מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל

הערכת מעורבות היעד, כלומר, האינטראקציה של תרופה עם החלבון שהיא תוכננה עבורו, היא דרישה בסיסית לפרשנות של הפעילות הביולוגית של כל תרכובת בפיתוח תרופות, או בפרויקטים מחקריים בסיסיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה ישירה של אפקט המינון והדינמיקה של מעורבות יעד KDM1A, ולא מדידות של אפקטים במורד הזרם כגון סימני אבן וביטוי. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת במחקר בסיסי וגם בניסויים קליניים, ב מערכת העצבים המרכזית אונקולוגית או מחלות אחרות הכפופות לטיפול במעכב KDM1A לחקר פרמקודינמיקה.

טכניקה זו מבוססת על כימותרפיה שפותחה כדי ללמוד ORY-1001, iadademstat, אבל יכול לשמש באמת עבור מעכבי KDM1A אחרים ואת האסטרטגיה ניתן ליישם על מטרות אחרות. ההליך יוכח על ידי רקל רואיז, מנהלת תפעול של פלטפורמת גילוי PK /PD מהמעבדה שלי. במהלך טיפול בתא עם ORY-1001 המתחם נקשר לחלבון KDM1A נוכח בגרעין.

כדי להתחיל בהליך זה, לאחזר 10 microliter לשימוש יחיד aliquot של 20 מילימולאר biotinylated בדיקה OG-881 פתרון מלאי מהמקרר ולתת לו להתחמם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. באמצעות micropipet עם טיפים מסנן, באופן סדרתי לדלל את פתרון המלאי כדי להכין את פתרון העבודה שני micromolar. לאחר מכן, ממיסים טבליה אחת של מעכב פרוטאז במיליליטר אחד של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה.

עבור כל מיליליטר של הנפח הרצוי של חיץ תות תא 1x עם הכימותרפיה, לערבב 100 microliters של חיץ תמוגה תאים 10x השיג, 150 microliters של מעכב פרוטאז 10x, 12.5 microliters של שתי פתרון עבודה OG-881 micromolar ו 737.5 microliters של מים מזוקקים כפולים מסוג 1. תאים lysed במאגר תזה 1x בנוכחות הכימותרפיה שנקשרת לכל חלבון KDM1A חינם. כדי להתכונן מרקמות, השתמש מרגמה ועלי כי הם מצוננים על קרח יבש כדי לרסק הומוגניזציה חתיכה אחת סנטימטר מעוקב של רקמה קפואה.

Aliquot את הרקמה לתוך בקבוקונים חד פעמיים, הקפד להעביר כ 40 מיליגרם של אבקת רקמות לתוך כל בקבוקון, תוך הימנעות הפשרה בכל עת. לאחסן את הדגימות ב 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לעיבוד. כדי להתכונן כדורי תא, להשתמש מחדש את גלולה של כ 10 מיליון תאים ב 200 microliters של מאגר תמוגה תא 1x המכיל 25 ננומולרי OG-881.

מערבולת כל מדגם בקצרה ולשמור אותם על קרח במשך חמש דקות. באמצעות sonicator, sonicate הדגימות עם שלושה פולסים ב 45 קילוהרץ נמשך 20 שניות כל אחד. מניחים את הדגימות על קרח במשך 20 שניות בין פולסים.

שמור את הדגימות על הקרח לחמש דקות נוספות. לאחר מכן, מערבולת לזמן קצר צנטריפוגה הדגימות ב 14, 000 פעמים G במשך 10 דקות בצנטריפוגה כי הוא מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרופיפט מיליליטר אחד להעביר כל על-טבעי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר נפרד.

השאירו את הצינורות על הקרח במשך שעתיים לפני העיבוד. לאחר מכן, לכמת את החלבון המקומי באמצעות ההסטה ברדפורד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צלחת כוללת מצופה בנוגדן נגד KDM1A.

צלחת חינם מצופה סטרפטבידין. לאחר מכן, לייסט התא נוסף הן לצלחות והן למתחם KDM1A נלכד ישירות או דרך הכימותרפיה. צלחות נשטפות ומוגררות בנוגדן לגילוי נגד KDM1A ונוגדן משני יחד עם פרוקסידזה חזרת.

לבסוף, מצע זוהר מתווסף ואות שנוצר. עבור סך הכל KDM1A ELISA, להכין 10 מיליליטר של KDM1A ללכוד נוגדן PBS לריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר עבור כל צלחת. מעבירים 100 מיקרוליטרים לכל באר של הצלחת.

לקבלת KDM1A ELISA בחינם, הכינו 10 מיליליטר סטרפטבידין ב-PBS כריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר לכל צלחת. מעבירים 100 מיקרוליטרים לכל באר של הצלחת. לאחר מכן, אוטם עליון כל צלחת עם סרט דבק ודגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, להסיר את הצלחות מהמקרר ולתת להם לצייד בטמפרטורת החדר במשך כ 45 דקות. לשטוף כל צלחת שלוש פעמים עם חיץ לשטוף, הקפד להקיש על הצלחת על מגבות נייר לאחר כל שלב כביסה כדי להסיר כל פתרון שיורית. הוסף 200 microliters של חיץ חסימה לכל באר של שתי הצלחות.

