עבודה זו נתמכה על ידי הפרס NSF # 0920274 ודרום קרוליינה תחנת ניסוי פרויקט (SC-1700340) כדי KSS. נייר זה לא תרומה טכני 5929 של תחנת הניסיונות אוניברסיטת קלמסון.

התוכנית הכוללת של פרוטוקול זה הוא התווה באיור 1. 1. הפתרון הכנה Curves ואת מבחני תקן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 100 מ&quot;ל של פתרון mol / L 2 של hydroxylamine-HCl. לשקול את 13.9 גרם של hydrochloride hydroxylamine (MW 69.49 g / mol) ו להתמוסס במים כ 50 מ&quot;ל מזוקקים-deionized (DDH 2 O). התאם את ה-pH ל 7.0 באמצעות כדורי אשלגן הידרוקסידי או פתרון מרוכז. תביאו את נפח סופי 100 מ&quot;ל. הפתרון יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר למשך עד 30 יום או 4 ° C עד 90 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 100 מ&quot;ל של כלוריד וברזל / פתרון חומצה הידרוכלורית. לשקול את כלוריד 13.5 גרם וברזל (MW 270.32 g / mol) ו להמיס כ 50 מ&quot;ל DDH 2 O. הוסף 41.3 מ&quot;ל חומצה הידרוכלורית מרוכזת (12.1 mol / L) ומביאים נפח סופי של 100 מ&quot;ל. הריכוז הסופי של כלוריד וברזל יהיה 0.5 mol / L ואת הריכוז הסופי של חומצה הידרוכלורית תהיה 5 mol/ ל &#39; הפתרון מאוחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 100 מ&quot;ל של פתרון mol / L 1.84 של חומצה trichoroacetic. לשקול את 30.0 גרם של חומצה Trichloroacetic (MW 163.39 g / mol), מתמוססים DDH 2 O ולהביא את נפח סופי 100 מ&quot;ל. הפתרון מאוחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של פתרון mol / L 0.1 פוספט אצטיל. לשקול את פוספט 0.092 גרם אצטיל (MW 184.06 g / mol), מתמוססים DDH 2 O ולהביא את נפח הסופי מ&quot;ל 5. הפתרון Aliquot לצינורות microcentrifuge (0.25 מ&quot;ל לכל צינור) ולהקפיא ב -20 ° C עד השימוש. פתרון מופשר צריך להיות ממוקם על הקרח והוא יכול לשמש במשך שעה בערך 1. פתרון פוספט אצטיל כי הופשר לא צריך להיות refrozen מחדש בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של פתרון mol / L 0.1 של ADP. לשקול את 0.24 גרם של ADP (MW 472.5 g / mol), מתמוססים DDH 2 O, ולהביא את נפח הסופי מ&quot;ל 5. הפתרון Aliquot צינורות microcentrifuge (0.5 מ&quot;ל לכל צינור) ולהקפיא ב -20 ° C עדהשימוש. שמור על פתרון מופשר על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של פתרון mol / L 1 של טריס. לשקול את 6.06 גרם טריס (MW 121.14 g / mol), וכן להמיס 40 מ&quot;ל DDH 2 O. התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית ולהביא בנפח 50 מ&quot;ל הסופי. חנות פתרון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של פתרון 1 mol / L מגנזיום כלוריד. לשקול את 2.03 גרם מגנזיום כלוריד (MW 203.31 g / mol), מתמוססים DDH 2 O, ולהביא בנפח 10 מ&quot;ל הסופי. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 25 מ&quot;ל פיתוח הפתרון על ידי ערבוב כמויות שוות של הפתרון כלור / חומצה הידרוכלורית וברזל והפתרון חומצה Trichloroacetic. פיתוח פתרון צריך להיות מוכן טרי כל יום לאחסן בטמפרטורת החדר. </li></ol> 2. הכנת עקומת פוספט אצטיל רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומת אצטיל תקן פוספט נוצר באמצעות כמויות ידוע של פוספט אצטיל. עקומת סטנדרט של שישה עד בן שמונהנקודות לא מתאים. הסטנדרטים צריכים לנוע בין 0.03 ל 0.9 μmoles μmoles לכל 300 μL, אשר וקושרת לריכוזים הסופי של mmol 0.1-3 / ל &#39; לדלל את פוספט אצטיל מניות פתרון ריכוזי המתאים פתרון טריס 100 מ&quot;מ נפח סופי של 300 μL. מדגם פקד ללא פוספט אצטיל צריך גם להיות מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל תקן ופיקוח על 37 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL הפתרון hydrochloride hydroxylamine לתקן כל שליטה ומערבבים על ידי ניעור שלוש פעמים. מניחים את תקן לתוך בלוק 60 בחום C ° ו דגירה במשך חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של פתרון פיתוח הסטנדרטים ואת השליטה, מערבבים על ידי ניעור שלוש פעמים, צבע לאפשר לפתח במשך דקה אחת לפחות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל הסטנדרטים ואת השליטה microcentrifuge בבית XG 18,000 למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את דגימות spectrophotometricallyלא 540 ננומטר באמצעות 1mL cuvettes פלסטיק, באמצעות השלט כמו ריק עבור לספקטרופוטומטריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומה סטנדרטית באמצעות ניתוח נתונים מתאימים תוכנה גרפים (למשל, תוכנה Kaleidagraph Synergy). R 2 ערכים של 0.99 או יותר רצויות. הנתונים להתוות כמו ספיגת ב 540 ננומטר לעומת μmoles ההווה פוספט אצטיל. </li></ol> 3. Assay עבור פעילות קינאז Acetate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרונות תיאר, להכין תערובת התגובה המכיל ריכוז סופי של 0.1 mol / L טריס חיץ, 10 mmol / L מגנזיום כלוריד, 5 mmol / L ADP, ו 2 mmol / L פוספט אצטיל. תגובה 10 מ&quot;ל תערובת ידרוש 8.2 מ&quot;ל DDH 2 O, 1.0 מ&quot;ל פתרון טריס, 0.1 מ&quot;ל מגנזיום כלוריד פתרון, פתרון 0.5 מ&quot;ל ADP, ו 0.2 פתרון אצטיל מ&quot;ל פוספט. הפץ את תערובת התגובה ב 300 aliquots μl לצינורות microcentrifuge. לקביעת פרמטרים קינטיים ואופטימיזציה של ריכוז המצע, אחד המצע יכול להיותמגוונים אחרים המוחזקים בריכוז קבוע התגובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום דגירה התגובות דקה 1 על 37 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמות הרצוי של האנזים לתגובה ומיד להחזיר את הצינור כדי לחסום חום 37 מעלות צלזיוס. כמו כן כוללים תגובה שליטה אשר לא אנזים נוסף. אם מספר התגובות מבוצעות, להוסיף אנזים אל צינורות בזמנים קצובים. הקפידו לעקוב אחר פעם. (הערה: כמות אנזים לשמש צריך להיות מותאם על מנת להבטיח כי כל פוספט אצטיל או המצע ADP לא יהיה מדולדל - ראה סעיף דיון) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 דקות, להוסיף 50μl הפתרון hydrochloride hydroxylamine לתגובה כל הביקורת, לערבב, והמקום צינורות חום בלוק 60 מעלות צלזיוס. אם מספר התגובות הן מבוצעות, זה צריך להיעשות במרווח הזמן זהה אנזים נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובות והשליטה במשך 5 