreisförmigen Schädelfenster erstellen lassen. Darüber hinaus bieten die beiden seltsam geformten Löcher den erforderlichen Raum, um eine Clark-Elektrode oder Glas-Elektrode in das Hirngewebe einfügen unter dem kranialen Fenster für zusätzliche polarographische oder elektrophysiologische Messungen. </li><li> Da das Bohren fortschreitet, wird ein Bau rund um den intakten Schädel in der Mitte gebildet. Achten Sie darauf, durch den ausgedünnten Schädel stecken, aber um diese Höhle von gleichmäßiger Dicke zu machen. Seien Sie besonders vorsichtig um große Blutgefäße, sie sollten nicht beeinträchtigt werden und, wenn möglich, nicht einmal berührt. </li><li> Verwenden Sie ein &quot;Bein&quot; der Pinzette # 3 zu heben (&quot;Flick Off&quot;) die Knochen in der Mitte des Fensters. Einen Tropfen Künial zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) auf der Scheibe. </li><li> Wischen Sie sanft mit einem aCSF Ecke von weichem Tissue-Papier (z. B. Kimwipe). Gewöhnlich wird die Dura nach einem oder mehreren Orten um den Rand des Fensters beschädigt. Ab einer dieser Seiten, heben Sie vorsichtig und entfernen Sie dann die Dura von der Hirnoberfläche, mit 45 °-Winkel Pinzette # 5. Bei der Wahl der Stelle, an der zu beginnen Entfernen der Dura, vermeiden die Bereiche neben großen Blutgefäßen. Kommt es zu Blutungen, einen Tropfen aCSF und warten Sie 2-3 min für kleinere Blutungen zu stoppen. </li><li> Bereiten 0,07% niedrig schmelzende Agarose in aCSF gelöst) Bringen Sie die geschmolzene Agarose auf Körpertemperatur. Wischen über die aCSF von der Oberfläche des Gehirns. Gießen Sie die Agarose in dem Fenster, und decken mit einem Glasträger. Drücken Sie das Glas vorsichtig, um einen Kontakt zwischen dem Glas und der Kopfplatte machen, und warten Sie 10-20 Sekunden, bis die Agarose ist solide. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Agarose aus der Glasabdeckung mit einer Pinzette und weichem Tissue-Papier. </li><li> Geben Sie eine kleineHöhe der schnellen Leim um das Glas zu kleben das Glas an der Kopfplatte. Eine kleine Menge von Zahnzement, um den Klebstoff (1) verfestigen. </li></ol> 3. Die intravenöse Injektion und Blutoxygenierung Überwachung Hinweis: routinemäßig verwendet, die Oberschenkelvene zur intravenösen Applikation von Texas-Rot als die Schwanzvene injiziert. Dies liegt daran, Vena femoralis Injektionen sichere und reproduzierbare Bolusinjektionen des Farbstoffs. <ol><li> Drehen Sie das Tier teilweise über die Innenseite des linken Oberschenkels aussetzen. Klebeband, um die Tiere in dieser Position zu sichern. </li><li> Bewerben antiseptischen Gestrüpp, und dann 100% Ethanol auf die Haut. </li><li> Einen Einschnitt entlang der medialen Oberschenkel vom Knie bis zur Symphyse. Separate Weichteile durch stumpfe Präparation mit einer Pinzette # 5. </li><li> Füllen Sie 1 ml-Spritze mit 130 ul von Texas Red (2,5 mg / ml). Befestigen Sie eine neue Nadel (Gauge 30), und biegen Sie ihn sorgfältig bei 30 ° und hält die Fase auf. Füllen Sie die Nadel with Texas Red-Lösung. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, führen Sie die Nadel in die V. femoralis und injizieren 100 ul Texas Red. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie leicht die Vene mit Gaze, um eine Blutung zu stoppen. </li><li> Schließen Sie die Haut mit 4-0 Naht. </li><li> Zur kontinuierlichen Überwachung von Blut SpO 2 (auf angemessene Blutoxygenierung gewährleisten) setzen Sie den Oximetermeßfühler auf dem rechten Oberschenkel (aus denen Haare hatte es schon zuvor). </li></ol> 4. Zwei-Photonen-Imaging Hinweis: Wir verwenden eine Olympus Fluoview1000 Multiphotonen Imaging-System (stehend) mit einem Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Femtosekunden-Ti: Sa-Lasers als Anregungsquelle. Für die Bildgebung, nutzen wir × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat) oder × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) Wasser-Immersions-Objektive. Wir nehmen Bilder auf 12-Bit-Farbtiefe bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel mit einem Pixel-Verweilzeit von 2 us. Die NADH-und Texas-Red-Dextran werden gleichzeitig bei 740 nm angeregt, und Fluorescence wird vom Anregungslicht getrennt mit einem dichroitischen