עבודה זו מומנה על ידי BBSRC וקרן Wellcome. ברצוננו להודות לסיימון ווקר לקבלת סיוע עם הדמיה ופליקס קרוגר לעזרה עם ניתוח bioinformatic.

<ol>
	<li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+transcription:+shaping+the+landscape+of+the+genome.">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+3C+technologies:+insights+into+nuclear+organization.">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2000).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li><li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li><li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+(3D-FISH.">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li><li>Solovei, I., Beatty, B., Mai, S., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+on+three-dimensionally+preserved+nuclei.">FISH on three-dimensionally preserved nuclei.</a> FISH: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status.">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983 (2012).</li><li>Solovei, I., Cremer, M., Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+Cultured+Cells+Combined+with+Immunostaining.">3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining.</a> Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications. , (2010).</li></ol>

ההפקה של מאמר זה באופן חלקי בחסות Zeiss וMetaSystems קארל.

דגי ה-DNA 3D הפך לכלי להכרה רחבה לנתח סידורים מרחביים בגרעין. בעוד דגים מספק תוצאות חזותיות וישירה, כמו בכל טכניקה, צריך להיות מודעים למגבלותיו. דגי ה-DNA בפני הבעיה המהותית שטיפולים קשים יחסית יש צורך להפוך את הכרומטין נגיש לבדיקות דגים שסופו של דבר משבשים את מבנה הדבר מאוד הגרעיני שהוא להיות מנותחים. כמה אסטרטגיות כבר רדף ללהטט נגישות ושימור מבנה. בפרוטוקול המתואר כאן, ה-DNA הכרומוזומלי נעשתה נגיש על ידי permeabilization הקפאת הפשרה של תאים וDenaturation חום לפני ההכלאה חללית. Solovei, et al., (2002) ניתחו שינויים מבניים לאחר טיפול דומה ומצא כי התזוזה הממוצעת של תחומים הכרומטין הייתה 300 ננומטר אשר מגביל את הרזולוציה של ניתוח מבני לאזורים בערך 1 MB בגנום 8. אמנם זה לא ברזולוציה גבוהה, זההוא בקנה מידה סבירה לניתוח עמדה גרעינית. שיקול מעשי יותר לניתוח דג הוא שרכישת תמונה ומדידות של מרחקים גרעיניים הן תהליכי זמן רב המגבילים את מספר הגרעינים שניתן לנתח. על מנת ללמוד אירועים נדירים שמטרתם לעשות הדמיה אוטומטית קצב העברת נתונים גבוהה. ואז, עם בקרות מתאימות במקום, ניתן להשוות בכמות מספקת כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי חזק של יחסים מרחביים. אנו שגרתי לנתח 600 גרעינים לכל נקודת נתונים שעבורו אנו קובעים את קואורדינטות 3D של כל אותות הדגים בתוך הנפח הגרעיני. נתונים אלה דורשים שטח אחסון קטן מאוד ומאפשרים ניתוח של מרחקים בין משפחות ותוך allelic, או עמדות רדיאליים בכל שלב מאוחר יותר. יתר על כן, אפשר לעשות עיבוד אוטומטי באופן עיוור חוקר אשר מקטין באופן משמעותי את הסבירות להטיה לא מודעת. כדי לאפשר לanalys תפוקה גבוהה מסוג זההוא, המטרה שלנו הייתה להקים בדרך מהירה ויעילה של ביצוע דגי ה-DNA. מצאנו הפרוטוקול מתואר כאן להיות מאוד חזק, באופן עקבי לייצר אותות בהירים עם רקע נמוך. זה עבד לכל סוגי התאים שניסינו סיפק לנו להתאים את הצעד של הצמדת התאים לשקופית. יתר על כן, עם חריג אחד, כולנו משמשים Bács יכול להפוך לבדיקות בהירות. יש לנו גם זוהו בהצלחה מספר החלבונים גרעיניים על ידי מכתים נוגדן לאחר דגי ה-DNA. בעוד עבור חלבונים מסוימים זה עובד טוב, אנו ממליצים השוואה עם immunofluorescence המסורתי (IF) על מנת להבטיח