דקות על 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 &amp;mu: L הפתרון פיתוח לתגובה כל הביקורת, מערבבים, ומניחים מתלה צינור על הספסל המעבדה. אפשר צבע לפתח במשך דקה לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל צינורות microcentrifuge בבית XG 18,000 למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד דגימות spectrophotometrically ב 540 ננומטר באמצעות cuvettes פלסטיק 1mL ולקבוע את כמות להציג פוספט אצטיל בהשוואה עקומת פוספט אצטיל סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות המצע פוספט אצטיל מדולדל יכול להיקבע על ידי הפחתת כמות פוספט אצטיל שנותר לאחר התגובה האנזימטית מהסכום של פוספט האנזים אצטיל נוכח הביקורת חסר. בצע ניתוח נתונים באמצעות נתונים מתאימים תוכנה גרפים (למשל, תוכנה Kaleidagraph Synergy). R 2 ערכים של יותר מ 0.97 רצויות. </li></ol> 4. נציג תוצאות: מטרת assay זה כדי למדוד פעילות קינאז אצטט את ישיריון של היווצרות אצטט. הדבר נעשה על ידי מדידת צריכת המצע פוספט אצטיל, שכן אין מדידה קל, ישיר לייצור אצטט. פוספט אצטיל שנותר לאחר זמן נתון במהלך התגובה האנזימטית מומר hydroxamate אצטיל ובהמשך לקומפלקס hydroxamate Ferric, בעלת צבע אדמדם (איור 2) שניתן למדוד ב 540 ננומטר. עקומת הסטנדרט זוממים ספיגת לעומת ההווה μmoles פוספט אצטיל בתקן משמש כדי לקבוע את כמות הפוספט אצטיל שנותרו התגובה לכל. עקומת תקן צריך להיות ליניארי דרך נקודת האפס. עקומת תקן נציג שמוצג באיור 3 יש מדרון של 1.2332 יחידות ספיגת לכל בהווה μmole פוספט אצטיל ואת ערך R 2 של 0.99, המציין את הנתונים מתאים למשוואה ליניארית היטב. המשוואה עבור להתאים ליניארי לנתונים עקומת הסטנדרטי הוא משמש לחישוב כמות של פוספט אצטיל שנותרו התגובה. Μmolesפוספט של אצטיל נצרך נקבעת כהפרש בין μmoles של פוספט אצטיל נוכח התגובה לשלוט חסר האנזים ואת μmoles של פוספט אצטיל שנותר לאחר התגובה האנזימטית. מטוהרים, רקומביננטי מ קינאז thermophila אצטט היה assayed באמצעות פרוטוקול המתואר. עבור הניסוי שמוצג באיור 4, ריכוז ADP שנערך קבוע בשעה 5 mmol / L ואת הריכוז של אצטיל פוספט בתגובת היתה מגוונת כדי לקבוע את מ K עבור פוספט אצטיל. כצפוי, הניסוי הזה מוכיח כי האנזים כדלקמן תקן מיכאליס-Menten כמו קינטיקה של המצע כל והפיק עקומת הרוויה היפרבולי כאשר זממו פעילות מול ריכוז פוספט אצטיל. הערך לכאורה K מ &#39;עבור פוספט אצטיל היה 0.27 ± 0.01 mmol / L, אשר משווה בחיוב את הערך שפורסם מ K של 0.47 ± 0.01 mmol / L באמצעות מצמידים כמולומר 13. Assay הישיר יכול לשמש גם כדי למדוד פעילות קינאז אצטט לנצל מצעים אחר מאשר ה-ATP, דבר שאינו אפשרי באמצעות assay מצמידים סטנדרטי. מטוהרים א רקומביננטי histolytica אצטט קינאז 16, אשר מייצר PP i במקום ה-ATP בכיוון אצטט להרכיב, היה נתון assay הזה באמצעות סודיום פוספט במקום ADP. הריכוז של נתרן פוספט בתגובה התקיים קבועה 0.2 mol / L ואת ריכוז פוספט אצטיל היתה מגוונת. באשר M. thermophila קינאז אצטט, E. קינאז histolytica אצטט בעקבות מיכאליס-Menten כמו קינטיקה של פוספט אצטיל ואת עקומת הרוויה היפרבולי נצפתה (איור 5). הערך לכאורה K מ &#39;עבור פוספט אצטיל היה 0.50 ± 0.006 mmol / L. ריבס גאתרי 15 נקבע ערך K m של 0.06 mmol / L עבור פוספט האנזים אצטיל עבור הילידים, איך<html> פעם, אנזים שלהם היה רק ​​מטוהרים חלקית assay שלהם היו מעורבים ארבעה אנזימים צימוד שהיו גם מטוהרים באופן חלקי בלבד. לפיכך, קשה להשוות ישירות את הערכים הללו. פרוטוקול Scheme <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומה אצטיל תקן פוספט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזים מדולל לריכוז הרצוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את התערובת aliquot תגובה 300 μl לצינורות microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובות Preincubate על 37 מעלות צלזיוס למשך דקה 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תגובות על ידי הוספת אנזים בזמנים קצובים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף hydroxylamine במרווחים אותו כדי לעצור את תגובות דגירה ב 60 ° C למשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כלור וברזל / פתרון חומצה Trichloroacetic לפיתוח צבע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב XG 18000 לרגע 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד ספיגת ב 540 ננומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת כמות פוספט אצטיל הנצרכת על ידי השוואה עקומת סטנדרט </li></ol>tp_upload/3474/3474fig1.jpg &quot;/&gt; 1. איור פרוטוקול Scheme <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" /> באיור 2. סטנדרטים פוספט אצטיל. הגדלת הריכוזים של פוספט אצטיל היו הגיב hydroxylamine וצבע פותחה כמתואר. השליטה חסר פוספט אצטיל הוא צהוב בהיר, ותגובות המכילות כמויות גדלות והולכות של פוספט הם אצטיל ברציפות כהה בצבעו. שינוי צבע זו נמדד ב 540 ננומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" /> באיור 3. פוספט אצטיל לדוגמא עקומת סטנדרטי. כמויות משתנות של פוספט אצטיל היו הגיב hydroxylamine ופיתוח צבע פתרון ספיגת נמדדה ב 540 ננומטר. ספיגת ב 540 ננומטר לעומת פוספט μmoles אצטיל היה זממו התאמה ליניארית לנתונים יושמה. &lt;/ P&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" /> איור 4. ניצול פוספט אצטיל ידי ATP לייצור מ thermophila קינאז אצטט. הפעילות האנזימטית נקבע לכיוון היווצרות אצטט בנוכחות 5 mmol / L ADP עם ריכוזים שונים של פוספט אצטיל. כמות הנצרכת פוספט אצטיל נקבע על פי ההפרש בין הסכום ההתחלתי של פוספט אצטיל התגובה וכמות פוספט אצטיל שנותר לאחר התגובה האנזימטית. מבחני בוצעו בשלושה עותקים במוטות השגיאה המוצגת. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" /> איור 5. ניצול פוספט אצטיל על ידי i-PP לייצר E. histolytica קינאז אצטט. הפעילות האנזימטית לכיוון היווצרות אצטט נקבע בנוכחות 0.2 mol / L נתרן זרחתי עם ריכוזים שונים של פוספט אצטיל. כמות הנצרכת פוספט אצטיל נקבע על פי ההפרש בין הסכום ההתחלתי של פוספט אצטיל התגובה וכמות פוספט אצטיל שנותר לאחר התגובה האנזימטית. מבחני בוצעו בשלושה עותקים במוטות השגיאה המוצגת.

