עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי עין R01EY017925 וR21EY020985 ומימון מהיסודות דנה וייטהול לPK אנו מודים גם מתיו Petrella לסיוע בפעולות כירורגיות; גרייס הדיון לאיתור הדנדריטים המוצגים באיור 5A; וPratik Chhatbar עבור הערות על כתב היד.

1. הכנת כירורגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה ורציפות לפקח על קצב לב, בסופו של גאות ושפל CO 2, EEG, וטמפרטורה. כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדה השתמשה ומן האוניברסיטה לרפואה של דרום קרוליינה והתבססו על אלה שפורסמנו 9,15 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את פני השטח הגבי של הגולגולת על ידי חיתוך העור בסכין אזמל. לנתח את רקמות חיבור המונחים על עצם שימוש במגרדת Brudon. נקה את עצם השימוש applicators חוד כותנה וכותנת גזה. החל שעוות עצם (לפי צורך) לגולגולת, כדי לעצור את הדימום מזדמן דרך ורידי שליח קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף טיטניום או צלחת ראש נירוסטה לגולגולת (מעל האזור של עניין שבו יבוצע craniotomy) באמצעות מלט שיניים מעורבות בצבע שחור (ראה חומרים). פתח מלבני במרכז צלחת הראש מספק גישה לcraniotomy והדמיה אופטית. צרף קאמרי מתכת על גבי הצלחת בראש. חדר זה ישמש כמאגר לנוזל הדמיה עם העדשה האובייקטיבית הטבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח את הצלחת עד ראש xy שלב באמצעות עמודי מתכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דק שטח גדול של העצם בתוך הפתח המלבני של headplate באמצעות מקדחת רופא שיניים. האזור לדילול חייב להרחיב גם מעבר לגבולות craniotomy המתוכנן. הגולגולת העבה של יונקים שאינם מכרסמים חייבת להיות דלילה אם תמונות ברזולוציה גבוהה שאפשר לרכוש מהניאוקורטקס כי באתר craniotomy, העובי של עצם יכתיב את העובי של agarose בין coverglass ומשטח neocortical (ראה בהמשך) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדחת x מתווית 2 2 מ&quot;מ מרובעת בעצמות לcraniotomy. שטוף את התא מעת לעת עם נוזל השדרתי מלאכותי טרי (ACSF) להסיר ברי עצם ולהקטין את פיזור חום לקליפת המוח הבסיסית. החל שעוות עצם לפי צורך, כדי לעצור את הדימום מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lift דש העצם עם # 3 מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל אבל את השכבה התחתונה של דורה באמצעות מלקחי קנס (# 5CO) ומספרי אביב Vannas. הדורה ביונקים שאינם מכרסמים היא עבה ואטומה, אבל ניתן להסיר בשכבות נפרדות. דימום הוא נדיר, אך ניתן לעצור עם Gelfoam ושאריות דם צריכות להיות בעדינות להסיר את השכבה הנותרת של דורה באמצעות מלקחיים ושטיפה בACSF. השכבה הסופית של דורה היא שקופה וכלי pial צריכים להיות נראים בבירור דרכו. השארת השכבה האחרונה של דורה שלמה במהלך הדמית אות הפנימית תגדיל את שיעור ההצלחה של העמסת כמות גדולה של סידן אינדיקטורים ניאון לשלב הדמית שני הפוטונים הבאים של הניסוי (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול ירידה של 2% agarose החם (מומס בACSF) ולמקם coverglass מייד על פתיחת הגולגולת. בדקו craniotomy כדי להבטיח שפעימות לב וכלי דם ונשימה הן מינימאליות באמצעות מיקרוסקופ ניתוחי לנתח או oculars של שנימיקרוסקופ פוטון במצב בהיר תחום. </li></ol> 2. אותות אופטיים פנימית הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ג&#39;ל קצף ספוג ACSF סביב חלק החיצוני של coverglass למנוע agarose מההתייבשות במהלך הדמית אות הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף המצלמה הפנימית אות הדמית CCD ליציאת C-Mount הסטנדרטי על גבי מיקרוסקופ שני הפוטונים (איור 1). הנח את מקור האור מאיר על שולחן האוויר סמוך לבמת xy (איור 1 א). עמדה ולאבטח את מדריכי האור מעל craniotomy וheadplate / קאמרי (1B איור). לחזור בי Dichroic הראשוני ומראה, שמתחת C-Mount היציאה כך שהאור האדום משתקף נזקק לאותות פנימיים יעבור ישירות מcraniotomy למצלמת CCD (תרשים 1C-D). שימוש האובייקטיבי 4x אוויר (0.13 NA, 17 המ&quot;מ WD), שדה 2 x 2 מ&quot;מ של תצוגה הוא זמין להדמית אות פנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מסנן חום בlנתיב ight למנוע קליפה מהחימום. השתמש במסנן