אנו מודים לד&quot;ר שירין Bonni למתן pSil-GFP מבנה, ד&quot;ר אלפר Uzun להמחשה של איור 1, ואת מתקן bioimaging לדוק עבור מיקרוסקופיה confocal. EMM נתמך על ידי פרס קריירה למדע רפואי Wellcome בורוז קרן, פרס חוקרים NARSAD יאנג, ו-NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01. SBL נתמך על ידי NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01, וקיבל תמיכה PHS NRSA 5T32MH019118-20.

1. הכנת פתרונות תרבות ותקשורת (לא וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר תמיסת מלח מאוזנת האנק של השלם (HBSS) המכיל HBSS 1x, 2.5 מ&quot;מ (Hepes pH7.4), 30 מ&quot;מ D-גלוקוז, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4 ו 4 מ&quot;מ NaHCO 3. להוסיף מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O). סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר, וחנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התרבות פרוסת בינוני באמצעות 35 מ&quot;ל בסל בינוני איגל התקשורת, 12.9 מ&quot;ל של HBSS מלא, 20 מ&quot;מ D-גלוקוז (1.35 מ&quot;ל של תמיסת M 1), 1 mM Glutamax (0.25 מ&quot;ל של תמיסת 200 מ&quot;מ), 0.5 מ&quot;ל של פניצילין סטרפטומיצין-100x המניות. סנן לעקר עם מסנן 0.2-מיקרומטר, ולאחר מכן להוסיף חום מומת סוס סרום לריכוז הסופי של 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון Laminin עובד על ידי הפיכת 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון Laminin המניה עם מים סטריליים deionized מזוקקים. הכן 100 aliquots μL ב 0.5 מ&quot;ל צינורות eppendorf ולהקפיא ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פולי-L-ליזין עובד כל כךlution ידי הוספת 5 מ&quot;ל סטרילי H 2 O ל 5 מ&quot;ג של פולי-L-ליזין לעשות 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל פתרון המניות. הכן 1 aliquots מ&quot;ל ו ההקפאה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הציפוי על ידי דילול 1 מ&quot;ל של פולי-L-ליזין 100 μL של laminin לנפח סופי של 12 מ&quot;ל עם מים סטריליים. להפוך את הפתרון הזה טריים בכל פעם. </li></ol> 2. הכנת הוספת פורסים Organotypic (לא וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי שש גם צלחות עם הוספת 1 לכל תרבות גם באמצעות מלקחיים סטריליות. הוסף 2 מ&quot;ל סטרילי DDH 2 O מתחת מוסיף תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של תמיסת ציפוי על גבי קרום נזהר שלא לנקב את קרום. דגירה לילה חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה ציפוי ולשטוף עם קרום סטריליים H 2 0 3 פעמים. בואו מוסיף יבש לפני השימוש. הוסף 1.8 מ&quot;ל של מדיום פרוסת תרבות מקום 37 ° C חממה. לעטוף את הצלחות בשימוש עם Parafilmוחנות ב 4 ° C עד 4 שבועות. </li></ol> 3. הכנות לקראת electroporation (לא וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בונה RNAi עבור electroporation. כפולות גדיל רנ&quot;א מוסיף חדים היו משובטים לתוך וקטור pSilencer. מכיל פלסמיד: 1) מקדם U6 שמניע את הדור גדיל RNA כפול, ו 2) קלטת ביטוי GFP מונע על ידי האמרגן CMV 8,9. פלסמיד זה תוארה קודם לכן על ידי קונישי ועמיתיו 9 ועוד 7,8. פלסמידים הם מטוהרים באמצעות ערכת maxi-Prep Qiagen, ולהשתמש בהם בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש DNA תוך הזרקת אותה, להכין את הצבע 0.5% במהירות פתרון ירוק ולהשתמש בו ב 1:20 עם ה-DNA להיות מוזרק (בדרך כלל 20 μL של ה-DNA עם μL 1 של ירוק מהיר). שאריות DNA מהיר צבע תערובת ירוקה ניתן לאחסן ב -20 ° C עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביתור השטח נקי, dissectiכלי נג ו כלי vibratome עם אתנול 70%. לצנן HBSS מושלמת כל כך קר קרח. צ&#39;יל vibratome כלי בידי אריזה קרח סביבו בתוך vibratome עם מעט מים לקירור מהיר. הכן 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose באמצעות HBSS שלמים. מיקרוגל דקות 1. הימנע מעל רותחים. לשמור על 42 מעלות צלזיוס waterbath עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation פרמטרים מוגדרים באופן הבא. עבור E15 השימוש העובר 35 V, 5 פעימות, 100 מרחק MS, MS 900 במרווחים בין הפולסים. בעלי