עבודה זו מומנה על ידי BBSRC וקרן Wellcome. ברצוננו להודות לסיימון ווקר לקבלת סיוע עם הדמיה ופליקס קרוגר לעזרה עם ניתוח bioinformatic.

<ol>
	<li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+transcription:+shaping+the+landscape+of+the+genome.">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+3C+technologies:+insights+into+nuclear+organization.">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2000).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li><li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li><li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+(3D-FISH.">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li><li>Solovei, I., Beatty, B., Mai, S., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+on+three-dimensionally+preserved+nuclei.">FISH on three-dimensionally preserved nuclei.</a> FISH: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status.">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983 (2012).</li><li>Solovei, I., Cremer, M., Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+Cultured+Cells+Combined+with+Immunostaining.">3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining.</a> Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications. , (2010).</li></ol>

ההפקה של מאמר זה באופן חלקי בחסות Zeiss וMetaSystems קארל.

דגי ה-DNA 3D הפך לכלי להכרה רחבה לנתח סידורים מרחביים בגרעין. בעוד דגים מספק תוצאות חזותיות וישירה, כמו בכל טכניקה, צריך להיות מודעים למגבלותיו. דגי ה-DNA בפני הבעיה המהותית שטיפולים קשים יחסית יש צורך להפוך את הכרומטין נגיש לבדיקות דגים שסופו של דבר משבשים את מבנה הדבר מאוד הגרעיני שהוא להיות מנותחים. כמה אסטרטגיות כבר רדף ללהטט נגישות ושימור מבנה. בפרוטוקול המתואר כאן, ה-DNA הכרומוזומלי נעשתה נגיש על ידי permeabilization הקפאת הפשרה של תאים וDenaturation חום לפני ההכלאה חללית. Solovei, et al., (2002) ניתחו שינויים מבניים לאחר טיפול דומה ומצא כי התזוזה הממוצעת של תחומים הכרומטין הייתה 300 ננומטר אשר מגביל את הרזולוציה של ניתוח מבני לאזורים בערך 1 MB בגנום 8. אמנם זה לא ברזולוציה גבוהה, זההוא בקנה מידה סבירה לניתוח עמדה גרעינית. שיקול מעשי יותר לניתוח דג הוא שרכישת תמונה ומדידות של מרחקים גרעיניים הן תהליכי זמן רב המגבילים את מספר הגרעינים שניתן לנתח. על מנת ללמוד אירועים נדירים שמטרתם לעשות הדמיה אוטומטית קצב העברת נתונים גבוהה. ואז, עם בקרות מתאימות במקום, ניתן להשוות בכמות מספקת כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי חזק של יחסים מרחביים. אנו שגרתי לנתח 600 גרעינים לכל נקודת נתונים שעבורו אנו קובעים את קואורדינטות 3D של כל אותות הדגים בתוך הנפח הגרעיני. נתונים אלה דורשים שטח אחסון קטן מאוד ומאפשרים ניתוח של מרחקים בין משפחות ותוך allelic, או עמדות רדיאליים בכל שלב מאוחר יותר. יתר על כן, אפשר לעשות עיבוד אוטומטי באופן עיוור חוקר אשר מקטין באופן משמעותי את הסבירות להטיה לא מודעת. כדי לאפשר לanalys תפוקה גבוהה מסוג זההוא, המטרה שלנו הייתה להקים בדרך מהירה ויעילה של ביצוע דגי ה-DNA. מצאנו הפרוטוקול מתואר כאן להיות מאוד חזק, באופן עקבי לייצר אותות בהירים עם רקע נמוך. זה עבד לכל סוגי התאים שניסינו סיפק לנו להתאים את הצעד של הצמדת התאים לשקופית. יתר על כן, עם חריג אחד, כולנו משמשים Bács יכול להפוך לבדיקות בהירות. יש לנו גם זוהו בהצלחה מספר החלבונים גרעיניים על ידי מכתים נוגדן לאחר דגי ה-DNA. בעוד עבור חלבונים מסוימים זה עובד טוב, אנו ממליצים השוואה עם immunofluorescence המסורתי (IF) על מנת להבטיח עקביות של דפוס מכתים הנוגדן בין אם ודגים חיסוני דנ&quot;א (השווה 11). באופן כללי, מצאנו כי בדיקות שכותרת בצבעים שונים הפיקו את אותן תוצאות. עם זאת, יש לשקול את ההיבטים הבאים בעת בחירת צבע הסימון. ראשית, הצבע של fluorophore צריך להיות גם לזיהוי על ידי u מיקרוסקופSED. שנית, אורך הגל של האור הנפלט על ידי fluorophores צריך להיות שונה במידה מספקת, כדי למנוע דימום דרך לערוץ האחר. זה יהיה