Este trabalho foi financiado pela NSF prêmio # 0920274 e Carolina do Sul Experiment Station Project (SC-1700340) para KSS. Este artigo é Não. Contribuição Técnica 5929 da Estação Experimental de Clemson University.

O esquema geral deste protocolo é descrito na Figura 1. 1. Preparação solução para Curvas padrão e Ensaios <ol><li> Prepare 100 mL de solução 2 mol / L de hidroxilamina-HCl. Pesar 13,9 g de cloridrato de hidroxilamina (MW 69,49 g / mol) e dissolver em aproximadamente 50 mL de água destilada deionizada-(DDH 2 O). Ajustar o pH para 7,0 utilizando pellets de hidróxido de potássio ou uma solução concentrada. Reduzir o volume final de 100 mL. A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por até 30 dias ou a 4 ° C por até 90 dias. </li><li> Prepare 100 mL de um cloreto férrico / solução de ácido clorídrico. Pesar 13,5 g de cloreto férrico (MW 270,32 g / mol) e dissolver em aproximadamente 50 mL DDH 2 O. Adicionar 41,3 mL de ácido clorídrico concentrado (12,1 mol / L) e trazer para um volume final de 100 mL. A concentração final de cloreto férrico será de 0,5 mol / L ea concentração final de ácido clorídrico será de 5 mol/ L. A solução é armazenado em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 100 mL de uma solução 1,84 mol / L de ácido trichoroacetic. Pesar 30,0 g de ácido tricloroacético (MW 163,39 g / mol), dissolver em DDH 2 O e trazer o volume final de 100 mL. A solução é armazenado em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 5 mL de uma solução de fosfato 0,1 mol / L acetil. Pesar 0,092 g de fosfato de acetila (MW 184,06 g / mol), dissolver em DDH 2 O e trazer o volume final de 5 mL. Alíquota da solução para tubos de microcentrífuga (0,25 mL por tubo) e congelar a -20 ° C até o uso. Solução de descongelado deve ser colocado sobre o gelo e pode ser usado por aproximadamente 1 hora. Solução de fosfato acetil que foram descongelados não devem ser novamente congelados e reutilizados. </li><li> Prepare 5 mL de uma solução 0,1 mol / L de ADP. Pesar 0,24 g de ADP (MW 472,5 g / mol), dissolver em DDH 2 O, e trazer o volume final de 5 mL. Alíquota da solução em tubos de microcentrífuga (0,5 mL por tubo) e congelar a -20 ° C atéuso. Mantenha solução descongeladas em gelo até o uso. </li><li> Prepare 50 mL de uma solução a 1 mol / L de Tris. Pesar 6,06 g Tris (MW 121,14 g / mol), e dissolver em 40 mL DDH 2 O. Ajustar o pH da solução para 7,0 com ácido clorídrico e trazer um volume final de 50 mL. Solução de armazenamento em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 10 mL de uma solução de cloreto de 1 mol / L de magnésio. Pesar 2,03 g de cloreto de magnésio (MW 203,31 g / mol), dissolver em DDH 2 O, e trazer um volume final de 10 mL. Guardar a solução em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 25 mL solução de desenvolvimento através da mistura de volumes iguais da solução de ácido cloreto férrico / clorídrico e solução de ácido tricloroacético. Solução de desenvolvimento deve ser renovada diariamente e armazenados à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparação de uma Curve Acetyl Phosphate Padrão <ol><li> Uma curva padrão acetil fosfato é gerado utilizando quantidades conhecidas de fosfato de acetila. Uma curva padrão de seis para dezoitopontos t é adequado. Os padrões deve variar de 0,03 a 0,9 μmoles μmoles por 300 mL, que correlaciona a concentração final de 0,1 a 3 mmol / L. Diluir a solução estoque acetil fosfato à concentrações adequadas em 100 mM Tris solução em um volume final de 300 mL. A amostra de controlo sem fosfato acetil também deve estar preparado. </li><li> Incubar cada padrão e o controle a 37 ° C em um bloco de aquecimento por 1 minuto. </li><li> Adicionar 50 mL da solução de cloridrato de hidroxilamina a cada padrão e o controle e misture agitando três vezes. Coloque o padrão em um bloco de aquecimento 60 ° C e incubar por cinco minutos. </li><li> Adicionar 100 mL de solução de desenvolvimento para os padrões eo controle, misture agitando três vezes, e permitir que a cor se desenvolva, pelo menos, um minuto à temperatura ambiente. </li><li> Centrífuga todas as normas e o controle em uma microcentrífuga a 18.000 xg por 1 minuto. </li><li> Medições com as amostras espectrofotometricamente umat 540 nm usando 1mL cubetas de plástico, usando o controle como o branco para espectrofotometria. </li><li> Gerar uma curva padrão de análise de dados apropriado