המחברים מבקשים להודות בריאן Muntean, שאו הנה מאקי טקהאשי ובלייר מל לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מ-NIH (DK080640) ואת אוניברסיטת טולדו &amp; ProMedica פרס גירוי Translational מחקר של ד&quot;ר Surya נאולי.

1. התא טיפול מקדים והכנה metaphase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים גדלים שינוי של Dulbecco בינוני של הנשרים (DMEM) המכיל 10-15% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באינקובטור, עד שהם מגיעים 70-80% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים עם פתרון colcemid ב 0.05 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​30-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הבינוני המכיל את כל התאים הצפים בתוך 50 מ&quot;ל צינורות סטריליים בז צנטריפוגות. שוטפים את התאים בצלחת עם sterile1X-PBS. לאחר דוגרים עם טריפסין סטרילי עבור 1-2 דקות, הקציר לאסוף את התאים הנותרים לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את הצינורות ב 1000 סל&quot;ד במשך 5 דקות, לשאוב supernatant לעזוב 0.5 מ&quot;ל לשחרר גלולה ידי מצליף עם האצבע בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי בגודל גלולה, מוסיפים 5-10 מ&quot;ל של תמיסת KCl hypotonic של 0.56% ב DH 2 O ו דגירה ההשעיה על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של מתנול / חומצה אצטית(03:01 Vol / Vol) לכל מ&quot;ל של תרחיף תאים hypotonic והפוך את הצינור בעדינות לערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת בסל&quot;ד 1200 דקות 5 ולאסוף גלולה כצעד 1.4, ולאחר מכן להוסיף 5 מ&quot;ל מתנול רעננה / חומצה אצטית (03:01 כרך / כרך א &#39;) dropwise הפתרון מקבע בעוד מצליף גלולה ברציפות. הליך זה הוא קריטי, כך מתפשט metaphase לא יהיה לכוד בתוך גושים של תאים אשר היה לסכן את הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת שוב בסל&quot;ד 1200 5 דקות ומוסיפים 5-10 מ&quot;ל של מתנול קר כקרח / מקבע חומצה אצטית לאורך הקיר של הצינור. בשלב זה, אם יש צורך, התאים ניתן לאחסן את הפתרון מקבע בצינור להדק ונחתם ב -20 ° C לטווח קצר או -80 ° C לטווח ארוך (שנים) לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות נקיים באתנול מוחלטת, ואז לטבול שקופית 2 DH O עבור approximately10X על מנת ליצור מעטפת של מים על פני השטח של השקופית. מניחים את השקף על צלחת זכוכית ירידה של 15 20μl ההשעיה תא (משלב 1.8) מ 10 &quot;מעל השקופית. מניחים את שקף באמבט מים נקבע על 65-70 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השקופיות מתחת למיקרוסקופ אור באמצעות יעדים יבשים 10X ו 40X מוודא שיש הוא הכרומוזומים metaphase ו המרווחים הם מחולקת באופן שווה. לבדוק את קיומו הציטופלסמה סביב הכרומוזומים. אם הציטופלסמה היא להמשיך הנוכחי עם טיפול מקדים שקופיות (העיכול פפסין), אם הציטופלסמה לא קיים ואת הכרומוזומים יש מורפולוגיה טוב, אז אין צורך המקדים שקופיות. </li></ol> 2. Slide המקדים (טיפול עכלן) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 120 μl של פתרון RNase 1:200 (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) מומס 2X-SSC על 24 מ&quot;מ coverglass מיקרוסקופ x 60 מ&quot;מ ו להפוך את פני השקופית metaphase על coverglass אז בעדינות ללא מרחב הפנים שקופיות metaphase מעלה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את coverglass מבלי לשרוט את השקופית ולשטוף במאגר 2X-SSC בצנצנת coplin כל 5 דקות במשך 15 דקותעם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5-15 μl של פתרון המניות עכלן (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב DH 2 O) לתוך מבחנה נקייה ולאחר מכן להוסיף 100 מ&quot;ל של prewarmed (37 ° C) 0.01M HCl. חשוב עכלן מתווסף לתוך נקי 1 כוס ולא ישירות פתרון ה-HCL, אחרת זה לא מתמוססים פתרון. דגירה שקופיות בצנצנת coplin המכיל את הפתרון HCl / עכלן על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות. שלב זה הוא קריטי מאוד לעיכול יותר מדי יגרום הכרומוזומים להיות overdigested מדי לעיכול מעט יעזוב הציטופלסמה לא מעוכל אשר עשוי להוביל מחייב הלא ספציפית של החללית ולהפריע האות ההכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית בצנצנת המכילה 100 מ&quot;ל coplin 1X-PBS דקות 5 פעמיים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית בצנצנת המכילה 100 מ&quot;ל coplin 1X-PBS/MgCl 2 דקות 5 בטמפרטורת החדר (50 מ&quot;ל של 1M MgCl 2 ב 950 מ&quot;ל של 1X-PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקופית צנצנת coplin containinז 100 מ&quot;ל פורמלדהיד 1% עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (1.7 מ&quot;ל של פורמלדהיד 37% ל -100 מ&quot;ל של 1X-PBS/MgCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית בצנצנת המכילה 100 מ&quot;ל coplin 1X-PBS דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב שקופיות תחת מיקרוסקופ אור באמצעות עדשה יבש 40X כדי להבטיח את השקופיות מתעכל כראוי הציטופלסמה לא קיים ואת המורפולוגיה כרומוזום נשמר. בחר אזור הכלאה באמצעות עט היהלומים. </li></ol> 3. כרומוזום ו החללית denaturation ואת ההכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון denaturing טרי (70% formamide/2X SSC, pH 7.0) ו prewarm ל 70-80 מעלות צלזיוס בתוך צנצנת coplin ממוקם במקום אמבט מים שקופיות בצנצנת coplin המכיל את הפתרון denaturing באמבט מים 70 ° C על כרומוזומים העכבר ו -80 מעלות צלזיוס במשך הכרומוזומים אדם בשנות ה -30 דקות, 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד למקם את השקופית באתנול קפוא 70% עבור 3 דקות לאחר מכן 80% אתנול ו 100% עבור 3 דקות כל אחד