תלוי במסננים במיקרוסקופ. והשלישי, לפחות בידיים שלנו, כמה צבעים לייצר אותות בהירים יותר באופן עקבי יותר מאחרים. יש לנו תמיד משמשים DAPI (כחול) כcounterstain שהופך אלקסה פלואוריד 555 (אדום), 488 (ירוק), ו647 (הרבה אדום) בחירות טובות עבור תיוג בדיקות. עם מערכת ההדמיה שלנו, מצא אלקסה פלואוריד 555 (אדום) כדי לייצר את האותות הבהירים ביותר, ואחריו Alexa פלואוריד 488 (ירוק). יש Alexa פלואוריד 647 (הרבה אדום) חסרון שלא ניתן לאתר אותו על ידי העין האנושית ולכן לא ניתן לראות אותות כשמסתכלים למטה למיקרוסקופ. לכן, אם עושים דגים בשני צבעים, אנו ממליצים על שילוב של צבעים אדומים וירוקים. שתי בעיות עיקריות שעשויות להתעורר: תאים לשטוף מעליו את השקופיות ואותות חלשים. כיצד תאים גם לדבוק בשקופית היא betw עצומה משתנהסוגי een סלולריים, ואת הפרוטוקול הטוב ביותר ליישב / תאי זרע צריך להיות נחושים. אנחנו השתמשנו בהצלחה גם מטען חשמלי חיובי או שקופיות מצופות פולי-L-ליזין (קנה מוכן לשימוש), אבל מצא תאים בדרך כלל דבקו טובים יותר לשקופיות מצופות פולי-L-ליזין. מצאו גם כי כאשר תאים היו אזורים שלמים צפופים מדי הייתם להתקלף כמו סדין, ואילו הדמיה אוטומטית הכבידה אם התאים היו דלילים מדי. לכן, אם המדגם הוא לא יקר מדי, יש זורעים מספרי תאים שונים כדי לקבוע את הצפיפות האידיאלית. אם תאים נוטים לשטוף במיוחד, ניתן להשתמש בעט מחסום הידרופובי, וניתן לבצע את הפעולות דגים על ידי pipetting בזהירות פתרונות ישירות על גבי שקופית. גם מפחית באופן דרסטי Pipetting הכרכים של חומרים כימיים הנחוצים, אבל לוקח זמן רב יותר במידה ניכרת כאשר עושה מספר שקופיות. אותות חלשים הם בדרך כלל עקב בדיקות עניות, וזה בהחלט שווה להשקיע את הזמן לעשייה טוב. הנקי BAC-DNA יש להשתמשד כחומר מוצא אשר ניתן להשיג על ידי משקעים חוזרים ונשנים או ערכות זמינות מסחרי. זיהום חיידקים עם הדנ&quot;א הגנומי משפיע לרעה על איכות בדיקה וטיפול זהיר במהלך תמוגה תא וסינון של lysate התא נדרש כדי לשמור אותו למינימום. , היא, לעומת זאת אין צורך להשתמש בצעד exonuclease לעיכול ה-DNA ליניארי, כמו זה מפחית תשואה במידה רבה. תיוג יעיל של הבדיקה הוא קריטי. בקרת האיכות החשובה ביותר של שלב זה היא לבדוק את גודל השבר לאחר תרגום ניק (ראה נציג תוצאות). למרוח &#39;טוב&#39; כמעט תמיד יגרום לחללית צבעונית. עם זאת, מצאנו שמדי פעם BAC מסוים לא יכול להיות מעובד לתוך חללית טובה, וBAC שונה צריך להיות נבחרים. צעד חשוב נוסף הוא denaturation חום. אם הטמפרטורה נמוכה מדי, ה-DNA יהיה רק ​​באופן חלקי מפוגל וכלת חללית תהיה לקויה. אם הטמפרטורה גבוהה מדי, מבנה הגרעיני wiתהיה מוטרד יותר ממה שנחוץ. בידיים שלנו, 78 מעלות צלזיוס בבלוק חם הפוך היא הפשרה האידיאלית, אבל זה עשוי להשתנות בהתאם לבלוק החם המתאים בשימוש. היו לנו תוצאות טובות באמצעות הרכבה בינונית Vectashield, אבל גילינו שיש לו פחות זהב SlowFade רקע ומשמר את אות הניאון למשך זמן ארוך יותר. אנו לא ממליצים על שימוש בהרכבה בינונית קשה להגדיר כפי שמצאנו את זה כדי להשפיע על מבנה 3D וליצור בועות אוויר לאורך זמן. לסיכום, בהיר בדיקות ניאון ישירות כותרתו יחד עם פרוטוקול FISH-DNA תואר כאן מציעות פתרון יעיל לניתוח חזק ומהיר של ארכיטקטורה גרעינית אשר חל על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות.

ה-DNA הקרינה הכלאה באתר (FISH-DNA) מאפשרת הדמיה תלת ממדית של לוקוסים בודדים גן, תחומים subchromosomal וכרומוזומים אפילו כולו בכל שלבי מחזור החיים של התא. דגי 2D משמש למחקרי metaphase בעוד דגי 3D כבר נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את הקשר בין הארגון המרחבי של הגנום ותפקודו במהלך שלבי ביניים (1,2 והפניות בו). מבחינה היסטורית, מחקרי שיתוף עמותה בוצעו על ידי חקירת עשרות עד מאות בודדים לוקוסים על ידי דגים. טכניקות רב עוצמה גבוהות יותר לאחרונה תפוקה מבוססת 3C כגון 4C וHi-C פותחו 3, המאפשרות חקירה צולבת דיבורים מולקולריים בין אלפים רבים של לוקוסים שונים. בעוד טכניקות מבוססות 3C ודגי DNA יכולים להיות שיטות משלימות, הם לא בהכרח לענות על אותן השאלות. שיטות מבוססות 3C לספק readout הרכב של אוכלוסיות תאים מעורבות, וכתוצאה מכך probability לעמיתים