אנו מודים UAMS Proteomics מתקן לתמיכה ספקטרומטריה. המימון לפרויקט זה סופק על ידי NIH מענקים P20RR015569, P20RR016460 ו R01DA025755.

פרוטוקול זה הוא שונה מן בלייר ואחרים. 6. 1. LSD1 demethylation Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרך האחרון של μL 20, לשלב 125 LSD1 רקומביננטי ng עם 0.25 di-methyl מיקרוגרם היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין) במאגר demethylase (50 מ&quot;מ טריס-Cl-pH 8.5, 50 מ&quot;מ KCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 5% גליצרול). בנוסף, לבצע בקרת לבד הפפטיד עם האנזים לא. השליטה היא על סעיף 3 ואין צורך מתילציה רדוקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף את הפפטידים, להוסיף 8 פורוס μL 20 R2 חרוזים מיקרון למדגם כל להתסיס במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להכין חרוזים פורוס על ידי השעיית 1 נפח של חרוזים עם נפח של 1 מתנול, ולאחר מכן להוסיף 10 כרכים של חומצה פורמית 5% / 0.2% TFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצב 2 ג 18 ZipTips ידי aspirating 20 μL של TFA 0.1% אל קצה ודוחף אותו חזרה עם pipettor. לעשות את זה פעמיים עם T 0.1%FA, ארבע פעמים עם אצטוניטריל 70% / TFA 0.1% ו ארבע פעמים שוב עם TFA 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען שתי דוגמאות (מלאה התגובה demethylase) על ה-C 18 ZipTips מותנה pipetting slurry חרוז מאחורי שרף C 18 ב ZipTips ודוחף את עוצמת הקול דרך עם pipettor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ZipTips פעמיים עם 20 μL של TFA 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute ב μL 40 אצטוניטריל של 70% / 0.1% TFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize כל eluant לחלוטין עם concentrator SpeedVac. </li></ol> 2. רדוקטיבי מתילציה חלק זה של הפרוטוקול הוא שונה מן בלייר et al. ו Rayment et al. 6,7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב להשעות את התגובה demethylase ב μL 100 של המאגר 50 מ&quot;מ פוספט, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתגובה demethylase, להוסיף 8 μL של 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​borane dimethylamine. Borane dimethylamine הוא מומס חיץ 50 מ&quot;מ פוספט, pH 7.4, לתת 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון המניות.זה צריך להיות טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתגובה demethylase, להוסיף 16 μL של פורמלדהיד 250 מ&quot;מ deuterated. פורמלדהיד deuterated 250 mm הוא הוכן על ידי דילול מניות של H 2 0. זה צריך להיות טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2, 2.3 &amp; 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות ~~~HEAD=NNS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם demethylase, להוסיף 12.5 μL של 1M טריס, pH 7.4 כדי להרוות את התגובה מתילציה רדוקטיבי. </li></ol> 3. MALDI המוניים ספקטרומטריית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פורוס R2 20 חרוזים מיקרון לתגובה demethylase, ולאסוף על ZipTips כמתואר צעדים 1.3-1.6. </li></ol> הערה: Re-להשעות את השליטה μL 100 מתוך חוצץ 50 מ&quot;מ פוספט, pH 7.4 ולטפל כמו המדגם השני החל שלב 3.1. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute מלאה דוגמאות התגובה demethylase מ ZipTips את לצלחת מדגם MALDI באמצעות 2 μL של 33% להרוות2,5-D dihydroxybenzoic חומצה. להכין 33% חומצה 2,5-dihydroxybenzoic, להפוך את פתרון רווי של חומצה 2,5-dihydroxybenzoic ב אצטוניטריל 70% / 0.1% TFA ואז לדלל 33% רווי אצטוניטריל 70% / 0.1% TFA. אפשר דגימות eluted לייבוש להתגבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-prOTOF PerkinElmerSciex המונית או זמינים ברזולוציה גבוהה MALDI ספקטרומטר מסה 8,9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את ספקטרום ולחלץ האזורים השיא PerkinElmerSciex באמצעות תוכנת TOFworks או תוכנה המסופקים על ידי היצרן ספקטרומטר מסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת את תוצרי התגובה של 2 MS עם מערכת המונית זמין spectrometric מתן יכולות טנדם המוניים spectrometric. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לפצות על חפיפה איזוטופים שנוצרו באמצעות פורמלדהיד כבד (איור 1 ב), לקבוע את אזור השיא (א) יחס של 13 C 2 ו - 13 C 4 איזוטופים relativדואר לשיא monoisotopic למדגם שליטה, שלא עבר מתילציה רדוקטיבי (איור 2 א). EQ 1: 13C2 / 12C = R 1 EQ 2: 13C4 / 12C = R 2 זה ייתן לך את היחס של פפטיד הקיים במדינות אלו איזוטופי (R &amp; R 1 2) ספציפית להתנסות שלך ספקטרומטר מסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש R &amp; R 1 2 ערכים הנוסחאות הבאות לכימות הסכום היחסי של הפפטיד הקיימים במצב כל שינוי במדגם התגובה demethylase (איור 2 ב): EQ 3: H3K4me2 = 1 EQ 4: H3K4me = 2 - R 1 (1) EQ 5: H3K4 = 3 - R 2 (1) - [R 1 (2 - R 1 (1))] </li></ol> 5. נציג תוצאות שימוש LSD1, אנו מראים את היעילות של MassSQUIRM לכימותליזין demethylation. כפי שתואר בסעיף טקסט פרוטוקול, ביצענו assay demethylase עם ng 125 של LSD1 ו 0.25 di-methyl מיקרוגרם היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין). שליטה ודוגמאות התגובה demethylase היו נתונים מתילציה רדוקטיבי ו ספקטרומטריית MALDI המונית. תגובת פקד לא עבר מתילציה רדוקטיבי הראה את המעטפה איזוטופי אופייני פפטיד זה ובתנאי אזורים השיא של משוואות 1 ו -2 (איור 2 א). הספקטרום המונית לתגובה demethylase בתנאי באזורים שיא עבור משוואות 3-5 (איור 2 ב). שימוש באזורים שיא השליטה והתגובה demethylase, קבענו כי LSD1 demethylated פפטיד לתת את תוצרי התגובה הבאים: 33.7% di-methyl Lys4, 42.3% מונו מתיל Lys4, ו -24% בלתי מפוגל ליס 4. עיין בלייר ואחרים. ניתוח מלא של הפעילות LSD1 demethylase כמו גם מחקרים מעכב 6. שים לב משתנים משתנים כגון אנזימים, זמן תגובהריכוז ריכוז המצע תאפשר ניתוח מעמיק של פעילות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה MassSQUIRM. (א) פפטיד N-מסוף מ היסטון H3 מוצג בתור בלתי (ירוק), מונו (אדום), או di-(כחול) מפוגל על ​​ליזין 4. וריאציה בהרכב הכימי של הפפטיד כל מוביל יינון ההפרש ביצוע מורכבת כימות. (ב) מתילציה Reductive ממיר את כל שאריות ליזין למצב di-methyl הגורמת פפטידים כדי ליינן את כל דומה. השימוש פורמלדהיד כבד בתגובה מתילציה רדוקטיבי מאפשר שימור הזהות של מתילציה המקורי. חוגים פתוחים מצביעים מתילציה אור בעוד בחוגים סגורים עולה מתילציה כבדה. השתנה מן בלייר et al. 2011 6. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> Figur2 ה. MassSQUIRM ניתן לכמת פפטידים מפוגל דיפרנציאלי. (א) DI-מפוגל סינתטי היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין) נותח באמצעות ספקטרומטר מסה יחסי שיא ביחס לשיא monoisotopic היו כאמור R 1 ו R 2 במשוואות 1 ו -2. (ב) פפטיד סינטטי באותו הודגר עם 125 LSD1 נג ב חיץ demethylase עבור שעתיים על 37 ° C. דוגמאות היו נתונים אז MassSQUIRM ניתוח. אוכלוסייה מעורבת של פסגות חופפים מייצג שלושה מצבי מתילציה שונים כפי שניתן לראות באיור 1 ב. באזורים שתחת פסגות monoisotopic היו כאמור 1, 2, ו 3. אזורי שיא שימשו משוואות 3-5. חוגים פתוחים מצביעים מתילציה אור בעוד בחוגים סגורים עולה מתילציה כבדה. השתנה מן בלייר ואחרים. 2011 6.