עקביות של דפוס מכתים הנוגדן בין אם ודגים חיסוני דנ&quot;א (השווה 11). באופן כללי, מצאנו כי בדיקות שכותרת בצבעים שונים הפיקו את אותן תוצאות. עם זאת, יש לשקול את ההיבטים הבאים בעת בחירת צבע הסימון. ראשית, הצבע של fluorophore צריך להיות גם לזיהוי על ידי u מיקרוסקופSED. שנית, אורך הגל של האור הנפלט על ידי fluorophores צריך להיות שונה במידה מספקת, כדי למנוע דימום דרך לערוץ האחר. זה יהיה תלוי במסננים במיקרוסקופ. והשלישי, לפחות בידיים שלנו, כמה צבעים לייצר אותות בהירים יותר באופן עקבי יותר מאחרים. יש לנו תמיד משמשים DAPI (כחול) כcounterstain שהופך אלקסה פלואוריד 555 (אדום), 488 (ירוק), ו647 (הרבה אדום) בחירות טובות עבור תיוג בדיקות. עם מערכת ההדמיה שלנו, מצא אלקסה פלואוריד 555 (אדום) כדי לייצר את האותות הבהירים ביותר, ואחריו Alexa פלואוריד 488 (ירוק). יש Alexa פלואוריד 647 (הרבה אדום) חסרון שלא ניתן לאתר אותו על ידי העין האנושית ולכן לא ניתן לראות אותות כשמסתכלים למטה למיקרוסקופ. לכן, אם עושים דגים בשני צבעים, אנו ממליצים על שילוב של צבעים אדומים וירוקים. שתי בעיות עיקריות שעשויות להתעורר: תאים לשטוף מעליו את השקופיות ואותות חלשים. כיצד תאים גם לדבוק בשקופית היא betw עצומה משתנהסוגי een סלולריים, ואת הפרוטוקול הטוב ביותר ליישב / תאי זרע צריך להיות נחושים. אנחנו השתמשנו בהצלחה גם מטען חשמלי חיובי או שקופיות מצופות פולי-L-ליזין (קנה מוכן לשימוש), אבל מצא תאים בדרך כלל דבקו טובים יותר לשקופיות מצופות פולי-L-ליזין. מצאו גם כי כאשר תאים היו אזורים שלמים צפופים מדי הייתם להתקלף כמו סדין, ואילו הדמיה אוטומטית הכבידה אם התאים היו דלילים מדי. לכן, אם המדגם הוא לא יקר מדי, יש זורעים מספרי תאים שונים כדי לקבוע את הצפיפות האידיאלית. אם תאים נוטים לשטוף במיוחד, ניתן להשתמש בעט מחסום הידרופובי, וניתן לבצע את הפעולות דגים על ידי pipetting בזהירות פתרונות ישירות על גבי שקופית. גם מפחית באופן דרסטי Pipetting הכרכים של חומרים כימיים הנחוצים, אבל לוקח זמן רב יותר במידה ניכרת כאשר עושה מספר שקופיות. אותות חלשים הם בדרך כלל עקב בדיקות עניות, וזה בהחלט שווה להשקיע את הזמן לעשייה טוב. הנקי BAC-DNA יש להשתמשד כחומר מוצא אשר ניתן להשיג על ידי משקעים חוזרים ונשנים או ערכות זמינות מסחרי. זיהום חיידקים עם הדנ&quot;א הגנומי משפיע לרעה על איכות בדיקה וטיפול זהיר במהלך תמוגה תא וסינון של lysate התא נדרש כדי לשמור אותו למינימום. , היא, לעומת זאת אין צורך להשתמש בצעד exonuclease לעיכול ה-DNA ליניארי, כמו זה מפחית תשואה במידה רבה. תיוג יעיל של הבדיקה הוא קריטי. בקרת האיכות החשובה ביותר של שלב זה היא לבדוק את גודל השבר לאחר תרגום ניק (ראה נציג תוצאות). למרוח &#39;טוב&#39; כמעט תמיד יגרום לחללית צבעונית. עם זאת, מצאנו שמדי פעם BAC מסוים לא יכול להיות מעובד לתוך חללית טובה, וBAC שונה צריך להיות נבחרים. צעד חשוב נוסף הוא denaturation חום. אם הטמפרטורה נמוכה מדי, ה-DNA יהיה רק ​​באופן חלקי מפוגל וכלת חללית תהיה לקויה. אם הטמפרטורה גבוהה מדי, מבנה הגרעיני wiתהיה מוטרד יותר ממה שנחוץ. בידיים שלנו, 78 מעלות צלזיוס בבלוק חם הפוך היא הפשרה האידיאלית, אבל זה עשוי להשתנות בהתאם לבלוק החם המתאים בשימוש. היו לנו תוצאות טובות באמצעות הרכבה בינונית Vectashield, אבל גילינו שיש לו פחות זהב SlowFade רקע ומשמר את אות הניאון למשך זמן ארוך יותר. אנו לא ממליצים על שימוש בהרכבה בינונית קשה להגדיר כפי שמצאנו את זה כדי להשפיע על מבנה 3D וליצור בועות אוויר לאורך זמן. לסיכום, בהיר בדיקות ניאון ישירות כותרתו יחד עם פרוטוקול FISH-DNA תואר כאן מציעות פתרון יעיל לניתוח חזק ומהיר של ארכיטקטורה גרעינית אשר חל על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות.