שמעביר אור הירוק (546 ננומטר מרכז λ) ולהקליט את תמונת התייחסות דיגיטלית של כלי הדם על פני השטח של קליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מוקד z ל500 מיקרומטר מתחת לפני שטח קליפת המוח. השתמש במסנן אדום (630 ננומטר מרכז λ) כדי להאיר את הקליפה למדידת אותות פנימיים. מקם את מדריכי אור כזה, שעל פני השטח של קליפת המוח הוא מוארים באופן אחיד. מגן craniotomy מהאור מיוצר על ידי תצוגת הגירוי החזותית. מציג רצף של גירויים חזותיים ותמונות נתוני reflectance שיא. כדי ליצור מפת התמצאות בתוך 10 דקות, לאסוף נתונים המתאימים 4 חזרות של רצף של 8 גירויים (4 כיוונים ושני כיוונים לכל כיוון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני אותות הפנימיים כדי ליצור מפת התמצאות צבע שווא. בחר אזורי היעד פוטנציאליים לתיוג שני פוטונים של תאי עצב, למשל, הייחודויות אורינטצית שבשבת - נקודות במפה שביכל האוריינטציות המועדפות מכונסות (איור 2 א). שכבת מפת ההתמצאות והדימוי של מערכת כלי הדם לפני שטח קליפת המוח (איור 2B-C). השתמש בפריסה של תחומים פונקציונליים ואת המיקום של ספינות שטח גדולות כדי לבחור יעד, הימנעות ממקומות עם כלי דם גדולים וarterioles 15. </li></ol> 3. טוען גורף של אינדיקטורים סיד פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של Pluronic 20% / DMSO ידי הוספת Pluronic 1 גרם בDMSO 5 μl. מחמם את התערובת על 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לפזר את Pluronic לחלוטין. לאפשר לתערובת להתקרר לטמפרטורת חדר. הוסף 4 μl של תערובת Pluronic / DMSO לבקבוקון 50 מיקרוגרם של מחוון סיד ניאון אורגון גרין 488 Bapta-1 בבוקר (OGB-1 בבוקר). ואז להוסיף μl 1 מתוך צבע אדום (אלקסה פלואוריד 594, 2 פתרון מניית מ&quot;מ) ו35 μl של פתרון פיפטה (ראה חומרים) לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ OGB-1 AM. Sonicate הפתרון לשעה וחצי באמבטיה מקוררת מים ולאחר מכן סרכזת עם 0.45 מיקרומטר מסנן כדי להסיר זיהומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך פיפטה להתחדד ארוכה עם קוטר קצה חיצוני של 2.0-2.5 מיקרומטר. טען 5 μl של תערובת הצבע לתוך פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השכבה האחרונה של דורה כדי להקל על החדרת פיפטה ולקבל את התמונות באיכות הגבוהה ביותר של שני הפוטונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המיקום המדויק על פני קליפת המוח שפיפטה יש להציב על מנת להגיע ליעד שלו בקליפת מוח השכבה 2/3. היעד שנקבע מראש בקליפת המוח שלנו הוא ייחודיות שבשבת במפת ההתמצאות (איור 2). פיפטה חייבת להיות מונע אל קליפת המוח בזווית 30 מעלות כדי לעבור בין קיר החדר והאובייקטיבי. לכן, כדי לתייג את אזור היעד של 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח של קליפת המוח, בעמדת כניסת פיפטה על פני קליפת המוח תהיה כ 350 מיקרומטר הרוחבי למיקום היעד (איור 3 א.ב.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את במת xy (שבחיה וpmicromanipulator ipette ממוקם) למרכז עמדת כניסת משטח קליפת המוח תחת אובייקטיבי (האיור 3C). השתמש אובייקטיבי 20x או 40X עם מרחק עבודה (WD) של לפחות 3 מ&quot;מ (ראה חומרים) כדי להבטיח שפיפטה קלות תיכנס לקליפה בלי לגעת אובייקטיבי או העצם לאורך קיר craniotomy. ברגע שעמדת הכניסה מרוכזת תחת אובייקטיבי, להגביה את מיקום Z של המטרה על ידי 2 מ&quot;מ (האיור 3D). עם האור הירוק עלית פלואורסצנטי מופעל לדמיין אלקסה צבע אדום בפיפטה, השתמש בציר האלכסוני של micromanipulator לעבור פיפטה עד שקצו הוא מרוכז (וממוקד) במטרה ישירות מעל עמדת כניסת משטח קליפת המוח ( איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיך את פיפטה האנכית (לאורך ציר z) עד פיפטה מגיעה לפני השטח של קליפת המוח (איור 3F), ואילו ברציפות צפיית קצה פיפטה דרך OCUלארס של המיקרוסקופ. שימוש בתאורה בהירה שדה, כלי קליפת מוח משטח הדם וקרומי meningeal נותר (פיא והארכניאיד) הם נראים בקלות כפיפטה מתקרבת משטח קליפת המוח. אם פיפטה אינה מגיעה עמדת הרשומה הרצויה, להעלות את פיפטה ולכייל מחדש מיקוד המבוסס על ציוני דרך כלי הדם על פני השטח של קליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המטרה, פתיל נוזל שדרה