חיים גדולים יותר, כדי להבטיח electroporation, השתמש מתח גבוה עד 50 V או להגדיל את מספר פעימות עד 8 פעימות. כדי למנוע נזק לרקמות אצל בעלי חיים צעירים יותר, השתמשו בפולסים או פחות או עד 2 קטניות מתח נמוך עד 25 ו &#39;פרמטרים אלה עשויים להיות מגוונים וקבע באופן אמפירי בהתאם לגיל של בעל החיים. </li></ol> 4. דיסקציה ו electroporation (וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר והרדמת חסד נשים בהריון, לנתח עוברים אל HBSS קרח שלמים. קהפרק אחד העובר בתוך שקי שליה האישיים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העובר ולנתק את הראש אחרי החוליה הראשונה. לשמור על HBSS קרח שלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקה, הצב את הראש על פיסת Parafilm על גבי צלחת פטרי. שימוש בהתאמה אישית המילטון במזרק (ראה לוח ט) להזרים כ 6-8 μL של ה-DNA: מהיר תערובת צבע ירוק דרך החדר השלישי כדי למלא את שני החדרים הצדדיים של שלפוחית ​​קליפת המוח. לחלופין, ניתן לעשות הזרקה ישירות לתוך החדר כל לרוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור electroporation vivo לשעבר, השתמש BTX-פינצטה אלקטרודות פלטינה. מניחים את האלקטרודה החיובית כלפי הצד של קליפת אתה רוצה electroporate העליון של הראש כלומר על קליפת המוח הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation, דגירה ראשי על קרח דק &#39;לפחות 5 לפני הניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוחות של HBSSby קרה כקרח עושה חתך קטן בצד של הראש לקלף את עור בצידי הראש. לאחר מכן, עםמלקחיים עדינים לקלף בעדינות והפיה מהמוח. הסר את המוח ללא פגע מן הגולגולת, נזהר שלא לפגוע בקליפה. </li></ol> 5. הטבעת ואת חתך של קליפת המוח Electroporated (וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose לתוך תבנית גדולה מונחת על קרח. תחתית התבנית יתחיל לגבש מהר יותר אשר ימנע מן המוח שוקע לתחתית של התבנית. בעדינות, להעביר את המוח עם מלקחיים יפים אחד אחד לאחר הסרת עודפי חיץ עם Kimwipe או נייר פילטר. השתמש עצה 10 pipet μL כדי לערבל את המוח בתוך התבנית על מנת להבטיח ממשק מרבי בין agarose ורקמות במוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המזרח המוח כדי לוודא שכל המוחות הם בכיוון זהה וברמה על אותו agarose. בואו agarose לחזק דקות בערך 5. השתמש דבק מלכד (דבק מטורף) לצרף את אבני agarose כך נורות חוש הריח הם בעמידה. לאחר אבני מחוברים, מיד מוסיפים אנילספירה HBSS קרים וקוצצים את agarose לעשות פרוסות בודדות בטוח מתקבלים על המוח כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את אבני, קבע מהירות של vibratome למהירות נמוכה (כ 1/2 לכל היותר) ולקבוע את תדירות הרטט להב על ההגדרה הגבוהה ביותר. צור -250 מיקרומטר פרוסות עבות העטרה. אחזור פרוסות בעזרת מרית בסדר כפוף ולהעבירם בארות רקמות עם מברשת או מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונה תרביות רקמה, להעביר את פרוסות לתוך מוסיף מצופים. הוספת 500 μL של התקשורת והתרבות פרוסה כדי להוסיף כל לעשות העברה קלה. עד 5 פרוסות יכול להיות ממוקם בכל הוספה. הסר מדיה עודף מהחלק העליון של הפרוסות ואת דגירה על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified. </li></ol> 6. תרבות וניתוח של פרוסות Organotypic (וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על פרוסות בריאים, מדיה טריים יש להוסיף לפחות פעם ביומיים מתחת קרום ידי החלפת מחצית התקשורת בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לנתח את פרוסות אחרי Dימים esired בתרבות, לתקן את הפרוסות הממברנה. לשטוף עם חיץ 1x מלוחים פוספט (PBS) ב 37 מעלות צלזיוס שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, לתקן עם Paraformaldehyde 4% (PFA) לילה ב 4 מעלות צלזיוס או שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות ניתן לנתח עם סמנים תאיים שונים או מוכתמים Hoechst לבד לדמיין תאים electroporated ולא electroporated. Permeabilize ולחסום פרוסות של 2 שעות בטמפרטורת החדר עם סרום עיזים 10%, טריטון 0.1% ב 1x PBS עם טלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם Hoechst עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר, לשטוף 3 פעמים עם 10 דקות 1x PBS פעם עם טלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעלות פרוסות לחתוך את הקרום עם אזמל, ולהשתמש מלקחיים עדינים להעביר את הקרום המכיל פרוסות זכוכית חלבית מחליק בתא מים. עד 5 פרוסות יכול להיות ממוקם בכל שקופית זכוכית. הסרה של עודפי מים, ולהוסיף טיפה של פתרון Flourmount על כל פרוסה המוח. בעדינות להניח coverslip על גבי פרוסות המוח ולהסירy בועות אוויר. ניתוח פרוסות באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li></ol> 7. פרפין הטבעת אלטרנטיבית של פרוסות Organotypic (לא וידאו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות Organotypic יכול גם להיות מוטבע על פרפין לניתוח עדין מורפולוגי, לשם כך הקרום המכיל את פרוסות organotypic יכול להיות קבוע ב 4% PFA כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרוסות קבועים המוטבעים 1% agarose (לפני לחמם 37 ° C), ביסוס בקרח למשך 30 דקות. אבני agarose אז יכול להיות שלאחר קבוע PFA 4% על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק agarose המכיל פרוסת organotypic לאחר מכן ניתן יהיה מוטבע פרפין ומעובד immunofluorescence כפי שתואר קודם לכן 10. </li></ol> 8. נציג תוצאות ייצוג שבתרשים של electroporation של קליפת התרבות Murine של פרוסות organotypic מוצג באיור 1. שיטה זו היא אסטרטגיה יעילה אונסיד הערכת תפקוד של גנים המעורבים בהתפתחות עצבית 11. בהתאם לכמות ה-DNA electroporated ואת השלב העוברי על electroporation, יעילות transfection ישתנו. פרוסות יתחיל להביע את ה-GFP לפחות 8 שעות לאחר electroporation ותאי יעבור את הרצף הרגיל של אירועים neurogenic (התפשטות, הגירה, והבחנה עצבית מוקדמת) בתרבות. תרשים 2 מציג פרוסת המוח electroporated כי הוא מביע ביקורת pSilencer-GFP וקטור ניתן לראות אבות נוירונים, הנוירונים נודדים נוירונים הבדיל ב פרוסה. פרוסות Organotypic ישמור המורפולוגיה שלהם כל עוד הם נשמרים בממשק התקשורת אוויר טוב על הקרומים וניתן להשתמש בו עד לפחות 5 ימים בתרבות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> באיור 1. איור של electroporation vivo לשעבר ואת פרוסת organotypicassay תרבות. E14.5 עוברים הם גזור החוצה, והזריקו בנפרד כדי להמחיש את האתר עם ​​הזרקת ה-DNA מעורבב עם צבע ירוק ומהירה. ה-DNA ניתן להזריק בשני החדרים הצדדיים כמו מתואר באיור או החדר השלישי כדי למלא את החדרים הצדדיים. לאחר ההזרקה, המוח הם electroporated electroporator עם גל מרובע, הצבת אלקטרודה חיובית בצד הרצוי של המוח. המוח המוטבעים 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose ו מחולק באמצעות vibratome. 250 פרוסות המוח מיקרומטר ממוקמות על 0.4 מיקרומטר מוסיף ותרבותיים עד שבוע. GFP ניתן לראות לאחר 8 שעות transfection הודעה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> איור 2. ניתוח של פרוסות המוח electroporated. פרוסות המוח Electroporated הוכתמו על Hoescht. קליפת המוח הגב מראה אבות עצביים electroporated על אזור חדרית (VZ). נוירונים קורטיקאל צלחת (CP) הם תחום אזור שוליים (MZ). חיצים לבנים מראים נוירונים נודדים. במקרה זה, המוח הוזרקו ב E15.5 ו electroporated עם וקטור בקרת pSilencer GFP. קטעים מייצגים explants קורטיקליים 4 ימים לאחר electroporation. בר בהיקף 100 מיקרומטר. פתרון בעיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יעילות נמוכה transfection: התאם את הריכוז של ה-DNA משמש מיקרוגרם לפחות 1 / μL. השתמש תמיד ב-DNA נקי מאוד הכנה מקסי אם השימוש צורך אנדו ללא Quiagen ערכת לטהר את ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים transfected באזור המוח שונה מהרצוי 1: ודא אלקטרודות ממוקמים בצורה נכונה עם מיקום האלקטרודה החיובית כלפי צד של המוח לקבל electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות Organotypic לאבד את המורפולוגיה: התקשורת שנה כל יום ולהבטיח הפרוסות לא צף בתקשורת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות יורד agarose כפי שהם נמצאים לחתוך vibratome: ודא כי ממשק טוב הוא עשה כאשר הטבעה במוחם של היתוך נמוכה נקודת agarose. </li></ol>