ה-DNA הקרינה הכלאה באתר (FISH-DNA) מאפשרת הדמיה תלת ממדית של לוקוסים בודדים גן, תחומים subchromosomal וכרומוזומים אפילו כולו בכל שלבי מחזור החיים של התא. דגי 2D משמש למחקרי metaphase בעוד דגי 3D כבר נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את הקשר בין הארגון המרחבי של הגנום ותפקודו במהלך שלבי ביניים (1,2 והפניות בו). מבחינה היסטורית, מחקרי שיתוף עמותה בוצעו על ידי חקירת עשרות עד מאות בודדים לוקוסים על ידי דגים. טכניקות רב עוצמה גבוהות יותר לאחרונה תפוקה מבוססת 3C כגון 4C וHi-C פותחו 3, המאפשרות חקירה צולבת דיבורים מולקולריים בין אלפים רבים של לוקוסים שונים. בעוד טכניקות מבוססות 3C ודגי DNA יכולים להיות שיטות משלימות, הם לא בהכרח לענות על אותן השאלות. שיטות מבוססות 3C לספק readout הרכב של אוכלוסיות תאים מעורבות, וכתוצאה מכך probability לעמיתים לעמותות. בניגוד לכך, בעוד בתפוקה נמוכה, המבוססות על טכניקות דגים מציעות את האפשרות לנתח סידורים מרחביים של לוקוסים או כרומוזומים בתאים בודדים על פי שלבי המחזור התפתחותיים או סלולריים שלהם. לפיכך, דגים ימשיכו להיות כלי חשוב לחיטוט יחסי פונקצית מבנה גרעיניים. ישנם שני שיקולים עיקריים בביצוע ניסויי דגים 3D מוצלחים. אלה הם: 1. קבלת בדיקות שכותרתו בצורה אופטימלית ו -2. בחירה של טיפולים סלולריים, כולל קיבעון, לפני וצעדים שלאחר הכלאה, כדי לשמור על מורפולוגיה גרעינית עד כמה שניתן בעת ​​ביצוע ה-DNA נגישה מספיק להכלאת חללית. תיוג בדיקה יעיל חשוב מאוד לדגים. באופן מסורתי, ניק-תרגום נעשה שימוש כדי להציג או hapten או נוקלאוטידים fluorophore-מצומדות 4. בדומה לכך, ערכות ניק-תרגום המסחרי זמינות עבור hapten הישיר או התאגדות fluorophore, buלא גם לתיוג שני שלבי שימוש בנוקלאוטידים aminoallyl וצבעים אמין-תגובתי. זה האחרון הופך את שילוב צבע יעיל יותר על ידי מתן פולימראז ה-DNA מולקולה פחות מגושמת לעבוד איתו. לאחרונה, ערכות לתיוג הלא האנזימטית של ה-DNA פותחו אשר מחייבים לנצל קואורדינטיבית של פלטינה לחומצות גרעין. אפילו ניתן לרכוש כבר 5 בדיקות שכותרתו דגים. בעוד ערכות ובדיקות שיוצרו באופן מסחרי ללא ספק נותנים נוחות שימוש, הם הרבה יותר יקרים מאשר לקנות רכיבים הבודדים ובייצור בדיקות בבית. אנחנו מותאמים פרוטוקול תרגום ניק עלות נמוך כדי לתייג ישירות רבות בדיקות שונות BAC במספר צבעים. גילתה שקבלת דנ&quot;א BAC הטהור ביותר היא קריטית ותוצאות בדרישה רק 10-20 ng של חללית לכל שקופית דגים, בהשוואה ל 10 - 20 של פי יותר כאשר ה-DNA משמש תבנית טמאה, וכתוצאה מכך העלות גדולה וזמן חיסכון. השימוש באמין allyldUTP מאפשר תיוג גמיש שלבדיקות עם צבעים אמין-reactive זמינים (למשל אלקסה פלואוריד או CY-צבעים) או haptens (למשל ביוטין, digoxigenin). בדיקות hapten שכותרתו מזוהות על ידי נוגדני fluorophore-מצומדות או streptavidin להגביר ולדמיין את האות. בדיקות ישירות כותרתו בהירה בדרך כלל מראות פחות מכתים רקע ולהימנע יתר הגברה של אותות, ולכן כתוצאה מייצוג מדויק יותר של לוקליזציה גרעינית ומורפולוגיה לוקוס. קיימות מספר טכניקות דגים שונים שמשתמשות בfixatives שונה, טיפולים מראש, ושטיפות לאחר הכלאה אבל אלה בדרך כלל נופלים לתוך הקטגוריות הבאות: קיבעון glutaraldehyde עם NaOH denaturation, קיבעון פורמלדהיד עם HCl denaturation, וקיבעון פורמלדהיד עם denaturation חום 6-9 . לכל אלה יש יתרונות וחסרונות. תוצאות glutaraldehyde קיבעון בשימור מבני גרעין טוב, אבל דורש טיפול עם צמצום סוכנים כדי למזערautofluorescence כתוצאה מכך, וטיפול NaOH צריך להיות מבוקרים בקפידה כדי לאזן denaturation DNA מספיק ונזק אפשרי למבנה גרעיני 6. קיבעון פורמלדהיד הוא פחות חזק, נותן סבירות מוגברת של הפרעות של אדריכלות גרעינית, אלא גם נותן בדרך כלל אותות ונמוכים autofluorescence 9 חזקים יותר ואמינים יותר. HCl טיפול depurinates DNA ורצועות את החלבונים, ומספק גישה טובה ל-DNA לבדיקות, אלא גם עשוי להציג את הפסקות DNA. חימום פיזי שמפריד בין שני גדילי דנ&quot;א וכתוצאה מהכלאת המטרה טובה ואותות חזקים, אבל יכול לגרום להפרעות במבנה גרעיני 8. המידה שבה כל אחת מטכניקות אלה משפיע epitopes החלבון משתנית מאוד 6,9, וכתוצאה מכך הדרישה לקבוע באופן ניסיוני עבור כל חלבון הפרוטוקול האופטימלי לשימוש בניסויים חיסוני דגים. אמנם אין DNA FISH te &quot;מושלם&quot;chnique, כולם יכול להיות שימושי אם גם בשליטה. המטרה שלנו הייתה לעשות אופטימיזציה של פרוטוקול ה-DNA לדגים חזקים ולשעתק לחקור מיקום המרחבי של לוקוסים רבים במגוון רחב של סוגי תאים 10, תוך התמקדות בשיטת החימום עבור רוב האותות אמינים. עם זה ושימוש במערכת הדמיה האוטומטית נועדו להגדיל את התפוקה לניתוח תא בודד של הסדרים גרעיניים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NTB buffer</td><td></td><td></td><td>Step 1.1.1 (See &#039;FISH buffers and reaction mixes&#039; list below)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D-1532</td><td>Step 1.1.1</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td>Step 1.1.1 (See &#039;FISH buffers and reaction mixes&#039; list below)</td></tr><tr><td>Aminoallyl-dUTP</td><td>Ambion</td><td>AM8439</td><td>Step 1.1.1</td></tr><tr><td>DNA Polymerase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M02095</td><td>Step 1.1.1</td></tr><tr><td>DNase I recombinant RNase free</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Step 1.1.1</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Step 1.1.4, 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>Step 1.1.5, Step 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Step 1.2.1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>A32750, A32756, A32757</td><td>Step 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO (anhydrous) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>Step 1.2.2</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td>Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)</td></tr><tr><td>Single