ואוויר יבש. לבחון את השקופיתהמורפולוגיה של כרומוזום. מורפולוגיה כרומוזום טוב הוא כונה על ידי הכרומוזומים כהים ולא &quot;שלב האור&quot;, או הילה כרומוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את החללית SkyPaint (ערכת צבע השמים: בקבוקון # 1) על 37 מעלות צלזיוס עם רועדת על המערבולת 20 דק &#39;, ו צנטריפוגות בקצרה בסל&quot;ד 1000 למשך מספר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל בדיקה ב thermocycler מתוכנת עבור מחזור שני שלבים על 85 מעלות צלזיוס במשך מחזור 5 דקות לאחר מכן 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות כדי לאפשר בדיקה שכותרתו-DNA של preannealing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 10μl של החללית מפוגל על ​​שטח של הכלאה ומכסים 22 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ coverglass לוודא שלא ללכוד בועות אוויר. סוגרים את הקצוות של coverglass במלט גומי דגירה בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 48-72 שעות. </li></ol> 4. בדיקה לגילוי פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverglass בזהירות ומניחים את השקופית בצנצנת coplin המכיל prewarmed (45 ° C) כביסה פתרון אני (לפוראמיד 50% מוכן טרי 2X SSC). לשטוף 5 דקותשלוש פעמים ב 45 מעלות צלזיוס באמבט מים רועד בסל&quot;ד 45 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שקופית כביסה הפתרון השני (1X SSC) על 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות פעמיים עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שקופית כביסה פתרון III (% 4X SSC/0.1 Tween 20) 5 דקות ב 45 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 80 μl של ריאגנט חוסם (ערכת צבע השמים: בקבוקון # 2), במקום coverslip ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את השקופית ולאפשר נוזל לנקז. החל 80 μl של מגיב Cy5 מכתים (מרוכז זיהוי נוגדן CAD הערכה: בקבוקון # 3), להחיל coverglass ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית עם הכביסה הפתרון השלישי על 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות שלוש פעמים עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 80 μl של מגיב Cy5.5 מכתים (מרוכז זיהוי נוגדן CAD הערכה: בקבוקון מס &#39;4), במקום coverglass ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית עם הכביסה הפתרון השלישי על 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות שלוש פעמים עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את השקופית ולאפשר נוזלים<html> לנקז. החל 20 μl של מגיב DAPI נגד דהייה (ערכת צבע השמים: בקבוקון # 5) ומקום 24 מ&quot;מ coverglass מיקרוסקופ x 60 מ&quot;מ. מוציאים בזהירות את בועות אוויר שאולי נוצרו. שקופיות ניתן הדמיה באופן מיידי או לשמור על 4 מעלות צלזיוס בחושך לא יותר משבוע 1. </li></ol> 5. תמונה הרכישה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת התמונה נעשית על ידי הצגת שקופיות metaphase באמצעות מיקרוסקופ אולימפוס מצוידת בעדשה טבילה 60x שמן, קוביית ספקטרלית (אישית מעוצבת משולשת לעבור הלהקה מסנן), מסנן DAPI ואת מודול interferometer sagnac עם מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספקטרליים למוצרי Karyotypes בוצעו באמצעות Sky View תוכנה (יישומי דימות ספקטרלי גרסה 1.62), לאחר ידנית של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניתוח התמונות, הכרומוזומים ניתן לראות תמונות צבע (עם צבעי ניאון ספציפיים), תמונות צבע פסאודו (עם צבעים לסיווג) ו הפוכים תמונות DAPI (דפוס רצועות ספציפי). </li></ol>e_title &quot;&gt; 6. נציג תוצאות הליך SKY מלאה בדרך כלל לוקח בערך פעם בשבוע (איור 1). זה כולל רכישת התמונה וניתוח ובלבד התאים metaphase נמצאים אספקה ​​נאותה. ניתוח Karyotyping מגלה קריוטיפ עכבר רגיל (40, XY) של תאים מעכברים סוג בר (איור 2 א). לעומת זאת, תאים Pkd1 - / - עכבר (מודל PKD העכבר) מראה גידול משמעותי במספר הכרומוזומים וכן מומים מבניים, כגון מחיקות כרומוזומים (כרומוזום מס &#39;8) ו (טרנסלוקציות # כרומוזומים 11 ו 19) (איור 2b). אנחנו גם ניתח רקמות כלי דם מן החולים ADPKD. מחקר שנערך על ידי פשוט לספור את מספר הכרומוזומים ציינו כי לא ADPKD וכמה דוגמאות כלי הדם ADPKD היו מספרים כרומוזומליות נורמליות של 23 זוגות (איור 2 ג). באופן כללי, עם זאת, צפינו כישלון של הפרדה כרומוזומלית, וכתוצאה מכך 46 זוגות של כרומוזומים בדגימות DPKD במקום 23 זוגות (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים זרימה SKY פרוטוקול. תרשים זרימה של פרוטוקול SKY מדגים צעדים כדי להשלים את הניסוי החל טיפול מקדים התא ההכנות metaphase לרכישת התמונה וניתוח. ציר הזמן המשוער של שבוע מוצג בצד שמאל עם צעד אחר צעד את התהליכים עבור כל יום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> איור 2. Karyotyping רפאים הנציח על שורות תאים של העכבר או מבודדים טרי תאים ראשוניים אדם. צבע ותמונות DAPI כפולות של כרומוזומים בודדים מוצגים לפני מיון כרומוזומלית. לאחר מיון, הכרומוזומים מופיעים בטבלה &quot;סיווג&quot;. תמונה) השמיים של התפשטות metaphase של העכבר סוג בטבע מכיל קריוטיפ תקין (40, XY). ב) </strong&gt; SKY תמונה של התפשטות metaphase Pkd1 מ - / -. העכבר מראה מספר כרומוזומים לא תקין (68 במקום 40) וכן מומים כרומוזום כגון מחיקות כרומוזומים (כרומוזום מס &#39;8) ו translocations כרומוזום (כרומוזומים 11 ו - # 19) ג) SKY תמונה של התפשטות metaphase מרקמת הדם של החולה לא ADPKD יש קריוטיפ תקין (46, XX). ד) תמונת השמיים של התפשטות metaphase מרקמת הדם של החולה ADPKD מכיל קריוטיפ תקין (92, XXXX). חלקים של הנתונים דווחו קודם לכן ולעשות בהם שימוש חוזר ברשות 14.