Spiegel / Nah-IR-Sperrfilter Kombination (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) gliedert sich in zwei Kanäle mit einem dichroitischen Spiegel (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA), und bandpassgefiltert (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laserleistung nach dem Objektiv 10-20 mW gemessen wurde, war für die Bildgebung in Schicht I und 20-50 mW für die Bildgebung in Schicht II. <ol><li> Übertragen Sie die chirurgisch präparierten Maus auf dem Mikroskoptisch. Nehmen Sie ein erstes Bild der Schädelbasis Fenster Website mit Hellfeldbeleuchtung mit 4x-Vergrößerung um sie als Referenz für die Registrierung Karte mit höherer Vergrößerung Zwei-Photonen-Angiographien zu verwenden. </li><li> Zoomen Sie in dem interessierenden Gebiet mit x 10 Vergrößerung. Wählen Sie einen Bereich von Interesse in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 um unterhalb der Pia-Oberfläche). Wenn höhere Vergrößerung gewünscht wird, verwenden × 25 Ziel </li><li> Start Aufzeichnung der Zeitreihen (FiguZu 2). Wir empfehlen, durchschnittlich 3-5 Frames, um die Qualität des Bildes zu erhöhen. </li><li> Induzieren Hypoxämie durch Zugabe von 50% N2 in die Luft, dass das Tier atmet. Dadurch wird der O2-Gehalt bis 10% zu bringen. Stellen Sie sicher, Hypoxämie durch Überwachung Oximeter Daten. </li><li> Fortfahren, um die Zeitreihe durch Hypoxämie (z. B. 30 Sekunden) aufzunehmen, und nach den üblichen O2 wird wiederhergestellt. </li><li> Sammeln von Daten für die Berechnung der Sauerstoff-Verteilung durch Erfassen, Messen und Quantifizieren der Bereich der Hypoxie und oxygenierten Gewebe Rollen, um die Blutgefäße. </li></ol> 5. Datenverarbeitung <ol><li> Bestimmen der Krogh Gewebezylinder Radius R Dies kann manuell erfolgen (3) durch Messung des Abstandes zwischen Mitte des Blutgefäßes und der Grenze, bei der hohen NADH Fluoreszenz nachgewiesen wird. </li><li> Alternativ können Sie auch den Rechenaufwand Ermittler-unabhängige semi-automatische Bestimmung des Gewebes Zylinder Radius R und die zentrale blood r Gefäß, das beschrieben wurde bisher 1 in ergänzender Form zusammengefasst und in der Diskussion Abschnitt dieses Protokoll. </li><li> Die Fläche von Hypoxie mit Open-Access-Bildanalyse-Software, zB ImageJ. Um dies zu tun, verwenden NADH-Signal, definieren Sie eine Schwelle, die die hohe Intensität NADH Bereich abgrenzt, und messen Sie dann den Bereich mit erhöhten NADH Fluoreszenz Gewebe. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt ein Video von NADH / Angiographie Bilder bei transienten Hypoxämie (für die PDF-Version dieser Abbildung, ausgewählten Standbilder verwendet wurden). Die eingeatmeten Sauerstoffkonzentration von 21% bis 10% für einen Zeitraum von 3 min abgesenkt. Dieses Niveau der experimentell induzierten Hypoxämie ausreichend ist, um schwere Hypoxie in der Hirnrinde zu induzieren. Hypoxie führte zu einem Anstieg der NADH-Fluoreszenz, zunächst in den Bereichen, die am weitesten von der arteriellen Durchblutung waren. Beachten Sie die scharfen NADH GewebeGrenzen, die Grenzen des beobachtbaren Gewebe Sauerstoffdiffusion vertreten von der kortikalen Mikrozirkulation. Das Bild in Abbildung 3 zeigt die Geometrie der Sauerstoffdiffusion Grenzen umliegenden Hirngefäße. Es ist möglich, Krogh Walzendurchmesser dieser Grenzen abzuleiten, wie zuvor beschrieben ein. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> Abbildung 1. (A)-Maus mit Schädel-Fenster für die Bildgebung vorbereitet. (B) Abmessungen der Kopfplatte. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> Abbildung 2. Endogenen NADH grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht mit Zwei-Photonen-Imaging durch kraniale Fenster, ca. 50 um unterhalb der Pia-Oberfläche. Die Blutgefäße werden visualisiert mit Texas Red Dextran. Sauerstoff in der Atemluft wurde auf 10% für 3 min reduziert und dann für 21% wiederhergestellt. Maßstab: 50 um. &lt;img alt = &quot;Bild 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Geometrie der NADH Fluoreszenz Grenzen. Gelb zeigt Umriss Grenze von funktionellen Hypoxie; blaue Kreise zeigen projiziert Sauerstoff (Krogh) Zylindern. Blaue Linien zeigen Zylinderradien; Zahlen zeigen Radien in Mikrometern.