stranded DNA from salmon testes </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>Step 2.1.1.1</td></tr><tr><td>Deionised formamide</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>Step 2.1.1.3 (Health hazard)</td></tr><tr><td>Dextran sulphate</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8906</td><td>Step 2.1.1.4 (See &#039;FISH buffers and reaction mixes&#039; list below)</td></tr><tr><td>XMP painting probes</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>Step 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated slides</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0425</td><td>Step 2.1.2</td></tr><tr><td>Hydrophobic pen (ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Step 2.1.2</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m sieve (Mouse f&amp;#8211;tal liver cells only)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>Step 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See &#039;FISH buffers and reaction mixes&#039; list below)</td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>Step 2.1.3 (See &#039;FISH buffers and reaction mixes&#039; list below)</td></tr><tr><td>Saponin from Quillaja bark</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See &#039;FISH buffers and reaction mixes&#039; list below)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)</td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Life Technologies (GIBCO)</td><td>70011-036</td><td>Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650</td><td>Step 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td>Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)</td></tr><tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See &#039;FISH buffers and reaction mixes&#039; list below)</td></tr><tr><td>Coverslips 22 x 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>Step 2.1.15</td></tr><tr><td>Coverslips 22 x 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>Step 2.1.15</td></tr><tr><td>Rubber cement</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>D3571</td><td>Step 2.2.8 (Health hazard)</td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>Step 2.2.10 (mounting medium)</td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>Any supplier</td><td></td><td>Step 2.2.10</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>Step 1.2.4</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td><td>Step 2.1.3 onwards</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen dewar </td><td>Any supplier</td><td></td><td>Step 2.1.7</td></tr><tr><td>Base with Black Lid (light-tight chamber)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Step 2.1.17</td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 &amp;deg;C room)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Imaging and Image processing&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Metafer - Imaging Automation Platform</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>automated imaging software</td></tr><tr><td>MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>automated imaging software</td></tr><tr><td>Axio Imager Z2 upright</td><td>Zeiss</td><td></td><td>epifluorescence microscope used with automated imaging</td></tr><tr><td>IX81 confocal microscope (FV1000)</td><td>Olympus</td><td></td><td>confocal microscope</td></tr><tr><td>Bitplane, version 7.3</td><td>Imaris</td><td></td><td>image analysis and 3D modelling software</td></tr><tr><td>Scientific volume Imaging, version 4.1</td><td>Huygens</td><td></td><td>image analysis and deconvolution software</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;strong&gt;FISH buffers and reaction mixes &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;table border=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Composition&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;10 x NTB buffer&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.5 M Tris-HCl, pH 7.5&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.05 M MgCl2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.5 mg/ml BSA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;dNTP Mix&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.5 mM dGTP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Store 50 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;deg;C&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.5 mM dATP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.5 mM dCTP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.125 mM dTTP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;4 % PFA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 &amp;deg;C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Store 50 ml aliquots at -20 &amp;deg;C, do not re-freeze&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;2 % saponin solution&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Store 5 ml aliquots at -20 &amp;deg;C&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;20 x SSC&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Dextran sulphate mix&lt;/td&gt; &lt;td&gt;20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Store 500 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;deg;C&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; </td></tr></tbody></table>