<ol>
	<li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes.">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li><li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes.">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li><li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+of+human,+mouse,+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research.">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms.">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 30, 349-363 (2001).</li><li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping.">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li><li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells.">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li><li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids.">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li><li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer.">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li><li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cytogenetics+revisited:+comparative+genomic+hybridization+and+spectral+karyotyping.">Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping.</a> Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li><li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells.">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li><li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1.">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation.">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה cytogenetics השתמשו בלימוד יצירות גנומית כרומוזומלית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, ואת גילוי של בדיקות אלה נרכשים דרך interferometer sagnac. תהליך SKY מלאה בדרך כלל לוקח בערך שבוע, והיא כוללת מספר שלבים עיקריים (איור 1). SKY משתמשת בפרוטוקול סטנדרטי, אשר תואר לראשונה על ידי פדייה, נאש ואח&#39; 3. פרוטוקול מאז מותאם על ידי מעבדות cytogenetics שונים, כולל שלנו. בין הצעדים המרכזיים בפרוטוקול, הכנה טובה metaphase איכות חשוב מאוד לקבל ניתוח SKY בהצלחה. לדוגמה, אם הכרומוזומים הציטופלסמה יש יותר מדי או אם השקופיות הם זקנים מדי, איכות התמונות יכול להיות בסכנה. כפי שניתן לראות בסרטון הסרט שלנו, התוכן של הציטופלסמה ניתן לזהות בקלות באמצעות ברזולוציה גבוהה של ההפרשבניגוד להפרעות מיקרוסקופיה טכניקה. בנוסף, הזמינות של פעיל התאים המתחלקים היא תנאי הכרחי ניתוח SKY, זה ניתן להתגבר על ידי טיפול colcemid זמן רב יותר או תוספת של גורמי גדילה אחרים לתאים. שיעור ההצלחה הכוללת של SKY תלויה במידה רבה את הכישורים והניסיון של המשתמש. SKY מציעה כלי חזק ואמין לניתוח כרומוזומליות, כולל שינויים מבניים כרומוזום אחד. בנוסף הסלולר polyploidy, SKY מציעה אפשרות ללמוד כרומוזום הוספות, מחיקות, כפילויות ו translocations. לדוגמה, SKY מאפשר זיהוי סטיות כרומוזומליות הרומן הנסתר וזיהוי של rearrangements מורכבות במהלך התפתחות סרטן והתקדמות 15. יתר על כן, SKY הוחל בתחום המחקר בתוך cytogenetics השוואתיים, החוקרת rearrangements כרומוזומליות במהלך האבולוציה 4. באמצעות טכניקה SKY, במעבדה שלנו הופך להיות הראשונה לזהות מומים כרומוזום בעכברים ובבני אדם עם מחלת כליות פוליציסטיות (איור 2). אין ספק שהשמיים יהיה מועיל אחרים מחלות רבות הקשורות בכרומוזומים. למעשה, אנו מציעים השמים יהיה גם שימושי בפתוגנזה cilia הקשור רבים, שם cilia הוכחו להסדיר את חלוקת התא 14. בגלל עכבר וחולדה הם במודלים של בעלי חיים חשוב ללמוד את המנגנון של המחלה ולבצע הערכה תפקודית in vivo, פיתוח של בדיקות עכבר וחולדה לניתוח SKY אפשרה karyotyping שגרתית של כרומוזומים עכבר וחולדה. נכון לעכשיו, SKY מוגבל ולכן ללימודים כרומוזומלית העכבר, החולדה האנושית. עם זאת, כמו מעבדות מחקר נוספות להשתמש מינים אחרים ללמוד יצירות הגנומי, זה הנראה לעין, כי יותר ציור כרומוזום בדיקות עבור אורגניזמים שונים בקרוב יהיה זמין מסחרית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech בע&quot;מ </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> העובר שור בסרום (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / סטרפטומיצין </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HCl </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> צבע SKY ערכת בדיקה (האדם) </td><td> Spectral Imaging יישומית </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> צבע SKY ערכת בדיקה (עכבר) </td><td> Spectral Imaging יישומית </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדנים מרוכזת איתור ערכת </td><td> Spectral Imaging יישומית </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> עכלן </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ml </td><td></td></tr><tr><td> 37% פורמלדהיד </td><td> Mallinckrodt בייקר </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> לפוראמיד </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> להכין ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ 24x60mm </td><td> VWR Vista חזון </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> גומי מלט </td><td> אלמר של (הפצה מסחרית מקומית) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ההכלאה / humidifiedchamber / מגש </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> לשים מגבות נייר רטובות בתחתית </td></tr><tr><td> ThermoCycler </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> רועד פלטפורמה / Orbital שאכר </td><td> Bellco ביוטכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אמבטיה / מים רועדת </td><td> דיוק מדעי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI קוביית המסנן </td><td> Chroma טכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY קוביית המסנן </td><td> Chroma טכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Spectral Imaging יישומית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תא הפוכה תרבות מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> Nikon TS100 Eclipse </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> אולימפוס </td><td> IX70 </td><td> 60x שמן </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