<ol>
	<li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+a+landscape+takes+shape.">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+(KDM5)+Enzymes+in+Cancer.">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li><li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes.">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li><li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassSQUIRM:+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity.">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li><li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1:+a+molecular+motor.">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li><li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling.">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li><li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression.">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li><li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs.">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

MassSQUIRM היא שיטה זולה כמותית לניתוח מקיף של פעילותו של demethylases ליזין המעורבים מונו ו מתילציה-di. MassSQUIRM מציע quantitation לא רק של המוצר התגובה אלא גם את התשומות. Assay זה יכול לשמש ככלי רב עוצמה בחקר מנגנון demethylases היסטון LSD1 אחרים. זה יהיה גם שימושי לסיווג אנזימים רבים שהתגלו לאחרו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-ביוטין פפטיד </td><td> מוכן בתוך הבית </td><td> אף אחד </td></tr><tr><td> פורוס R2 20 חרוזים מיקרון </td><td> יישומי Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic חומצה (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> אצטוניטריל </td><td> דיג </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihydroxybenzoic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borane dimethylamine </td><td> סיגמא </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> כבד isotopically ד 2-פורמלדהיד </td><td> קיימברידג&#39; איזוטופ מעבדות </tד&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> טריס </td><td> דיג </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> דיג </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> דיג </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> G33 </td></tr><tr><td> חומצה פורמית </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> דיג </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-phosphate </td><td> דיג </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac מרוכז </td><td> מלומד </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF ספקטרומטר מסה ו TOFworks תוכנה </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> אף אחד </td></tr></tbody></table>

application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity

לאחרונה, הרגולטורים אפיגנטים המשנים התגלו כשחקנים מרכזיים מחלות רבות ושונות 1-3. כתוצאה מכך, אנזימים אלה הם מטרות הממשלה ללימודי מולקולה קטנה ועל פיתוח 4 תרופות. הרגולטורים אפיגנטים המשנים רבים יש רק לאחרונה התגלה, והם עדיין בתהליך של להיות מסווג. בין אנזימים אלה הם demethylases ליזין אשר הסרת קבוצות מתיל מ lysines על ההיסטונים וחלבונים אחרים. בשל אופיו של הרומן המעמד הזה של אנזימים, מבחני כמה פותחו כדי ללמוד על פעילותם. זה היה מחסום הסיווג והן במחקר קצב העברת נתונים גבוה של demethylases היסטון. נכון לעכשיו, מבחני demethylase מעט מאוד קיים. אלה אכן קיימים נוטים להיות איכותית בטבע ולא ניתן להבחין בו זמנית בין מדינות שונות מתילציה ליזין (האו&quot;ם, מונו, די ו-Tri-). ספקטרומטריית מסה משמש בדרך כלל כדי לקבוע פעילות demethylase אבל הנוכחי מבחני ספקטרומטריה לעשותלא לענות אם פפטידים מפוגל דיפרנציאלי ליינן אחרת. יינון ההפרש של פפטידים מפוגל עושה השוואה בין מדינות מתילציה קשה ובוודאי לא כמותית (איור 1 א). לכן מבחני כניסה אינן מותאמות ניתוח מקיף של פעילות demethylase. כאן אנו מתארים שיטה הנקראת MassSQUIRM (quantitation ספקטרומטריה באמצעות מתילציה רדוקטיבי איזוטופי) המבוסס על מתילציה רדוקטיבי של קבוצות האמין עם פורמלדהיד deuterated לכפות lysines כל להיות DI-מפוגל, ולכן מה שהופך אותם למעשה המין כימי ולכן ליינן אותו (1B איור). ההבדל הכימי רק לאחר מתילציה רדוקטיבי הוא מימן דאוטריום, אשר אינו משפיע על יעילות MALDI יינון. Assay MassSQUIRM הוא ספציפי עבור תוצרי התגובה demethylase עם lysines האו&quot;ם, מונו או di-מפוגל. Assay גם לגבי methyltransferases ליזין נותן SAלי תוצרי התגובה. כאן, אנו משתמשים בשילוב של כימיה מתילציה רדוקטיבי ו ספקטרומטריית MALDI המונית כדי למדוד את הפעילות של LSD1, demethylase ליזין מסוגלת להסיר DI-וחד-methyl קבוצות, על מצע פפטיד סינתטי 5. Assay זה פשוט נוח בקלות למעבדה כל גישה ספקטרומטר מסה MALDI במעבדה או באמצעות מתקן proteomics. Assay יש ~ 8 פי טווח דינמי והוא ניתן להרחבה בקלות לעצב צלחת 5.

Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

application-masssquirm-for-quantitative-measurements-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  University of Arkansas for Medical Sciences. אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.

Video: Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the requirement of microfluidics to form controlled droplets imposes a barrier to non-experts, limiting their use. Here, we describe particle templated emulsification, an approach to generate monodisperse droplets without microfluidics. Using templating hydrogel spheres, we encapsulate samples in monodispersed droplets by simple vortexing. We demonstrate the approach by using it to perform microfluidic-free digital PCR.

Water-in-oil droplet assays are useful for analytical chemistry, enzyme evolution, and single cell analysis, but typically require microfluidics to form the droplets. Here, we describe particle templated emulsification, a microfluidic-free approach to perform droplet assays.