<ol>
	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine hohe räumliche Auflösung Informationen über Sauerstoffdiffusion ist wichtig zu verstehen, wie Blutfluss im Gehirn reguliert wird, um Sauerstoff zu Gehirnzellen zu gewährleisten und metabolischen Bedarf zu decken. Traditionelle polarographischen Sauerstoff-Messungen mit Clark-Stil Glaselektroden sind sehr invasiv und haben eine geringe räumliche Auflösung und 3.2 signifikant (zweite Reihe) Reaktionszeit. Bisher ist die einzige nicht-invasive Methode zur Messung von pO 2 im Hirngewebe ist Phosphoreszenz Abschrecken, wo die Rate der Zerfall des angeregten Sonde ist proportional zur Sauerstoffkonzentration 4. Diese Methode liefert genaue Sauerstoffkonzentrationen, erfordert aber eine proprietäre Farbstoff und ein technisch ausgereiftes Phosphoreszenz Lifetime-Imaging-System. Hier zeigen wir ein übersichtlicher und einfacher Ansatz, der auf einem Standard-Zwei-Photonen-Imaging-System mit zwei flurescence Kanäle geleitet werden kann. Unser Ansatz nutzt eine intrinsische Gewebe ein Signal 5ND benötigt nur kontrastierende Darstellung der kortikalen Mikrozirkulation. Aufgrund der nicht-linearen, im wesentlichen binären Zunahme der Fluoreszenz bei NADH funktional Sauerstoffgrenzkonzentrationen 1, erhöhte intrinsische NADH Fluoreszenz nur in Bereichen mit hohem, metabolisch begrenzen Hypoxie beobachtet. Eine wichtige Folgerung ist, dass Gewebe Grenzen der Sauerstoffdiffusion aus kortikalen Mikrogefäße direkt von zylindrisch geformten Intensität Veränderungen der endogenen NADH Fluoreszenz zu beobachten. Wir bezeichnen diese Strukturen als Krogh Zylinder, weil der Begriff der zylindrisch geformte Strukturen, die das Volumen des oxygenierten umgebende Gewebe ein Blutgefäß durch definieren August Krogh eingeführt wurde, und wurde kürzlich experimentell beobachteten mit Zwei-Photonen-Imaging-NADH ein. Krogh Zylindern Bilder können in 3D, indem sie eine Z-Stapel von Bildrahmen gesammelt werden. Sie sind besonders deutlich in der Nähe des durchdringenden Arteriolen und sie sind nämlich kongruenth Kapillare erschöpft periarteriolären Gewebszylinder 1,4. Um eine objektive Bestimmung des Krogh Gewebe Zylinder Radius R (siehe Abschnitt 5.2) messen wir ihre radiale Pixelintensitätswerte innerhalb eines klar definierten Segment zwischen der Mitte des Zylinders und der äußeren Grenze mit dem Matlab-Funktion &quot;improfile&quot; bieten. Der äußere Rand des Segments sollte so gewählt werden mit einem Sicherheitsabstand über die sichtbare Grenze verlängert werden kann. Um das Signal-Rausch-Ebene zu verbessern averageed wir über alle radialen Linien benötigt, um den sichtbaren Zylinder Segment bei 1 °-Schritten zu decken. Die daraus resultierende mittlere radiale Intensitätsprofil innerhalb des Segments wiesen einen starken Anstieg, der auf den sichtbaren Gewebe-Grenze R entsprach. Die passten wir noch eine sigmoide Funktion (zB Boltzmann-Funktion) mit dem gemittelten radialen Intensitätsverlauf und nutzte seine Wendepunkt (auch als x 0 genannt) als eine Definition von R. Die entsprechenden zwei-pHoton Mikroangiographie (Texas-Rot) zeigte den Querschnitt eines einsamen zentrale Blutgefäß in der Mitte des Zylinders. Der Durchmesser des zentralen Blutgefäß direkt angewendet werden, um r zu bestimmen. Zwei-Photonen-Imaging-NADH bietet die gleiche räumliche Auflösung als die gleichzeitige hochauflösende Bildgebung der kortikalen Mikroangiographie. Ein wichtiges Merkmal für die quantitative Anwendung dieses Verfahrens ist, daß p 50 des NADH Fluoreszenzanstieg wurde gemessen, um von 3,4 sein ± 0,6 mm Hg 1 und dass die NADH-Fluoreszenzintensität als eine Funktion der mikroregionale Gewebe pO 2 kann mathematisch beschrieben werden eine sigmoidale Funktion. . Wir zeigen, dass diese Technik, um Brain Bereichen, die besonders anfällig für Hypoxie (durch Verringern Sauerstoffgehalt in der Luft um 10%) zu identifizieren. Wir zeigen auch, dass Sauerstoffdiffusion eine einfache geometrische perivaskuläre Muster folgt. Ein critschen Schritt dieses Verfahrens ist die Qualität des Schädelfenster Herstellung. Die Operation sollte nur geringe Schäden, um nicht den Blutfluss in den exponierten Bereich stören. Eine Sorge ist, dass in einer chirurgisch kompromittiert Vorbereitung, die Rinde unter dem Fenster kann hypoxischen zunächst unter Ausschluss irgendwelcher aussagekräftige Experimente. Ein gut vorbereiteter kranialen Fenster sollte intakt Dur-und Moll Blutgefäße mit lebendigen Blutfluss in allen Schiffstypen und ohne signifikante Blutungen entlang der Kanten auf. Unter normoxischen Bedingungen (PaO2 80-100 mmHg, Sp. 97-99% O2) das Hirnparenchym sollten einheitliche, homogene NADH Fluoreszenz ohne auffällige, helle Gewebe Patches mit erhöhten NADH Fluoreszenz zeigen. Eine grundlegende physikalische Beschränkung unseres Ansatzes ist Eindringtiefe begrenzt. Die blau-grüne NADH Fluoreszenz im Gehirn ist schnell gedämpft durch Hämoglobin-Absorption und Streuung Gewebe bei diesen Wellenlängen. Selbst mit hoher numerischer Apertur (z. B. 1,05) WasserImmersionsobjektive Zwei-Photonen-Imaging-NADH ist derzeit auf kortikalen Schichten I und II beschränkt. Diese Einschränkung ist wissenschaftlich relevant, weil Energiestoffwechsel in oder in der Nähe der weißen Substanz wird wahrscheinlich von grauen Substanz unterscheiden. Jedoch würde die Untersuchung der tiefen kortikalen Strukturen wie Schichten IV-VI oder subkortikalen Strukturen wie weißen Substanz oder im Striatum erfordern die Verwendung von spezialisierten Mikrolinsen wie bei der Maus in vivo Cortex 6 beschrieben. NADH-basierte Messung der Sauerstoffdiffusion Grenzen kann besonders nützlich sein, wenn sie mit anderen Messungen, wie Analysen der funktionellen Hyperämie, und den Nachweis von Kapillare Fluxraten 7 zusammengefasst. Zum Beispiel kann diese Technik geeignet ist, Hypoxie Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit (AD)-Modelle zu visualisieren. Die einfache Geometrie der Sauerstoffdiffusion ermöglicht es, die Sauerstoff-Gradienten in mikrovaskulären Betten unter Umständen, wo Kapillardichte ist de vorherzusagenerhöhte 8 (z. B. AD 9) und zu prüfen, ob Hirngewebe Regionen mit reduzierter Kapillardichte ein erhöhtes Risiko für Schäden, die durch Hypoxie Mikrohüben sind. Die Fähigkeit, Bild microregionally ermöglicht es auch, die Geometrie und Größe des Gewebes Mikrohüben prüfen und zu bestimmen das Volumen des Gewebes, in dem Hypoxie auftritt, sowie die Beziehung zwischen Gewebehypoxie und nachfolgenden neuronalen Tod oder Umbau Kapillare 10. Schließlich, da Erhöhungen der endogenen NADH Fluoreszenz die direkte Folge der akuten mitochondriale Dysfunktion sind, erstellt diese Methode die Möglichkeit, NADH-Bildgebung als eine spezifische Reporter für neuronale Energiestoffwechsel 11 und einen Proxy für mitochondriale Dysfunktion zu verwenden. Zusammenfassend ist Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz eine einfache, anspruchslose Tool, mit dem Sauerstoffversorgung und-verbrauch im Gehirn sowohl unter normalen verstehen kannund in pathologischen Zuständen.