עודף מcraniotomy ולייבש את העצם הסמוך באמצעות חניתות קליטה נטולת מוך. תחול ירידה של 3% agarose החם (מומס בACSF) כדי לייצב את הקליפה שנראית מבעד לcraniotomy (האיור 3G). ב- מכרסמי עישון, 3% agarose יש צורך לצנן את הפעימות לספיגה מוצלחת של צבעי ניאון על ידי נוירונים. עבור דימות אופטי אות פנימית רק 2% agarose נדרש משום ששילוב של 2% agarose וcoverglass מספק את היציבות הדרושה. הנה, לא coverglass משמש לצעד לצבוע טעינה כך 3% agarose הואצורך. לאחר agarose בסס, הכנס אובייקטיבי 40X (0.8 NA, 3.3 המ&quot;מ WD) ולמלא מחדש את בית הנבחרים בACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור משדה בהיר לצפיית שני פוטונים ולאתר את קצה פיפטה. שימוש בציר האלכסוני של micromanipulator, הזז את פיפטה עד שקצו מגיע לעומק הרצוי בקליפת המוח (האיור 3H). פחזניים פליטת לחץ מזדמן של תערובת הצבע (כמה psi, דופק בכל 0.1 שניות) יסייעו למנוע קצה פיפטה מסתימה. בגלל OGB-1:00 הופך גלוי רק על להיכנס לתאים, האדום אלקסה הצבע הוא קריטי להדמיה של קצה פיפטה בתוך הקליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתנסה לטעון נוירונים בקליפת מוח השכבה 2/3 במינון המלא של צבע, מחדש להתמקד במטרה על פני קליפת המוח כדי לאשר את העומק של קצה פיפטה ולהבטיח שהקצה הוא במיקום היעד מבוסס על הפריסה של כלי דם על פני שטח. אם פיפטה היא בשכבה 2/3, שאיפות קטנות של תערובת הצבע צריכות להאירחלל חוץ תאי ולחשוף הרכבה צפופה של גופי תא מעגליים כצללים כהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעינת גופי תא עצביים בתחום קוטר מיקרומטר קליפה 300-600, מזריק את תערובת הצבע לתוך חלל החוץ התאי באמצעות 30-90 פעימות, דופק בכל 1.0 שנייה, 2-10 psi. פולסים של לחץ לא צריכים להיות כל כך חזקים שהרקמה עוברת. לאחר ההזרקה היא מוחלטת, לחכות כמה דקות, ואז להסיר את הצינורית והאובייקטיבית. חכה לשעה 1 כדי לאפשר OGB-1 בבוקר ועד שנלקח במלוא על ידי נוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את agarose משמש לטעינת הצבע ולשטוף תא ההקלטה. שים טיפה קטנה של 2-3% agarose על פני שטח ואת מקום coverglass מעל craniotomy במהירות. בגלל צבעי הניאון הם רגישים לאור, להימנע מחשיפת יתר בקליפת המוח לשדה בהיר או אור הניאון עלית. הכנס NA (1.0) 20x אובייקטיבי גבוהה לבעל האובייקטיבי ומחדש מרכז אזור קליפת המוח מתויג תחת אובייקטיבי באמצעות שלב xy. מגן craniotomy מאקסמקורות traneous אור, למשל, תצוגת גירוי חזותית, תוך שימוש במספר שכבות של חומר אפל. </li></ol> 4. Electroporation תא בודד של צבעי ניאון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימוד מורפולוגיה הדנדריטים, להכין תמיסה של מיקרומטר Alexa פלואוריד 100 594 (01:20 דילול בACSF מתוך 594 מניות 2 מ&quot;מ Alexa פלואוריד). להדמיה תפקודית של הדנדריטים מלח OGB ניתן להשתמש 16,17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך פיפטה להתחדד ארוכה עם גודל קצה 1 מיקרומטר ולטעון 5 μl של צבע לתוך פיפטה. כל הצעדים האחרים של מיקוד תחום תפקודי זהים לשיטת הטעינה בתפזורת (תרשימי 1-3). כדי למקם את קצה פיפטה סמוך לממברנת גוף תא עצבית, לפקח על העלייה בעכבת אלקטרודה ולהחיל פחזניים לחץ של צבע כדי להאיר את חלל החוץ התאי ולראות גופי תא כצללים במהלך הדמית שני פוטונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קצה פיפטה צמוד לממברנת גוף תא עצבית, השתמש 800A Axoporator ליישםקטניות (1-3 -8 ל -10 וולט, 10 אלפיות דופק). המילוי המיידי של נוירון עם צבע הוא בקלות דמיין עם מיקרוסקופ שני פוטונים. הסר את פיפטה ולאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של דנדריטים ואקסונים in vivo. </li></ol>

<ol>