השיטה המקובלת לזהות ולסווג כרומוזומים בודדים תלוי בדגם פסים ייחודי של כל כרומוזום בעוד כמה מינים ספציפיים שאנו מנתחים 1, 2. זו טכניקה קלאסית פסים, לעומת זאת, אינה אמינה בזיהוי סטיות כרומוזומליות מורכבים, כגון אלה הקשורים בסרטן. כדי להתגבר על המגבלות של טכניקה פסים, Karyotyping ספקטרלית (SKY) הוא הציג לספק מידע אמין יותר על אי תקינות הכרומוזומים. SKY היא הקרינה ססגוניות in-situ הכלאה (דגים) טכניקה לזהות כרומוזומים metaphase עם מיקרוסקופ רפאים 3, 4. SKY הוכח להיות כלי רב ערך לניתוח cytogenetic של מגוון רחב של מומים כרומוזום הקשורים למספר רב של מחלות גנטיות ומחלות ממאירות 5, 6. SKY כרוכה בשימוש של בדיקות ה-DNA ססגוניות fluorescently שכותרתו שהוכנו oligonucle מנוונתprimers otide על ידי PCR. לכן, כל כרומוזום יש צבע ייחודי רפאים לאחר ההכלאה in-situ עם בדיקות, אשר שכותרתו דיפרנציאלי בתערובת של צבעי ניאון (Rhodamine, טקסס רד, Cy5, FITC ו Cy5.5). בדיקות המשמשות SKY מורכב של עד 55 בדיקות ספציפיות כרומוזום 7-10. הליך SKY כרוכה במספר שלבים (איור 1). SKY דורש זמינות של תאים עם מדד mitotic גבוהה מן הרקמות או חולה או דם. הכרומוזומים של תא בודד מתא בודד או העיקרי טרי או שורת תאים מפוזרים על שקופיות זכוכית. התפשטות זו כרומוזום מסומן עם שילוב שונה של צבעי ניאון ספציפיים עבור כל כרומוזום. בדיקה לאיתור ורכישת תמונה, מערכת דימות ספקטרלי מורכב interferometer sagnac ומצלמת CCD. זה מאפשר מדידה של ספקטרום האור הנראה הנפלט המדגם לרכוש תמונת רפאים הלוך ושובמ כרומוזומים בודדים. HiSKY, תוכנה להשתמש כדי לנתח את התוצאות של תמונות שנתפסו, מספק זיהוי קל של אנומליות כרומוזום. התוצאה הסופית היא metaphase ו סיווג קריוטיפ התמונה, שבה כל זוג כרומוזומים יש צבע מיוחד (איור 2). זה מאפשר זיהוי קל של זהויות כרומוזום translocations. לפרטים נוספים, בקר באתר יישומי הדמיה ספקטרלית ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY שימש לאחרונה לזיהוי ההפרדה פגמים כרומוזום הפרעות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית (ADPKD), מחלה גנטית המאופיינת בתפקוד ב cilia העיקרי 11-13. באמצעות טכניקה זו, הפגנו נוכחות של הפרדה כרומוזום נורמלי פגמים כרומוזומליים בחולים ADPKD ומודלים עכבר 14. ניתוחים נוספים באמצעות SKY לא רק מאפשר לנו לזהות את מספר הזהות ואת כרומוזומליות, אלא גם כדי לזהות במדויק סטיות כרומוזומליות מורכבים מאוד כגון מחיקות כרומוזום טרנסלוקציות (איור 2).