<ol>
	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds:+the+hexokinase,+ribokinase,+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases.">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li><li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urkinase:+structure+of+acetate+kinase,+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases.">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li><li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+kinase/heat+shock+protein+70/actin+superfamily:+implications+of+conserved+structure+for+mechanism.">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li><li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ATP-binding+fold+in+actin,+hexokinase+and+Hsc70.">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase:+not+just+a+bacterial+enzyme.">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li><li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis.">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li><li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequence+analysis,+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li><li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li><li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction.">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li><li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+phosphorylation+of+acetate.">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li><li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation.">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li><li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants.">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li><li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity:+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate.">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li><li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus.">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הגילוי של פוספט אצטיל ב assay זה תלוי בריכוז מספיק hydrochloride hydroxylamine ואת ריכוז החומציות של התמיסה כלורי וברזל. שינוי של נפח assay ידרוש בדיקה מחודשת של שני רכיבים אלה. תגובות אנזימטיות המתואר כאן בוצעו על 37 מעלות צלזיוס עם סיום hydroxylamine שבוצעה ב 60 ° C במשך 5 דקות. זו טמפרטורה גבו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td width="160"> שם מגיב </td><td width="108"> חברה </td><td width="134"> מספר קטלוגי </td><td width="103"> תגובות </td></tr><tr><td> אצטיל פוספט </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 01409 </td><td> ליתיום מלח (97%) </td></tr><tr><td> סודיום פוספט monobasic (מייבשים) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום פוספט dibasic (anhydrous) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר טריס </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד Ferric (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> Trichloroacetic חומצה </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine hydrochloride </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> אדנוזין 5&#39;-diphosphate מלח נתרן </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> Biomate III ספקטרופוטומטר </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> ספקטרופוטומטר תקן UV / Vis </td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