למעלה לאטום את הצלחות עם סרט דבק דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. בינתיים, לדלל את תמציות חלבון מקורי שהושגו בעבר עם PBS לריכוז המתאים לפרוס את הצלחת כדי להכין עקומה סטנדרטית באמצעות rKDM1A אנושי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר השלמת הדגירה בת השעתיים, השליכו את חיץ החסימה ושטפו את הצלחות עם חיץ שטיפה, ודאגו להקיש על הצלחת על מגבות נייר לאחר כל שלב כביסה כדי להסיר כל פתרון שיורית.

העבר את הדגימות המדולללות המתאימות לבלוק אחסון באר עמוק 96 בקירור בעקבות התפלגות הלוח שנמצאה בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט. שמור בלוק זה על קרח תוך צינורות 100 microliters לתוך לוחות ELISA הכוללת וחופשית בעקבות התפלגות הלוח נמצא בטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, ואז להשליך את הדגימות ולשטוף את הצלחות חמש פעמים עם חיץ לשטוף.

הכן 20 מיליליטר של נוגדן גילוי ארנב נגד KDM1A בחסימת חיץ בריכוז של 0.125 מיקרוגרם למיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון נוגדן הגילוי לכל באר של שתי הצלחות, למעט אלה המתאימים לפקדים השליליים. למעלה לאטום את הצלחות עם סרט דבק דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.

לאחר מכן, להשליך את פתרון נוגדן זיהוי ולשטוף את הצלחות שש פעמים עם חיץ לשטוף. הכן 25 מיליליטר של נוגדן נגד ארנב עיזים משני, HRP, לדילול של אחד עד 5,000 במאגר חסימה. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של ת פתרון הנוגדנים המשני לכל באר של צלחות המיקרוטיטר ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה.

30 דקות לפני סוף הדגירה, מערבבים חלקים שווים של משפר לומינול ופתרון חמצן בבקבוק ענבר בתנאי אור רך. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר. כאשר הדגירה של שעה אחת הושלמה, להשליך את פתרון הנוגדנים המשני ולשטוף את הצלחות שש פעמים עם חיץ לשטוף.

לאחר מכן, pipet 100 microliters של פתרון העבודה luminol לכל באר של הצלחות, הקפדה על צינור לאט מאוד, כדי למנוע היווצרות בועה. השתמש טיימר כדי לשלוט על הזמן בין תוספת של הפתרון ואת מדידת luminescence של הצלחות ולשמור על הזמן הזה קבוע כדי להשיג טוב בין assay לשכפל. למעלה לאטום את הצלחות עם סרט דבק צנטריפוגה ב 500 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך 45 שניות כדי לחסל את כל הבועות הנותרות.

הדגירה את הצלחות על שייקר צלחת ב 100 סל"ד במשך דקה אחת. לאחר מכן, להסיר את הסרט דבק ולהכניס את הצלחת לתוך קורא מיקרופלסטיק ולהשאיר אותו במשך שלוש דקות כדי לייצב את הטמפרטורה ב 25 מעלות צלזיוס. קרא את יחידות האלוהות היחסיות של כל מראית צלחת ELISA.

שמור והעתק את ערכי RLU הגולמיים מקבצי הגיליון האלקטרוני הגולמיים של הנתונים לצורך ניתוח נוסף. במחקר זה, רומן KDM1A לכידת כימותרפיה מבוסס ELISA משמש למדידה ישירה KDM1A מעורבות היעד בתאים ודגימות רקמה. ערכי RLU של rKDM1A הכולל והחינם מוערכים כדי לאמת את ליניאריות.

ערכי ה- RLU של KDM1A הכולל והחינם שזוהו במחשבים אישיים אנושיים משלושה מתנדבים עצמאיים מודבקים על העקומה הסטנדרטית. תאי AML מתורבתים בהתאם להמלצות הספק ומטופלים ברכב או ORY-1001 בריכוזים שונים. תמצית החלבון המקורית מתקבלת בנוכחות 25 מילימולרים OG-881 כימופרוב ו 0.5 מיקרוגרם של חלבון הכולל משמש לביצוע הניתוח של מעורבות היעד.

סה"כ וחינם KDM1A נקבעים לאחר מכן ואת האחוזים של מעורבות היעד של ORY-1001 כדי KDM1A מחושב יחסית לרכב. מעורבות היעד KDM1A מגיב מינון ב PBMCs ובטיפול ריאות של חולדות עם ORY-1001 על ידי gavage אוראלי, מחושב יחסית קבוצת הרכב מוצג כאן. הדגירה לשעבר vivo עם 25 ננומולרים ORY-1001 של תמציות חלבון ריאות מן בעלי החיים שטופלו ברכב, מניבה TE מלא, עדיין, אבל לא להגדיל עוד יותר את TE בדגימות של חולדות שטופלו במשך ארבעה ימים עם 30 מיקרוגרם לקילוגרם ORY-1001, המאשר KDM1A כבר היה מעוכב באופן מלא vivo.

פרוטוקול זה מעריך מעורבות יעד KDM1A על ידי מדידת KDM1A חופשי וסה"כ. זכור שזה דורש מיצוי חלבון מקומי. טכניקה זו יכולה לשמש על דגימות ממינים שונים כדי להעריך מעכב מסוים, גם כדי לסנן מעכבים חדשים.

הכימותרפיה המשמשת במחקר זה יכולה להיות מיושמת גם עבור כימופרוטומיקה כדי ללמוד את האינטראקציה KDM1A. זכור לעבוד בבטחה ולכבד בכל עת אמצעי מניעה בעת טיפול דגימות ביולוגיות ותרכובות ביו-אקטיביות כמו מעכב KDM1A.