e software gráficos (por exemplo, Kaleidagraph Software Synergy). Valores de R 2 de 0,99 ou superior são desejáveis. Os dados são representados como absorbância a 540 nm contra μmoles de fosfato presente acetil. </li></ol> 3. Ensaio para a atividade da quinase Acetato <ol><li> Usando as soluções descritas, prepare uma mistura de reação contendo uma concentração final de 0,1 mol / L Tris buffer, 10 mmol / L de cloreto de magnésio, 5 mmol / L ADP, fosfato e 2 mmol / L acetil. A mistura de reação 10 mL 8,2 mL exigirá DDH 2 O, 1,0 mL de solução Tris, 0,1 mL de solução de cloreto de magnésio, 0,5 mL de solução ADP, e 0,2 mL de solução de fosfato de acetila. Distribua a mistura de reacção em 300 mL alíquotas para tubos de microcentrífuga. Para a determinação de parâmetros cinéticos e otimização das concentrações de substrato, um substrato podem servariada e a outra segurava a uma concentração constante nas reações. </li><li> Pré-incubar a reação por 1 minuto a 37 ° C em um bloco de calor. </li><li> Adicionar uma quantidade desejada de enzima para a reação e devolver imediatamente o tubo para o bloco de aquecimento 37 ° C. Incluir também uma reação de controle para que não enzima é adicionado. Se várias reações são realizadas, adicione enzima para os tubos em intervalos de tempo específicos. Certifique-se de manter o controle de tempo. (NOTA: A quantidade de enzima a ser utilizada terá que ser optimizados para garantir que todos os acetil fosfato ou substrato ADP não estarão esgotados - ver secção Discussão) </li><li> Após 5 minutos, adicionar 50μl da solução de cloridrato de hidroxilamina a cada reação e no controle, misture e coloque os tubos em um bloco de aquecimento 60 ° C. Se diversas reações estão sendo realizadas, isso deve ser feito no mesmo intervalo de tempo como a enzima foi adicionada. </li><li> Incubar as reações e do controle por 5 minutos a 60 ° C. </li><li> Adicionar 100 &amp;mu; L da solução de desenvolvimento para cada reação e do controle, misture e coloque em um suporte de tubos na bancada do laboratório. Permitem que a cor se desenvolva durante pelo menos 1 minuto. </li><li> Centrifugar todos os tubos em uma microcentrífuga a 18.000 xg por 1 minuto. </li><li> Amostras medida espectrofotometricamente em 540 nm usando 1mL cubetas de plástico e determinar a quantidade de fosfato presente acetil em comparação com a curva de acetil fosfato padrão. </li><li> A quantidade de substrato fosfato de acetil esgotados pode ser determinado subtraindo-se a quantidade de fosfato acetil remanescente após a reação enzimática a partir da quantidade de fosfato de acetila presente na enzima controle faltando. Realizar a análise de dados usando dados apropriados e software gráficos (por exemplo, Kaleidagraph Software Synergy). Valores de R 2 superiores a 0,97 são desejáveis. </li></ol> 4. Resultados representativos: O objetivo deste ensaio é medir a atividade quinase de acetato na diretaion de formação de acetato. Isto é feito através da medição de consumo do substrato fosfato de acetil, como não há medição, fácil e direta para a produção de acetato. Fosfato acetil remanescentes após um determinado tempo durante a reação enzimática é convertido em acetil hidroxamato e, posteriormente, para o complexo hidroxamato férrico, que tem uma cor avermelhada (Figura 2) que pode ser medido em 540 nm. A curva padrão traçando absorbância versus μmoles presente acetil fosfato nos padrões é usado para determinar a quantidade de fosfato acetil remanescentes em cada reação. A curva padrão deve ser linear através do ponto zero. A curva representativa padrão mostrado na Figura 3 tem uma inclinação de 1,2332 unidades de absorbância por apresentar fosfato μmole acetil e um valor de R 2 de 0,99, indicando os dados ajusta a equação linear assim. A equação para o ajuste linear para os dados da curva padrão é usado para calcular a quantidade de fosfato de acetil remanescentes na reação. O μmolesde fosfato de acetil consumida é determinada como a diferença entre o μmoles de fosfato de acetila presentes na reação controle sem enzima e do μmoles de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática. Purificada, M. recombinante thermophila acetato quinase foi quantificada usando o protocolo descrito. Para o experimento mostrado na Figura 4, a concentração de ADP foi mantida constante em 5 mmol / L ea concentração de fosfato de acetila na reação foi variado para