קינאז Acetate, חבר אצטט ו-kinase Hsp70-אקטין סוכר (ASKHA) אנזים superfamily 1-5, אחראי זירחון הפיך של אצטט כדי פוספט אצטיל ניצול ATP כמו המצע. קינאזות Acetate חיידקים נמצאים בכל מקום, נמצא סוג אחד של קדומים, והם נוכחים גם חיידקים של Eukarya 6. קינאז אצטט ביותר מאופיין גם הוא מן מתאן לייצור archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. קינאז אצטט אשר יכול לנצל רק PP i-ATP, אך לא בכיוון אצטיל פוספט יוצרי כבר מבודד Entamoeba histolytica, הסוכן סיבתי של דיזנטריה אמבית, ויש לו עד כה נמצאו רק 15,16 הסוג הזה. בכיוון של היווצרות אצטיל פוספט, פעילות קינאז אצטט נמדדת בדרך כלל באמצעות assay hydroxamate, שתוארה לראשונה על ידי ליפמן17-20, assay מצמידים שבו ההמרה של ה-ATP ל ADP היא מצמידים את החמצון של NADH ל NAD + ע&quot;י קינאז האנזימים pyruvate ו לקטט דהידרוגנז 21,22, או מדידה assay שחרורו של פוספטים אנאורגניים אחרי התגובה של המוצר פוספט אצטיל עם hydroxylamine 23. פעילות ההיפך, אצטט יוצרי כיוון נמדד על ידי צימוד היווצרות ATP מ - ADP לצמצום NADP + ל NADPH ידי hexokinase האנזימים וגלוקוז 6 פוספט דהידרוגנז 24. כאן אנו מתארים שיטה לגילוי של פעילות קינאז אצטט לכיוון היווצרות אצטט שאינו דורש צימוד אנזימים, אך הוא מבוסס על נחישות במקום ישירה של צריכת פוספט אצטיל. לאחר התגובה האנזימטית, פוספט אצטיל הנותרים מומר קומפלקס hydroxamate וברזל כי ניתן למדוד spectrophotometrically, כמו assay hydroxamate. לכן, בניגוד רחובassay מצמידים אנדאר עבור בכיוון הזה תלויה ייצור ATP מ - ADP, assay הזה ישיר יכול לשמש קינאזות אצטט המייצרים ATP או PP אני.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase at JoVE.com