robust 3d dna fish using directly labeled probes

דגי ה-DNA 3D הפך לכלי עיקרי לניתוח ארגון תלת ממדי של הגרעין, וכמה וריאציות של הטכניקה שפורסמו. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול אשר עברו אופטימיזציה עבור חוסן, שחזור, וקלויות שימוש. מאור בדיקות ישירות כותרת ניאון מופקות על ידי ניק-תרגום עם אמינו-allyldUTP אחרי הצימוד כימי של הצבע. דגי ה-DNA 3D מתבצע באמצעות צעד הקפאת הפשרה לpermeabilization התא וצעד לחימום denaturation סימולטני של בדיקה ה-DNA והגרעינית. הפרוטוקול הוא ישים למגוון של סוגי תאים ומגוון רחב של בדיקות (BACS, פלסמידים, fosmids, או צבעי כרומוזום שלמים) ומאפשר הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה. בשיטה זו אנו שיגרתי לחקור לוקליזציה גרעינית של עד שלושה אזורים בכרומוזומים.

הפרוטוקול מתואר כאן (איור 1 לסקירה) נעשה שימוש כדי אפקט נהדר לשלב דגי DNA עם לכידת תמונת תפוקה גבוהה לניתוח של ארגון הגנומי. הדור של בדיקות איכות טובות הוא קריטי להצלחה (ראה דיון). איור 2 מדגים שתי בקרות איכות חשובות לבדיקות דגים. אחרי שניק-תרגום, כתם של ה-DNA צריך להיות גלוי עם כמות גדולה של שברי הריצה נ&quot;ב בין 150 ל 700 (איור 2 א). לאחר צימוד כימי, שילוב של צבע פלואורסצנטי ניתן ללמוד על ידי ניתוח ספקטרוסקופיות של החללית (איור 2). בעת שימוש בבדיקות טובות, בעקבות פרוטוקול FISH-DNA גורם בדרך כלל לאותות דגים DNA בהירים על רקע נמוך. אנחנו השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה על מגוון רחב של סוגי תאים שונים, וגם עם מיקרוסקופים עלית הקרינה או confocal. הדמיה אוטומטית באמצעות עלית fluorescenc<html> מיקרוסקופ האלקטרוני דורש אותות דגים חדים, הניתנים לזיהוי בקלות עם קצת רקע (איור 3), ואילו מיקרוסקופיה confocal דורשת אותות אינטנסיביים יותר. איור 4 א מציג תמונות המעובדות מייצגות. ניתן להשיג קואורדינטות גרעיניות של אותות דגים, ויחסים מרחביים של אזורים גנטיים ניתן לחשב (לדוגמה ראה איור 4). יש לנו גם בשימוש ערימות תמונה המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה confocal למודלי 3D של אותות דגים בתוך שטחי כרומוזום (סרט 1). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> איור 1. זרימת עבודה לתיוג הבדיקה ה-DNA ודגים. הכנת חללית היא מוצגת בכחול. הליך ה-DNA FISH מוצג בשחור עם פרטים שנמסרו בירוק. = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> איור 2. תיוג בדיקות על ידי ניק-תרגום ובקרת איכות של בדיקות שכותרת. א) למרוח ג&#39;ל מראה אידיאלי לפני החימום כדי להשבית DNase אני (מסלול 1: סולם DNA, מסלול 2 ו 3: Bács לאחר ניק-תרגום). ברים צריכים להיות בטווח שבין 150-700 נקודות בסיס. כתם נוסף ב~ 1 קילו הוא ציין בתדירות גבוהה עם תגובות ניק-תרגום מוצלחים. ב &#39;) ניתוח ספקטרום מלא Microvolume של בדיקות שכותרת. שיא ה-DNA ב260 ננומטר הוא ציין עם שיא שני מקביל