<ol>
	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

שיטות אלה מעורבים electroporation vivo לשעבר של פלסמידים קידוד כפולה גדילי RNA סיכות ראש 8 והתרבות של פרוסות organotypic 4 מספקים מספר יתרונות בולטים. ראשית, שיטות אלו מאפשרים הערכה מהירה של RNAi הנגזרות פנוטיפים. הכללתו של ה-GFP קלטת קידוד ביטוי וקטור pSilencer אותו המכיל מק?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> המילטון המזרק </td><td> המילטון </td><td> 80008 </td><td> 31 מד, 0.5 סנטימטרים, PT-4 (רמת beveling נקודה), נפח 10μl </td></tr><tr><td> פלטינום tweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> 5 מ&quot;מ גודל </td></tr><tr><td> ECM830 electroporator </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Footswitch </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> לשימוש עם electroporator ECM830 </td></tr><tr><td> רוטט microtome להב </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - מנה גם להשתמש עם מוסיף </td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td> מכיל חריצים כדי להתאים מוסיף </td></tr><tr><td> תרביות רקמה מוסיף </td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0.4 מיקרומטר </TD&gt; </tr><tr><td> מהיר גרין </td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> התכה נמוכה agarose </td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> ה-DNA כיתה </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> מדיום הבסיס Eagle </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> 10x ללא Ca ו Mg HBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES ללא חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

קליפת המוח מכוון את התפקודים הקוגניטיביים. מבנה זה 6 שכבות נוצרת באופן בפנים ואחת בחוץ, האחרון, שבו הנוירונים הראשונים שנולדו להישאר קרוב יותר החדר ואילו נוירונים שנולדו האחרונות להעביר בעבר הנוירונים שנולדו הראשונים לקראת פני השטח של המוח 1. בנוסף העברה עצבית 2, תהליך מפתח לתפקוד קליפת המוח הנורמלי הוא הסדרת המורפוגנזה עצבית 3. בעוד המורפוגנזה עצבי ניתן ללמוד במבחנה בתרבויות העיקריות, יש הרבה מה ללמוד מהדרך שבה תהליכים אלה מוסדרים בסביבות רקמות. אנו מתארים טכניקות לניתוח ההגירה העצבית ו / או המורפוגנזה של פרוסות organotypic של קליפת המוח 4,6. וקטור pSilencer שונה משמש המכיל גם מקדם U6 שמניע את RNA כפולים חדים תקועים ואת קלטת ביטוי נפרד המקודד חלבון ה-GFP מונע ביה CMV האמרגן 7-9. הגישה שלנו מאפשר הערכה מהירה של ליקויים תוצאה neurite על מציאה מסוים של גנים מועמדים ונעשה בו שימוש בהצלחה המסך של הרגולטורים של תוצאה neurite 8. כי רק קבוצת משנה של תאים יביע המבנים RNAi, את פרוסות organotypic לאפשר ניתוח פסיפס של פנוטיפים פוטנציאליים. יתר על כן, כי ניתוח זה נעשה אומדן של קרוב בסביבה vivo, הוא מספק עלות נמוכה אלטרנטיבה מהירה לדור של בעלי חיים מהונדס או נוק אאוט לגנים של תפקוד קליפת המוח ידוע. לבסוף, בהשוואה בטכנולוגיה electroporation vivo, את ההצלחה של הניסויים electroporation לשעבר ב vivo אינה תלויה בפיתוח ניתוח מיומן מיומנות ניתן לבצע עם זמן אימון קצר ומיומנות.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex at JoVE.com

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות הקשורות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; Electroporation של פלסמידים שיתוף להביע RNA מעכבות (RNAi) ו-GFP בקליפת המוח העוברי murine. פרוטוקול זה הוא מקובל בחקר היבטים שונים של neurodevelopment כגון neurogenesis, העברה עצבית ו המורפוגנזה העצבית כולל דנדריט ו תוצאה האקסון.

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

methods-for-study-neuronal-morphogenesis-ex-vivo-rnai-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

11.7K Views.  Brown University. לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות הקשורות לשעבר vivo Electroporation של פלסמידים שיתוף להביע RNA מעכבות (RNAi) ו-GFP בקליפת המוח העוברי murine. פרוטוקול זה הוא מקובל בחקר היבטים שונים של neurodevelopment כגון neurogenesis, העברה עצבית ו המורפוג?...

Video: Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...