	<li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex.">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li><li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns.">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li><li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels.">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li><li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18.">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity.">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li><li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17/18+border+in+cat+visual+cortex.">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li><li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex.">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li><li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+Cortical+Column+Would+that+Be.">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).</li><li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex.">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li><li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging:+comparison+with+the+primary+visual+cortex.">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li><li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo.">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling.">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li><li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation.">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li><li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex.">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li><li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons.">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li><li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons.">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li><li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+Based+on+Intrinsic+Signals.">Optical Imaging Based on Intrinsic Signals.</a> Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).</li><li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo.">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li><li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex.">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מציגים שיטה למקד את התיוג של גופי תאים עצביים (או דנדריטים ואקסונים) בתחומי מייקרו תפקודיים שנקבעו מראש של הניאוקורטקס. מיזוג הדמיה אופטית אות פנימית עם מיקרוסקופ שני פוטונים מציע אפשרות לקביעת שהסינפסות ותאים לתרום לתחום המייקר של כל מפה, בין אם פונקציונלית קוש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. תמיכת חיים / ניסוי מכין </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> וטרינר ובסטר </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> מאדה isoflurane </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> חימום שמיכת משוב מוסדרת </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> א.ק.ג. לפקח </td><td> Digicare יורפואית </td><td> LifeWindow לייט </td><td></td></tr><tr><td> מגבר EEG </td><td> מערכות AM </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> צג התצוגה EEG </td&gt; <td> היולט פקארד </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> בסופו 2 צג CO גאות </td><td> RESPIRONICS </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> לייעל אוורור </td></tr><tr><td> שבבי מקדח קרביד לעצם קידוח </td><td> הנרי שיין </td><td> בסדר (0.5 מ&quot;מ קצה) וגס (1.25 טיפ מ&quot;מ) </td><td></td></tr><tr><td> מלט לheadplate / קאמרי </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> צבע שחור אבקת טמפרה </td><td> סרג&#39;נט האמנות בע&quot;מ </td><td> 22-7185 </td><td> הוסף למלט כדי לשפר אור מיגון ולצמצם השתקפויות </td></tr><tr><td> Agarose - סוג III- </td><td> סיגמא </td><td> A9793 </td><td> לצמצום פעימות במהלך אות הפנימית והדמית שני פוטונים </td></tr><tr><td> Coverglass: קוטר 5 או 8 מ&quot;מ, עובי 0.17 מ&quot;מ </td><td> דיוק בעולםstruments </td><td> 502040, 502041 </td><td> לצמצום פעימות במהלך ההדמיה, coverglass ניתן לחתוך לפי צורך </td></tr><tr><td> curettes Brudon </td><td> ג&#39;ורג&#39; Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> ניקוי משטח