Watch this Scientific Journal Video about Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease at JoVE.com

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה מתקדמת cytogenetics לזהות סטיות כרומוזומליות גנומית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, המאפשרים סיווג של כרומוזומים כל. SKY יכול גם לזהות סטיות כרומוזום מורכבים ופגמים הפרדה בעכברים ובבני אדם עם מחלות שונות, לרבות מחלת כליות פוליציסטיות.

Karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

spectral-karyotyping-to-study-chromosome-abnormalities-humans-mice

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

38.2K Views.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה מתקדמת cytogenetics לזהות סטיות כרומוזומליות גנומית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, המאפשרים סיווג של כרומוזומים כל. SKY יכול גם לזהות סטיות כרומוזום מורכבים ופגמים הפרדה בעכברים ובבני אדם עם מחלות שונות, לרבות מחלת כליות פוליצי?...

Video: Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

השתלת אב עורקים בעכברי orthotopic לחקר מחלת כלי דם

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

Nephrectomy 5/6th בשילוב עם דיאטת מלח גבוהה ועיכוב תחמוצת החנקן synthase כדי לגרום למחלת כליות כרונית בחולדת לואיס

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

הערכה של תפקוד כלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

שימוש ב- MRI שדה Ultra-גבוה במודלים של מכרסמים קטנים של מחלת כליות פוליציסטיות ל<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור phenotyping ותרופות

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

סימטרי Bihemispheric לאחר מות מוח חיתוך לחקר בריא והגבלות מוח פתולוגיים בבני אדם

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

מודל כדי לדמות היפוקסיה משמעות קלינית בבני אדם

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

העברה של miRNA אקסוגני מסונתז באופן מלאכותי לחקות לכליה באמצעות ננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...