לעמותות. בניגוד לכך, בעוד בתפוקה נמוכה, המבוססות על טכניקות דגים מציעות את האפשרות לנתח סידורים מרחביים של לוקוסים או כרומוזומים בתאים בודדים על פי שלבי המחזור התפתחותיים או סלולריים שלהם. לפיכך, דגים ימשיכו להיות כלי חשוב לחיטוט יחסי פונקצית מבנה גרעיניים. ישנם שני שיקולים עיקריים בביצוע ניסויי דגים 3D מוצלחים. אלה הם: 1. קבלת בדיקות שכותרתו בצורה אופטימלית ו -2. בחירה של טיפולים סלולריים, כולל קיבעון, לפני וצעדים שלאחר הכלאה, כדי לשמור על מורפולוגיה גרעינית עד כמה שניתן בעת ​​ביצוע ה-DNA נגישה מספיק להכלאת חללית. תיוג בדיקה יעיל חשוב מאוד לדגים. באופן מסורתי, ניק-תרגום נעשה שימוש כדי להציג או hapten או נוקלאוטידים fluorophore-מצומדות 4. בדומה לכך, ערכות ניק-תרגום המסחרי זמינות עבור hapten הישיר או התאגדות fluorophore, buלא גם לתיוג שני שלבי שימוש בנוקלאוטידים aminoallyl וצבעים אמין-תגובתי. זה האחרון הופך את שילוב צבע יעיל יותר על ידי מתן פולימראז ה-DNA מולקולה פחות מגושמת לעבוד איתו. לאחרונה, ערכות לתיוג הלא האנזימטית של ה-DNA פותחו אשר מחייבים לנצל קואורדינטיבית של פלטינה לחומצות גרעין. אפילו ניתן לרכוש כבר 5 בדיקות שכותרתו דגים. בעוד ערכות ובדיקות שיוצרו באופן מסחרי ללא ספק נותנים נוחות שימוש, הם הרבה יותר יקרים מאשר לקנות רכיבים הבודדים ובייצור בדיקות בבית. אנחנו מותאמים פרוטוקול תרגום ניק עלות נמוך כדי לתייג ישירות רבות בדיקות שונות BAC במספר צבעים. גילתה שקבלת דנ&quot;א BAC הטהור ביותר היא קריטית ותוצאות בדרישה רק 10-20 ng של חללית לכל שקופית דגים, בהשוואה ל 10 - 20 של פי יותר כאשר ה-DNA משמש תבנית טמאה, וכתוצאה מכך העלות גדולה וזמן חיסכון. השימוש באמין allyldUTP מאפשר תיוג גמיש שלבדיקות עם צבעים אמין-reactive זמינים (למשל אלקסה פלואוריד או CY-צבעים) או haptens (למשל ביוטין, digoxigenin). בדיקות hapten שכותרתו מזוהות על ידי נוגדני fluorophore-מצומדות או streptavidin להגביר ולדמיין את האות. בדיקות ישירות כותרתו בהירה בדרך כלל מראות פחות מכתים רקע ולהימנע יתר הגברה של אותות, ולכן כתוצאה מייצוג מדויק יותר של לוקליזציה גרעינית ומורפולוגיה לוקוס. קיימות מספר טכניקות דגים שונים שמשתמשות בfixatives שונה, טיפולים מראש, ושטיפות לאחר הכלאה אבל אלה בדרך כלל נופלים לתוך הקטגוריות הבאות: קיבעון glutaraldehyde עם NaOH denaturation, קיבעון פורמלדהיד עם HCl denaturation, וקיבעון פורמלדהיד עם denaturation חום 6-9 . לכל אלה יש יתרונות וחסרונות. תוצאות glutaraldehyde קיבעון בשימור מבני גרעין טוב, אבל דורש טיפול עם צמצום סוכנים כדי למזערautofluorescence כתוצאה מכך, וטיפול NaOH צריך להיות מבוקרים בקפידה כדי לאזן denaturation DNA מספיק ונזק אפשרי למבנה גרעיני 6. קיבעון פורמלדהיד הוא פחות חזק, נותן סבירות מוגברת של הפרעות של אדריכלות גרעינית, אלא גם נותן בדרך כלל אותות ונמוכים autofluorescence 9 חזקים יותר ואמינים יותר. HCl טיפול depurinates DNA ורצועות את החלבונים, ומספק גישה טובה ל-DNA לבדיקות, אלא גם עשוי להציג את הפסקות DNA. חימום פיזי שמפריד בין שני גדילי דנ&quot;א וכתוצאה מהכלאת המטרה טובה ואותות חזקים, אבל יכול לגרום להפרעות במבנה גרעיני 8. המידה שבה כל אחת מטכניקות אלה משפיע epitopes החלבון משתנית מאוד 6,9, וכתוצאה מכך הדרישה לקבוע באופן ניסיוני עבור כל חלבון הפרוטוקול האופטימלי לשימוש בניסויים חיסוני דגים. אמנם אין DNA FISH te &quot;מושלם&quot;chnique, כולם יכול להיות שימושי אם גם בשליטה. המטרה שלנו הייתה לעשות אופטימיזציה של פרוטוקול ה-DNA לדגים חזקים ולשעתק לחקור מיקום המרחבי של לוקוסים רבים במגוון רחב של סוגי תאים 10, תוך התמקדות בשיטת החימום עבור רוב האותות אמינים. עם זה ושימוש במערכת הדמיה האוטומטית נועדו להגדיל את התפוקה לניתוח תא בודד של הסדרים גרעיניים.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NTB buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>D-1532</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs</td>
 <td>Bioline</td>