גולגולת </td></tr><tr><td> שעוות עצם </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> מהירות לעצור את הדימום </td></tr><tr><td> כותנת כטיפ מוליך </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 72308-05 </td><td> משטח עצם נקי ויבש </td></tr><tr><td> דומון # 5CO מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11295-20 </td><td> תפוס שכבות בודדות של דורה או פחז </td></tr><tr><td> Vannas מספרי האביב </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15000-03 </td><td> Cut דורה </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> פייזר </td><td> 09-0396-05 </td><td> כדי לעצור את הדימום בדורה </td></tr><tr><td> חניתות קליטה</td><td> כלי מדע פיין </td><td> 18105-01 </td><td> פתילת אולטרה מהיר ונטול מוך של CSF </td></tr><tr><td> חומרי Blackout </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> החומה craniotomy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. לצבוע הכנה / זריקה </td></tr><tr><td> Sulphoxide דימתיל (DMSO) </td><td> סיגמא </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> סיגמא </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> אורגון גרין 488 Bapta-01:00 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> מחוון סידן </td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> מסנן צנטריפוגלי (0.45 גודל נקבובי מיקרומטר) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> כדי להסיר זיהומים לפני ההזרקה </td></tr><tr><td> זכוכית פיפטה חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> ורוסיליקט זכוכית filamented נימים (בקוטר 1.5 מ&quot;מ חיצוני) </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> 1B150F-4 </td><td> פיפטה הפליטה דיי </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> אפנדורף </td><td> 5242 956 003 </td><td> לטעינת צבע לתוך פיפטה </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> סאטר מכשירים </td><td> MP-285 </td><td> כדי למקם פיפטה </td></tr><tr><td> בקר דופק לחץ </td><td> פארקר Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> להזרקת לחץ של הצבע </td></tr><tr><td> electroporator תא בודד </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> Axoporator 800A </td><td> לelectroporation של הצבע </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. העצמותי imaגינג </td></tr><tr><td> מטרת 4x (0.13 NA, 17 המ&quot;מ WD) </td><td> אולימפוס </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> חומרה / תוכנה פנימית </td><td> אופטי הדמיה בע&quot;מ </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> תוכנת VDAQ משמשת להדמית אפיזודי </td></tr><tr><td> CCD מצלמה </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> אספקת חשמל מקור אור </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15 מ&#39; </td><td></td></tr><tr><td> מקור אור </td><td> אופטי הדמיה בע&quot;מ </td><td> HAL 100 </td><td> עוצמת אור על פני השטח של קליפת המוח היא 3-5 mW </td></tr><tr><td> גרין מסנן (לתמונת כלי דם) </td><td> אופטי הדמיה בע&quot;מ </td><td> λ = 546 ננומטר (30 ננומטר bandpass) </td><td> לתמונת התייחסות של מערכת כלי דם לפני שטח </td></tr><tr><td> מסנן אדום (לאות פנימית) </td><td> האופטי Imaging בע&quot;מ </td><td> λ = 630 ננומטר (30 ננומטר bandpass) </td><td> כדי לאסוף את האותות פנימיים </td></tr><tr><td> חום מסנן </td><td> אופטי הדמיה בע&quot;מ </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. שני פוטוני אסדה / הדמיה </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שני פוטונים ותוכנה </td><td> טכנולוגיות ערבה </td><td></td><td> ראה שן et al. 2012 לנתיב אור, מסננים וכוח הליזר </td></tr><tr><td> טי: ספיר ליזר </td><td> ספקטרה-פיסיקה </td><td> מאי טאי XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0.5 NA; 3.5 המ&quot;מ WD) </td><td> אולימפוס </td><td> UMPLFLN20X </td><td> מטרת 0.5 NA משמשת רק ליישור פיפטה