לאורך גל הספיגה של fluorophore הבדיקה תחת כותרת: Alexa פלואוריד 488: 495 ננומטר, Alexa פלואוריד 555: 555 ננומטר, Alexa פלואוריד 647: 650 ננומטר. הראה שלוש בדיקות עם שילוב טוב: פסגות ספיגת fluorophore הן גובה דומה או גבוה יותר מפסגות DNA. יש Alexa פלואוריד 647 בדרך כלל הספיגה גבוהה יותרמAlexa פלואוריד 555, אשר בתורו יש ספיגת גבוהה יותר מאשר Alexa פלואוריד 488. אלקסה פלואוריד 488 גם סופג קצת אור ב 260 ננומטר, ולכן השיא הראשון לבדיקה זו הוא גבוה יותר מהאחרים. בדיקות עם ספיגת fluorophore תכנית שילוב גרועה 2-3-לקפל נמוכות מספיגת ה-DNA. בדיקות עם יותר משיא fluorophore הגבוה פי 2 מאשר ה-DNA השיא מכילות בדרך כלל צבע unconjugated שעלול לגרום לרקע בדגים. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> איור 3. צילום מסך מהתוכנה ההדמיה דגי 3D MetaCyte מראה ניסוי דגים בשלושה צבעים אופייניים. המסך מחולק למספר חלקים. תמונה בשדה של נוף (FOV) Raw) שנתפס על ידי מערכת סריקת שקופיות MetaCyte Metafer /. ב &#39;) גלריה של תמונות של גרעינים זיהו כי יש לבטל את<html> עיבוד תמונת dergone ופילוח לאותות דגים. סוגים שונים של נתונים יכולים להיות מוצגים על כל תמונה בגלריה. שם שקופיות במספר תא דוגמה זו מוצג שמאלית עליונה עם interallelic השונים ומרחקי interlocus ימניים עליונה וכל צד מתחת לכל תמונה. C) עם מספר הגרעינים שזוהו בניתוח. ד &#39;) תיאור של השקופית עם האזור שנסרק על ידי מערכת. ה) הגדלה של האזור שנסרק. כתמים לבנים מייצגים זיהו גרעינים לFOV. F) נתונים מעובדים. בדוגמה זו מרחקי interallelic המקסימאליים בין אותות ירוקים (למעלה) ואותות אדומים (תחתון) מוצגים. הנתונים שמוצגים הוא מP20 תאי הנבט של עכבר. בדיקות נמצאות על כרומוזומים שונים, המכסים Hbb וגנים HBA ואשכול היסטון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> . בתוך עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> איור 4. דוגמאות לתמונות שעובדו ונתונים positional נגזרו. A תמונות) מעובד לE13.5 תאי כבד עוברי של עכבר מוכתמים בדיקות BAC ממוקמות על כרומוזומים שונים המכסים Myc וKCNQ1 גנים (מכונה myc וKvDMR, בצבע ירוק ואדום, בהתאמה). B) עלילות תיבה-זיף טיוקי המייצגים את מרחק interallelic החלוקה לאותן לוקוסים 600 בגרעינים. מרחק Interallelic הוא להתוות כחלק של רדיוס הגרעין &#39;(מרחק / רדיוס) לדין וחשבון על שינויים בגודל גרעיני. יש גרעיני תאי גזע עובריים ברדיוס של כ 5 מיקרומטר. בדיקות אדומות הן משמעותית יחד קרוב יותר מחלליות ירוקות (***: p &lt;0.01, מבחן t מזווג). נתונים מ10. סרט 1. מודלים 3D של שני לוקוסים בתוכם לא כרומוזוםerritory. שתי בדיקות BAC ממוקמים קרוב לשני קצוות של כרומוזום 7 בעכבר תויגו (אדום אדום רחוק, (לבן פסאודו בצבע)) והכלאה יחד עם כל צבע כרומוזום (ירוק) לתאי הגזע העובריים של עכבר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes at JoVE.com