 <td>BIO-39025</td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aminoallyl-dUTP</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM8439</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA Polymerase I</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M02095</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase I recombinant RNase free</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4716728001</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR purification kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104</td>
 <td>Step 1.1.4, 1.2.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOAc</td>
 <td>VWR</td>
 <td>27653</td>
 <td>Step 1.1.5, Step 2.1.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S5761</td>
 <td>Step 1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications</td>
 <td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
 <td>A32750, A32756, A32757</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO (anhydrous) </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>276855</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
 <td>Life Technologies </td>
 <td>S33102</td>
 <td>Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cot-1 DNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18440-016</td>
 <td>Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single stranded DNA from salmon testes </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>D7656 </td>
 <td>Step 2.1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized formamide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-9037</td>
 <td>Step 2.1.1.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate</td>
 <td>Sigma Life Sciences</td>
 <td>D8906 </td>
 <td>Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XMP painting probes</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td>000000-0528-837</td>
 <td>Step 2.1.1.4 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-lysine coated slides</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P0425</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrophobic pen (ImmEdge)</td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>H-4000</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70 &mu;m sieve (Mouse fetal liver cells only)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352350</td>
 <td>Step 2.1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P6148 </td>
 <td>Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Cl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saponin from Quillaja bark</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T9284 </td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x PBS</td>
 <td>Life Technologies (GIBCO)</td>
 <td>70011-036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>G/0650 </td>
 <td>Step 2.1.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20252</td>
 <td>Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47670</td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SSC</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 22</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022022A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 50</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022050A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rubber cement</td>
 <td>Marabu</td>
 <td>2901 (10 000)</td>
 <td>Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen Molecular Probes</td>
 <td>D3571</td>
 <td>Step 2.2.8 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlowFade Gold</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S36936</td>
 <td>Step 2.2.10 (mounting medium)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear nail polish</td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.2.10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nanodrop 2000</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td>