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

direct-detection-acetate-forming-activity-enzyme-acetate

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K Views.  Clemson University. שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.

Video: Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

GC מבוסס זיהוי של אצטט חומצה Aldononitrile גלוקוזאמין Muramic Derivatized לקביעת שאריות מיקרוביאלית בקרקע

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the foundation to develop novel strategies for pest control. Here, a series of methods are described that are routinely utilized to determine the functional roles of neuropeptides and other neuronal factors (i.e., biogenic amines) on the excretory system of the mosquito, Aedes aegypti. The Malpighian tubules (MTs), responsible for primary urine formation, can continue functioning for hours when removed from the mosquito, allowing for fluid secretion measurements following hormone treatments. As such, the Ramsay assay is a useful technique to measure secretion rates from isolated MTs. Ion-selective microelectrodes (ISME) can sequentially be used to measure ion concentrations (i.e., Na+ and K+) in the secreted fluid. This assay allows for the measurement of several MTs at a given time, determining the effects of various hormones and drugs. The Scanning Ion-selective Electrode Technique uses ISME to measure voltage representative of ionic activity in the unstirred layer adjacent to the surface of ion transporting organs to determine transepithelial transport of ions in near real time. This method can be used to understand the role of hormones and other regulators on ion absorption or secretion across epithelia. Hindgut contraction assays are also a useful tool to characterize myoactive neuropeptides, that may enhance or reduce the ability of this organ to remove excess fluid and waste. Collectively, these methods provide insight into how the excretory system is regulated in adult mosquitoes. This is important because functional coordination of the excretory organs is crucial in overcoming challenges such as desiccation stress after eclosion and before finding a suitable vertebrate host to obtain a bloodmeal.

This protocol outlines methodologies behind the Ramsay assay, ion-selective microelectrodes, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) and in vitro contraction assays, applied to study the adult mosquito excretory system, comprised of the Malpighian tubules and hindgut, to collectively measure ion and fluid secretion rates, contractile activity, and transepithelial ion transport.

חקר הפעילות של נוירופפטידים ורגולטורים אחרים של מערכת ההפרשה יתוש למבוגרים

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video