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Heizkissen </td><td> Jenseits von Bodi Hitze </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Augensalbe (Künstliche Tränen) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidon-Iod-Lösung 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eisenchlorid 10% ige Lösung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zement </td><td> Stoelting Unternehmen </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Cyanacrylat 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> MicroTorque II Handstück Kit </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 Bohrer </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten # 5/45 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 Deckglas </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fotovervielfacherröhre </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: Saphir-Laser-Mai-Tai </td><td> Spectra-Physics </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

Die Fähigkeit des Gehirns, um auf einem hohen Niveau der metabolischen Funktion abhängig von der Nachfrage kontinuierliche Sauerstoffversorgung durch den Blutfluss und Gewebe Sauerstoffdiffusion. Hier präsentieren wir eine visualisierte experimentellen und methodischen Protokoll direkt sichtbar mikroregionale Gewebehypoxie und perivaskuläre Sauerstoff Gradienten in der Maus Cortex abzuleiten. Es ist auf dem nicht-lineare Beziehung zwischen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) endogenen Fluoreszenzintensität und Sauerstoff-Partialdruck in dem Gewebe, wo das Gewebe NADH-Fluoreszenz abrupt am Gewebe Sauerstoff unter 10 mmHg 1 beobachtet bezogen. Wir verwenden zwei-Photonen-Anregung bei 740 nm, die für die gleichzeitige Anregung der intrinsischen Fluoreszenz NADH Gewebe und Blutplasma mit Texas-Red Dextran gegenübergestellt werden können. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Ansätzen gehören die folgenden: es nutzt eine intrinsische Gewebe Signal und kann mit Standard-Zwei-Photonen in vivo im werdenAltern wird gebraucht und es erlaubt eine kontinuierliche Überwachung im gesamten Sichtfeld mit einer Tiefenauflösung von ~ 50 um. Wir zeigen, dass Hirngewebe Bereichen am weitesten von zerebralen Blutgefäße gefährdete Gebiete, die Wasserscheide der Erste, der sich funktionell hypoxischen nach einem Rückgang in der vaskulären Sauerstoffversorgung sind entsprechen. Diese Methode erlaubt es, Bild mikroregionale kortikaler Oxygenierung und ist daher nützlich für die Überprüfung der Rolle der Unangemessenheit oder des eingeschränkten Sauerstoffversorgung im Gewebe neurovaskulären Erkrankungen und Schlaganfall.

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Hier beschreiben wir eine Methode, um direkt zu visualisieren mikroregionale Gewebehypoxie in der Maus Kortex<em&gt; In-vivo-</em&gt;. Es wird auf gleichzeitigen Zwei-Photonen-Bildgebung von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und der kortikalen Mikrozirkulation bezogen. Diese Methode eignet sich für hochauflösende Analyse von Gewebe-Sauerstoffversorgung.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

detection-microregional-hypoxia-mouse-cerebral-cortex-two-photon

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16.0K Aufrufe.  University of Rochester Medical Center. Hier beschreiben wir eine Methode, um direkt zu visualisieren mikroregionale Gewebehypoxie in der Maus Kortex In-vivo-. Es wird auf gleichzeitigen Zwei-Photonen-Bildgebung von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und der kortikalen Mikrozirkulation bezogen. Diese Methode eignet sich für hochauflösende Analyse von Gewebe-Sauerstoffversorgung.