 <td>GE Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coplin jars</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td>
 <td>Step 2.1.3 onwards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen dewar </td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Base with Black Lid (light-tight chamber)</td>
 <td>Simport</td>
 <td>M920-2</td>
 <td>Step 2.1.17</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer comfort</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5355 000.011</td>
 <td>Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 &deg;C room)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Imaging and Image processing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metafer - Imaging Automation Platform</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axio Imager Z2 upright</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>epifluorescence microscope used with automated imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IX81 confocal microscope (FV1000)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>confocal microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bitplane, version 7.3</td>
 <td>Imaris</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and 3D modeling software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scientific volume Imaging, version 4.1</td>
 <td>Huygens</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and deconvolution software</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 FISH buffers and reaction mixes 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Composition</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x NTB buffer</td>
 <td>0.5 M Tris-HCl, pH 7.5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.05 M MgCl2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mg/ml BSA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix</td>
 <td>0.5 mM dGTP</td>
 <td>Store 50 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dATP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dCTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.125 mM dTTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 % PFA</td>
 <td>Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 &deg;C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA.</td>
 <td>Store 50 ml aliquots at -20 &deg;C, do not re-freeze</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 % saponin solution</td>
 <td>Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. </td>
 <td>Store 5 ml aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 x SSC</td>
 <td>Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate mix</td>
 <td>20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight.</td>
 <td>Store 500 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>

robust 3d dna fish using directly labeled probes

דגי ה-DNA 3D הפך לכלי עיקרי לניתוח ארגון תלת ממדי של הגרעין, וכמה וריאציות של הטכניקה שפורסמו. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול אשר עברו אופטימיזציה עבור חוסן, שחזור, וקלויות שימוש. מאור בדיקות ישירות כותרת ניאון מופקות על ידי ניק-תרגום עם אמינו-allyldUTP אחרי הצימוד כימי של הצבע. דגי ה-DNA 3D מתבצע באמצעות צעד הקפאת הפשרה לpermeabilization התא וצעד לחימום denaturation סימולטני של בדיקה ה-DNA והגרעינית. הפרוטוקול הוא ישים למגוון של סוגי תאים ומגוון רחב של בדיקות (BACS, פלסמידים, fosmids, או צבעי כרומוזום שלמים) ומאפשר הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה. בשיטה זו אנו שיגרתי לחקור לוקליזציה גרעינית של עד שלושה אזורים בכרומוזומים.