determinar o K m para o fosfato de acetila. Como esperado, este experimento demonstra que a enzima segue padrão de Michaelis-Menten-like cinética para cada substrato e produziu uma curva de saturação hiperbólica ao plotar atividade versus concentração de fosfato de acetila. A aparente K valor m para o fosfato de acetila foi de 0,27 ± 0,01 mmol / L, o que compara favoravelmente com a publicação de valor K m de 0,47 ± 0,01 mmol / L usando o juntamente comodigo 13. O ensaio direto também pode ser usado para medir a atividade de quinases de acetato que utilizam outros substratos de ATP, o que não é possível usando o ensaio padrão acoplado. Purificada E. recombinante acetato quinase histolytica 16, que produz PP i ao invés de ATP na direção de acetato de formação, foi submetido a este ensaio utilizando fosfato de sódio no lugar de ADP. A concentração de fosfato de sódio na reação foi mantida constante em 0,2 mol / L ea concentração de fosfato de acetil foi variado. Quanto ao M. thermophila acetato quinase, o E. histolytica acetato quinase seguido Michaelis-Menten-like cinética para o fosfato de acetila e uma curva de saturação hiperbólica foi observada (Figura 5). A aparente K valor m para o fosfato de acetila foi de 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves e Guthrie 15 determinou um valor de K m de 0,06 mmol / L de fosfato para a enzima acetil nativas; como<html> nunca, a sua enzima foi parcialmente purificada e suas ensaio envolveu quatro enzimas de acoplamento que também foram apenas parcialmente purificada. Assim, é difícil comparar diretamente esses valores. Protocolo Scheme <ol><li> Gerar uma curva padrão acetil fosfato </li><li> Enzima para diluir a concentração desejada </li><li> Preparar a reação da mistura e alíquota 300 ml para tubos de microcentrífuga </li><li> Reações Pré-incubação a 37 ° C por 1 minuto </li><li> Iniciar reações adicionando enzima em intervalos de tempo específicos </li><li> Adicionar hidroxilamina com os mesmos intervalos para parar as reações e incubar a 60 ° C por 5 minutos </li><li> Adicionar cloreto férrico / solução de ácido tricloroacético para o desenvolvimento de cor </li><li> Centrifugar a 18.000 xg tubos durante 1 minuto </li><li> Medir a absorvância a 540 nm </li><li> Determinar a quantidade de fosfato de acetil consumida por comparação com a curva padrão </li></ol>tp_upload/3474/3474fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Scheme Protocolo <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" /> Figura 2. Acetyl padrões de fosfato. Concentrações crescentes de fosfato de acetila foram reagiu com hidroxilamina e cor foi desenvolvida como descrito. O controle falta de fosfato de acetila é amarelo brilhante, e as reações contendo quantidades crescentes de fosfato de acetil são sucessivamente de cor mais escura. Esta mudança de cor é medida em 540 nm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" /> Figura 3. Sample curva padrão acetil fosfato. Diferentes quantidades de fosfato de acetila foram reagiu com hidroxilamina, e a solução de desenvolvimento de cor e absorbância foi medida em 540 nm. A absorvância a 540 nm contra μmoles fosfato de acetil foi plotada e um ajuste linear aos dados foi aplicado. &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" /> Figura 4. Utilização de fosfato de acetil pela M. ATP de produção thermophila quinase acetato. Atividade enzimática foi determinada na direção da formação de acetato na presença de 5 mmol / L ADP com diferentes concentrações de fosfato de acetila. A quantidade de fosfato consumido acetil foi determinada como a diferença entre o montante inicial de fosfato de acetila na reação e da quantidade de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática. Os ensaios foram realizados em triplicata com barras de erro mostrada. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" /> Figura 5. Utilização de fosfato de acetil pelo PP i-produzindo E. histolytica quinase acetato. Atividade enzimática na direção da formação de acetato foi determinada na presença de 0.Fosfato de sódio 2 mol / L com diferentes concentrações de fosfato de acetila. A quantidade de fosfato consumido acetil foi determinada como a diferença entre o montante inicial de fosfato de acetila na reação e da quantidade de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática. Os ensaios foram realizados em triplicata com barras de erro mostrada.