מעל craniotomy (לא עבור הדמית 2 פוטון) </td></tr><tr><td> 20x (1.0 NA; 2.0 המ&quot;מ WD) </td><td> אולימפוס </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40X (0.8 NA; 3.3 המ&quot;מ WD) </td><td> אולימפוס </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> שולחן אוויר </td><td> ניופורט </td><td> ST-200 </td><td> הכנה מבודדת מתנודות חיצוניות </td></tr><tr><td> שלב xy </td><td> של מייק המכונית ושות (Attleboro, MA) </td><td></td><td> נושא ניסוי וmicromanipulator סאטר הונח על במת xy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מתכונים </td></tr><tr><td> נוזלים מלאכותיים Cerebro-Spinal </td><td> NaCl (135 מ&quot;מ), KCl (5.4 מ&quot;מ), MgCl 2 (1.0 מ&quot;מ), CaCl 2 (1.8 מ&quot;מ), HEPES (5 מ&quot;מ), 7.4 pH </td></tr><tr><td> פתרון פיפטה 14 </td><td> NaCl (150 מ&quot;מ), KCl (2.5 מ&quot;מ), HEPES (10 מ&quot;מ), 7.4 pH </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

בקליפת המוח החזותית הראשונית של יונקים שאינם מכרסמים, נוירונים מקובצים בהתאם להעדפותיהם לתכונות גירוי כגון כיוון 1-4, כיוון דומיננטי 5-7, 8,9 עיני ופער משקף 9. הסלקטיביות יווניות היא התכונה למדה הנרחב ביותר והמפה רציפה עם פריסת עין תקופתית לכיוון מועדף היא הווה על פני כל קליפת המוח החזותי הראשונית 10,11. שילוב התרומות סינפטיים, סלולריות ורשת המובילות לתגובות סלקטיבית גירוי במפות תפקודיות אלה מחייב את ההכלאה של שיטות הדמיה שמשתרעות על פני תת מיקרון לקשקשים מרחביים מילימטר. עם הדמית אות אופטית פנימית קונבנציונלית, הפריסה הכללית של מפות פונקציונליות על פני כל השטח של קליפת המוח החזותית ניתן לקבוע 12. הפיתוח של מיקרוסקופיה in vivo שני פוטונים באמצעות סיד צבעים רגישים מאפשר לאדם לקבוע synaptקלט ic מגיע קוצים הדנדריטים בודדים פעילות 13 או להקליט בו זמנית ממאה גופי תא עצביים בודדים 6,14. כתוצאה מכך, שילוב הדמית אות פנימית עם הרזולוציה מרחבית תת מיקרון של מיקרוסקופיה שני פוטונים מציע את האפשרות של קביעה בדיוק אילו מגזרים ותאים דנדריטיים לתרום לתחום המייקר של כל מפה תפקודית בהניאוקורטקס. כאן אנו מדגימים שיטת תשואה גבוהה להשגת מהירות מפת התמצאות קליפת מוח ומיקוד תחומים ספציפיים במייקר המפה פונקציונלית זו לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון ביונקים שאינם מכרסמים. עם אותו מיקרוסקופ המשמש להדמית שני פוטונים, אנחנו מייצרים 1 מפת התמצאות באמצעות דימות אופטי אות פנימית. ואז אנו מראים כיצד למקד-תחום המיקרו של ריבית באמצעות micropipette עמוס צבע או לתווית אוכלוסייה של גופי תא עצביים או תווית נוירון כזה שדנדריטים, קוצים ואקסונים נראים באחתvivo. החידודים שלנו על פני שיטות הקודמות להקל בחינת מבנה יחסי תפקוד עצביים עם רזולוציה תת הסלולר במסגרת של ארכיטקטורות פונקציונליות neocortical.

כדי להמחיש את הדיוק של שיטות תיוג הצבע שלנו, אנחנו ממוקדים בתחום מייקרו הקטן ביותר של כל מפה פונקציונלית ידועה בניאוקורטקס אינם המכרסם. מנוקד בדלילות לאורך מפת ההתמצאות בקליפת הראייה העיקרית הם נדירים. אלה מתרחשים בנקודות בי כל הכיוונים המועדפים להתכנס כך שבשנת צבע ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging at JoVE.com

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

שיטה מתוארת לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון בתחומי מייקר מראש תפקודיים של הניאוקורטקס. ראשית, דימות אופטי אות פנימית משמש להשגת מפה תפקודית. אז מיקרוסקופ שני פוטונים משמש לתווית ונוירונים תמונה בתוך תחום מייקרו של המפה.

תיוג ממוקד של תאי עצב בתחומים ספציפיים מייקר פונקציונליים של הניאוקורטקס ידי שילוב אותות פנימיים והדמית שני פוטונים

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  Medical University of South Carolina. שיטה מתוארת לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון בתחומי מייקר מראש תפקודיים של הניאוקורטקס. ראשית, דימות אופטי אות פנימית משמש להשגת מפה תפקודית. אז מיקרוסקופ שני פוטונים משמש לתווית ונוירונים תמונה בתוך תחום מייקרו של המפה.

Video: Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.