הפרוטוקול מתואר כאן (איור 1 לסקירה) נעשה שימוש כדי אפקט נהדר לשלב דגי DNA עם לכידת תמונת תפוקה גבוהה לניתוח של ארגון הגנומי. הדור של בדיקות איכות טובות הוא קריטי להצלחה (ראה דיון). איור 2 מדגים שתי בקרות איכות חשובות לבדיקות דגים. אחרי שניק-תרגום, כתם של ה-DNA צריך להיות גלוי עם כמות גדולה של שברי הריצה נ&quot;ב בין 150 ל 700 (איור 2 א). לאחר צימוד כימי, שילוב של צבע פלואורסצנטי ניתן ללמוד על ידי ניתוח ספקטרוסקופיות של החללית (איור 2). בעת שימוש בבדיקות טובות, בעקבות פרוטוקול FISH-DNA גורם בדרך כלל לאותות דגים DNA בהירים על רקע נמוך. אנחנו השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה על מגוון רחב של סוגי תאים שונים, וגם עם מיקרוסקופים עלית הקרינה או confocal. הדמיה אוטומטית באמצעות עלית fluorescenc<html> מיקרוסקופ האלקטרוני דורש אותות דגים חדים, הניתנים לזיהוי בקלות עם קצת רקע (איור 3), ואילו מיקרוסקופיה confocal דורשת אותות אינטנסיביים יותר. איור 4 א מציג תמונות המעובדות מייצגות. ניתן להשיג קואורדינטות גרעיניות של אותות דגים, ויחסים מרחביים של אזורים גנטיים ניתן לחשב (לדוגמה ראה איור 4). יש לנו גם בשימוש ערימות תמונה המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה confocal למודלי 3D של אותות דגים בתוך שטחי כרומוזום (סרט 1). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> איור 1. זרימת עבודה לתיוג הבדיקה ה-DNA ודגים. הכנת חללית היא מוצגת בכחול. הליך ה-DNA FISH מוצג בשחור עם פרטים שנמסרו בירוק. = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> איור 2. תיוג בדיקות על ידי ניק-תרגום ובקרת איכות של בדיקות שכותרת. א) למרוח ג&#39;ל מראה אידיאלי לפני החימום כדי להשבית DNase אני (מסלול 1: סולם DNA, מסלול 2 ו 3: Bács לאחר ניק-תרגום). ברים צריכים להיות בטווח שבין 150-700 נקודות בסיס. כתם נוסף ב~ 1 קילו הוא ציין בתדירות גבוהה עם תגובות ניק-תרגום מוצלחים. ב &#39;) ניתוח ספקטרום מלא Microvolume של בדיקות שכותרת. שיא ה-DNA ב260 ננומטר הוא ציין עם שיא שני מקביל לאורך גל הספיגה של fluorophore הבדיקה תחת כותרת: Alexa פלואוריד 488: 495 ננומטר, Alexa פלואוריד 555: 555 ננומטר, Alexa פלואוריד 647: 650 ננומטר. הראה שלוש בדיקות עם שילוב טוב: פסגות ספיגת fluorophore הן גובה דומה או גבוה יותר מפסגות DNA. יש Alexa פלואוריד 647 בדרך כלל הספיגה גבוהה יותרמAlexa פלואוריד 555, אשר בתורו יש ספיגת גבוהה יותר מאשר Alexa פלואוריד 488. אלקסה פלואוריד 488 גם סופג קצת אור ב 260 ננומטר, ולכן השיא הראשון לבדיקה זו הוא גבוה יותר מהאחרים. בדיקות עם ספיגת fluorophore תכנית שילוב גרועה 2-3-לקפל נמוכות מספיגת ה-DNA. בדיקות עם יותר משיא fluorophore הגבוה פי 2 מאשר ה-DNA השיא מכילות בדרך כלל צבע unconjugated שעלול לגרום לרקע בדגים. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> איור 3. צילום מסך מהתוכנה ההדמיה דגי 3D MetaCyte מראה ניסוי דגים בשלושה צבעים אופייניים. המסך מחולק למספר חלקים. תמונה בשדה של נוף (FOV) Raw) שנתפס על ידי מערכת סריקת שקופיות MetaCyte Metafer /. ב &#39;) גלריה של תמונות של גרעינים זיהו כי יש לבטל את<html> עיבוד תמונת dergone ופילוח לאותות דגים. סוגים שונים של נתונים יכולים להיות מוצגים על כל תמונה בגלריה. שם שקופיות במספר תא דוגמה זו מוצג שמאלית עליונה עם interallelic השונים ומרחקי interlocus ימניים עליונה וכל צד מתחת לכל תמונה. C) עם מספר הגרעינים שזוהו בניתוח. ד &#39;) תיאור של השקופית עם האזור שנסרק על ידי מערכת. ה) הגדלה של האזור שנסרק. כתמים לבנים מייצגים זיהו גרעינים לFOV. F) נתונים מעובדים. בדוגמה זו מרחקי interallelic המקסימאליים בין אותות ירוקים (למעלה) ואותות אדומים (תחתון) מוצגים. הנתונים שמוצגים הוא מP20 תאי הנבט של עכבר. בדיקות נמצאות על כרומוזומים שונים, המכסים Hbb וגנים HBA ואשכול היסטון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> . בתוך עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> איור 4. דוגמאות לתמונות שעובדו ונתונים positional נגזרו. A תמונות) מעובד לE13.5 תאי כבד עוברי של עכבר מוכתמים בדיקות BAC ממוקמות על כרומוזומים שונים המכסים Myc וKCNQ1 גנים (מכונה myc וKvDMR, בצבע ירוק ואדום, בהתאמה). B) עלילות תיבה-זיף טיוקי המייצגים את מרחק interallelic החלוקה לאותן לוקוסים 600 בגרעינים. מרחק Interallelic הוא להתוות כחלק של רדיוס הגרעין &#39;(מרחק / רדיוס) לדין וחשבון על שינויים בגודל גרעיני. יש גרעיני תאי גזע עובריים ברדיוס של כ 5 מיקרומטר. בדיקות אדומות הן משמעותית יחד קרוב יותר מחלליות ירוקות (***: p &lt;0.01, מבחן t מזווג). נתונים מ10. סרט 1. מודלים 3D של שני לוקוסים בתוכם לא כרומוזוםerritory. שתי בדיקות BAC ממוקמים קרוב לשני קצוות של כרומוזום 7 בעכבר תויגו (אדום אדום רחוק, (לבן פסאודו בצבע)) והכלאה יחד עם כל צבע כרומוזום (ירוק) לתאי הגזע העובריים של עכבר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes at JoVE.com

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

34.5K Views.  The Babraham Institute. אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

Video: Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...