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	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds:+the+hexokinase,+ribokinase,+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases.">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li><li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urkinase:+structure+of+acetate+kinase,+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases.">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li><li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+kinase/heat+shock+protein+70/actin+superfamily:+implications+of+conserved+structure+for+mechanism.">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li><li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ATP-binding+fold+in+actin,+hexokinase+and+Hsc70.">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequence+analysis,+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li><li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li><li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction.">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li><li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+phosphorylation+of+acetate.">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li><li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation.">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li><li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants.">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li><li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity:+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate.">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li><li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus.">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A detecção de fosfato de acetil neste ensaio é dependente de uma concentração suficiente de cloridrato de hidroxilamina, e da concentração e da acidez da solução de cloreto férrico. Alteração do volume de ensaio requer a reconsideração de ambos os componentes. As reações enzimáticas descritas aqui foram realizados a 37 ° C com o término hidroxilamina realizada a 60 ° C por 5 minutos. Esta temperatura mais elevada é fundamental para permitir a rápida conversão do fosfato restantes acetil para hidro...

<table border="1"><tr><td width="160"> Nome do reagente </td><td width="108"> Companhia </td><td width="134"> Número de catálogo </td><td width="103"> Comentários </td></tr><tr><td> Fosfato de acetila </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 01409 </td><td> Sal de lítio (97%) </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico (desidratar) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico (anidro) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio (hexa) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base de Dados </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto férrico (hexa) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido tricloroacético </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de hidroxilamina </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosina 5&#39;-difosfato sal de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> BIOMATE III Espectrofotômetro </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> Espectrofotômetro UV / Vis padrão </td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

Quinase acetato, um membro do acetato e-quinase Hsp70-actina açúcar superfamília de enzimas (ASKHA) 1-5, é responsável pela fosforilação reversível de acetato de acetil fosfato ATP, utilizando como substrato. Acetato de quinases são onipresentes na bactéria, encontrada em um gênero de Archaea, e também estão presentes em micróbios da Eukarya 6. O acetato quinase mais bem caracterizado é que a partir do metano produzindo archaeon Methanosarcina thermophila 14/07. Uma quinase de acetato, que só pode utilizar PP i ATP, mas não na direção do acetil-fosfato formando foi isolado de Entamoeba histolytica, o agente causador da disenteria amebiana, e até agora só foi encontrado nesta 15,16 gênero. Na direção da formação de fosfato de acetil, acetato de atividade da quinase é normalmente medido utilizando o ensaio de hidroxamato, primeiramente descrita por Lipmann17-20, um ensaio acoplado em que a conversão de ATP a ADP é acoplada a oxidação de NADH para NAD + pela enzimas piruvato quinase e lactato desidrogenase 21,22, ou um ensaio de medição de liberação de fosfato inorgânico após a reação do produto acetil fosfato com hidroxilamina 23. Atividade no lado oposto, o acetato de formação de sentido é medida pelo acoplamento formação de ATP a partir de ADP para a redução do NADP + a NADPH pela hexoquinase enzimas e glicose 6-fosfato desidrogenase 24. Aqui nós descrevemos um método para a detecção de atividade de acetato quinase na direção da formação de acetato de que não necessita de enzimas de acoplamento, mas em vez disso é baseada na determinação direta do consumo de fosfato de acetila. Após a reação enzimática, permanecendo acetil fosfato é convertido em um complexo hidroxamato férrico que pode ser medido espectrofotometricamente, como para o ensaio hidroxamato. Assim, ao contrário do stensaio acoplado andard para esta direcção, que é dependente da produção de ATP a partir de ADP, este ensaio direto podem ser utilizados para quinases acetato que produzem ATP ou PP i.

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Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Um método para a determinação da atividade da quinase de acetato é descrito. Este ensaio utiliza uma reação direta para determinar a atividade enzimática e cinética de acetato quinase na direção de formação de acetato com diferentes aceptores fosforil. Além disso, este método pode ser utilizado para a dosagem de fosfato de acetila ou outras enzimas acetil-CoA utilizando.

Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

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23.0K visualizações.  Clemson University. Um método para a determinação da atividade da quinase de acetato é descrito. Este ensaio utiliza uma reação direta para determinar a atividade enzimática e cinética de acetato quinase na direção de formação de acetato com diferentes aceptores fosforil. Além disso, este método pode ser utilizado para a dosagem de fosfato de acetila ou outras enzimas acetil-CoA utilizando.