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

34.5K Views.  The Babraham Institute. אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

Video: Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Genetics

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene expression, cell identity and differentiation. Many approaches developed to study the 3D architecture of the genome can be divided into two complementary categories: chromosome conformation capture based technologies (C-technologies) and imaging. While the former is based on capturing the chromosome conformation and proximal DNA interactions in a population of fixed cells, the latter, based on DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) on 3D-preserved nuclei, allows contemporary visualization of multiple loci at a single cell level (multicolor), examining their interactions and distribution within the nucleus (3D multicolor DNA FISH). The technique of 3D multicolor DNA FISH has a limitation of visualizing only a few predetermined loci, not permitting a comprehensive analysis of the nuclear architecture. However, given the robustness of its results, 3D multicolor DNA FISH in combination with 3D-microscopy and image reconstruction is a possible method to validate C-technology based results and to unambiguously study the position and organization of specific loci at a single cell level. Here, we propose a step by step method of 3D multicolor DNA FISH suitable for a wide range of human primary cells and discuss all the practical actions, crucial steps, notions of 3D imaging and data analysis needed to obtained a successful and informative 3D multicolor DNA FISH within different biological contexts.

3D multicolor DNA FISH represents a tool to visualize multiple genomic loci within 3D preserved nuclei, unambiguously defining their reciprocal interactions and localization within the nuclear space at a single cell level. Here, a step by step protocol is described for a wide spectrum of human primary cells.

3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Developmental Biology

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

3D DNA FISH: A Technique to Locate a Specific Gene on a Chromosome

Source: Gallerani, G. et.al.&#160;<a href="https://www.jove.com/v/56936/characterization-tumor-cells-using-medical-wire-for-capturing">Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH.</a> J. Vis. Exp. (2017).
Circulating tumor cells (CTC) isolation and characterization from the blood of cancer patients is a type of non-invasive liquid biopsy and associated with relapse and disease progression. This video describes the technique of DNA fluorescence-in-situ-hybridization (DNA FISH) on CTCs captured on a medical wire, to study a specific gene of interest.

דג DNA תלת-ממדי: טכניקה לאיתור גן מסוים על כרומוזום

Source: Gallerani, G. et.al.&#160;Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on ...

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video