אנחנו מודים N. Schwedhelm-Domeyer לקבלת סיוע טכני מעולה, ג האמר וש &#39;פאפיול לעזרה בניתוחים סטטיסטיים. העבודה שלנו ממומנת על ידי אגודת מקס פלנק, Forschungsgemeinschaft דויטשה, מרכז ננו מיקרוסקופית, מולקולרי ופיזיולוגיה של המוח (CNMPB), גטינגן, גרמניה ועל ידי ג &#39;וניור קבוצת מלגת GGNB של אוניברסיטת גטינגן.

ניתן להכין CGNs או מיום לידה (P) 5 גורי עכבר או גורי החולדה P6. אנחנו עוקבים אחרי פרוטוקול, שתואר על ידי Bilimoria ועמיתיו, אשר עושה שימוש במעכבי mitotic כדי לבחור עבור CGNs postmitotic 13. שמירה על אתיקה: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים שנערכו על פי הפרוטוקול שאושר על ידי בעלי החיים את &quot;Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit &#39;של סקסוניה התחתונה שבגרמניה. ב assay חוץ גופית: 1. הכנה של ה-DNA פלסמיד, מדיה, וחוצצים לסידן פוספט Transfection השיטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פלסמיד דנ&quot;א במים סטריליים, ללא רעלן פנימי; DMEM (גלוקוז גבוהה); להפוך 2.5 M CaCl 2; להפוך 2x HBSS (לפזר 4 גרם NaCl, 0.1775 גרם KCl, 0.095 גרם Na 2 • 7H 2 O, גלוקוז 0.675 גרם 4 HPO ו2.5 HEPES גרם ב250 מים ultrapure מ&quot;ל וכדי להתאים את pH 7.05, 7.08, ו7.11). שים לב: בעת הכנהפתרון 2x HBSS, הבדיקה שpH נותן תוצאות הטובות ביותר לגבי יעילות transfection של שילוב נתון של פלסמידים. </li></ol> 2. Transfection של תרבית נוירונים <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של במבחנה האקסון וassay צמיחת דנדריט. התרבותי CGNs (24 גם צלחת עם coverslips זכוכית), מבודדת מגורי החולדה P6, הם transfected בDIV 0 או 1 עם משקע DNA המכיל סמן פלואורסצנטי transfection (למשל GFP). לאחר הקיבוע וimmunocytochemistry, הנוירונים הם צילמו באופן עיוור. תמונות מיובאות לImageJ ותהליכים נמדדים. לאחר מכן מדידות מעובדות באמצעות תכנית סטטיסטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CGNs זרע (20 x 10 6 לכל צלחת 24 גם; BME, 10% נסיוב עגל, 2 מ&quot;מ פניצילין-Streptomycin-גלוטמין (PSG), 25 מ&quot;מ KCl) ב, coverslips חנקן שטף חומצה מצופה polyornithine 12 מ&quot;מ הזכוכית בצלחת 24 גם עם 500 μl של תקשורת בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום במבחנה (DIV) 0 (לפחות 8 שעות לאחר ציפוי) או DIV 1, לאסוף תקשורת צמיחה ולשמור על 37 ° C. שטוף פעמיים עם תאי עצב 500 μl של DMEM prewarmed ולהוסיף 500 μl של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים מקום חממה (37 ° C CO, 2 5%) ל45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 משקע DNA μl לכל אחד גם על ידי ערבוב: ה-DNA (2-2.5 מיקרוגרם / טוב, 10% של ה-DNA בסך הכל צריך להיות למשל סמן transfection GFP לדמיין נוירונים transfected), מים (עד 18 μl), להוסיף 2 μl של 2.5 M CaCl 2, לערבב היטב ולהוסיף 20 μl של 2x HBSS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה משקע DNA במשך 5 דקות ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת משקע ה-DNA לכל היטב דגירה נוירונים ל18 דקות בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תמהיל DMEM / DNA ולשטוף נוירונים פעמיים עם 500 μl של DM prewarmedEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה שנאספו מהשלב 2.2 בחזרה לתאי עצב. אם הנוירונים יהיו בתרבות במשך יותר מ 3 ימים, מדיה תוסף עם 25 גלוקוז מ&quot;מ בDIV 3 כדי לחדש את מקור פחמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 1-5 ימים, הנוירונים בכפוף לimmunocytochemistry באמצעות נוגדני ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות תמונה 30 נוירונים בודדים לכל מצב בצורה עיוורה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 3. מדדו אקסונים ודנדריטים עם NeuronJ, NIH ImageJ תוסף חשוב: ודא כי תמונות הם מדורגים correctluy באמצעות פיקסל מתאים: יחס מיקרומטר בהתאם להגדלה ורזולוציה של תמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונות ל8-bit עם ImageJ: תמונה פתוחה, בחר &#39;תמונה&#39; -&gt; &#39;סוג&#39; -&gt; &#39;8 סיביות&#39; -&gt; &#39;התמונה&#39; השמורה &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תוסף NeuronJ ולפתוח את התמונה של 8 ביט. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot1.jpg" width="500px" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות &#39;ההעתקים הוסף&#39; כדי לעקוב אחר האקסון: CLאיכס לחצן העכבר השמאלי פעם אחת בתחילתו של האקסון ולהזיז את העכבר לאורך התהליך. לחץ לחיצה כפולה על קצה האקסון אם עקבות תואמת לצורת עצב. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot2.jpg" width="500px" /> הערה: במידה והעקבות הציעו שונות מצורת אקסון, לחץ פעם אחת על תהליך אקסון לעגן עקבות, ולאחר מכן לחץ לחיצה כפולה על קצה האקסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;העתקי מדוד&#39;, בחר &#39;תצוגת התחקות מדידות &quot;אפשרות ולחץ על&#39; הפעל &#39;. כל מדידות אקסון מוצגות בחלון חדש. לדנדריטים, לבחור את &#39;האופציה מדידות קבוצת המדיה&#39; ולחץ על &#39;הפעל&#39;. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot3.jpg" width="500px" /> כל מדידות דנדריט סך הכל מוצגות בחלון חדש. לשמור אותם כקובץ נפרד שניתן לפתוח בכל תוכנת גיליונות אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין לאיתור ידני, להשתמש בתוכנת פיג&#39;י: לחץ לחיצה ימנית על הדואר אפשרות &#39;קו ישר&#39;, בחר &#39;קו פריהנד&#39;, <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot4.jpg" width="500px" /> לשמור על לחצן העכבר השמאלי לחוץ ולעקוב אחר התהליך באופן ידני, לחץ על Ctrl + M &#39;למדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אורך ממוצע אקסון / דנדריטים לכל מצב ולהשתמש במבחן סטטיסטי מתאים. ב electroporation vivo: </li></ol> 1. ציוד והכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה צריך 30 מחטי G, spacer (1-2 מ&quot;מ), מזרק, מפחית מת נפח (DVR), electroporator, וtweezertrodes, כרית חימום או מנורת חום אינפרא אדום, מנורת השולחן מתכווננת וisoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים DVR למחט, לאחר מכן לצרף מחט מזרק, וסוף סוף לשים spacer אל מחט (איור 2). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2.jpg" /> דמות<html> 2. הכנה של המחט. DVR מנותק קצה פיפטה 200 μl והניחה לתוך המחט כדי להפחית את הנפח המת. Spacer נגזר מקצה 200 טעינת μl והוא ממוקם בקצה של המחט לווסת את עומק החדירה למוח הקטן לכ -2 מ&quot;מ. יחידות שליט: סנטימטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר DNA בPBS/0.03% ירוקים מהיר. הערה: כסמן transfection, זה יתרון להשתמש בחלבון פלואורסצנטי כי הוא תחת אמרגן נוירון הספציפי (למשל synapsin) כדי להמחיש נוירונים בלבד. 25% מהסכום הכולל של פלסמיד צריכים להיות קידוד פלסמיד סמן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמויות שווה של אוקטובר וסוכרוז 30% מומסים ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק עם 4 μl של ה-DNA (4 מיקרוגרם / μl של ה-DNA פלסמיד בPBS/0.03% גרין המהיר). </li></ol> 2. IVE של גורי חולדה תרשים זרימה של IVE: ראה איור 3 עמודים = &quot;כל זמן&quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3.jpg" /> איור 3. תרשים זרימה של בvivo electroporation. גורי החולדה P4 הם מורדמים בIsoflurane ופלסמיד דנ&quot;א קידוד סמן פלואורסצנטי transfection (למשל GFP) מוזרק לתוך המוח הקטן, ואחרי חשיפה ל -5 פולסים חשמליים. חמישה ימים לאחר מכן, cerebella GFP החיובי מבודד הם מחולק ונתון אימונוהיסטוכימיה. תמונות נלכדות באמצעות מיקרוסקופ confocal ונותחו באמצעות תוכנת Imaris. הנתונים מעובדים באמצעות תוכנה סטטיסטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גורי חולדה P4 מזן לבקן (Wistar או הארוך אוונס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי גורים (אחד אחרי השני) עם isoflurane בתיבה קטנה (לדוגמא תיבת קצה פיפטה P1000) עם 200 μl של isoflurane (שהושר ברקמה) עבור 1-2 דקות עד שגור הוא כבר לא זז. תשמור על עצמך שגורים לא נכנסים לקשר wה-i Iiquid isoflurane. לפקח באופן הדוק זמן כגורי אדם מגיבים באופן שונה להרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקרו אחורי של ראשו של הגור עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את ראש הגור בין האגודל ואצבע ולהשתמש במנורת שולחן מתכווננת לאתר את המוח הקטן של גור לבקן. הסינוס הרוחבי חד תוחם את המוח התיכון (colliculus העליון והנחותים) מההמיספרות בקליפת המוח (איור 3). המוח הקטן ממוקם בצמוד למוח תיכון ומופיע בגוון כהה יותר. השתמש בטוש בלתי מחיק, כדי לציין את המוח הקטן עם נקודה. חשוב: שמור על גור בתנוחה קבועה! הערה: צריכה הרדמה להתפוגג במהלך הליך זה, לחשוף את הגור לIsoflurane לפני הזרקת ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכניס מחט (איור 3) ולאט להזריק 3 μl של ה-DNA לתוך המוח הקטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן פתרון ה-DNA מפוזר ל30-60 sec. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ראשו של גור בין tweezertrodes כך שקוטב מינוס יוצר קשר עם החלק האחורי של הראש (cerebellaאזור r), וכי קשר המוט ועוד בצד השני של הראש (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גור בכפוף ל5 פולסים חשמליים. התאם מתח למשקל של גורים על מנת להבטיח יעילות electroporation טובה מבלי להתפשר על ההישרדות שלהם (טבלת 1). <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> משקל </td><td> מתח </td><td> דופק </td><td> הפסקה </td></tr><tr><td> 8-9 גרם </td><td> 160 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 msec </td></tr><tr><td> 9-10 גרם </td><td> 165 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 msec </td></tr><tr><td> &gt; 10 גרם </td><td> 170 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 msec </td></tr></tbody></table> טבלת 1. Electroporation של גורי חולדה P4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו גורים להתאושש על כרית מחוממת או מתחת מנורת אינפרא אדום. להחזיר גורים לסכר. חשוב: ודא שמקור חימום לא לגרום לכל כוויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב גורים 5 ימים לאחר electroporation ידי הצבת אותם בCO 2 ואחריו עריפת ראש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את cerebella ומסך לאלה GFP החיובי cerebella באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את cerebella ב% PFA 4 O / N ב 4 ° C, ואז דגירה בסוכרוז 30% על 4 מעלות צלזיוס עד כיור cerebella לתחתית צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע cerebella בסוכרוז OCT/30% ולקצץ 40 מיקרומטר סעיפי העטרה באמצעות cryostat. הערה: סעיף זה המוח הקטן באופן עיוור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים בכפוף לאימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדני ה-GFP. Counterstain עם צבע גרעיני (DAPI או Hoechst 33258) ולקבוע את הלוקליזציה של לפחות 200 נוירונים transfected לכל בעל חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח מעמיק, לחלק את IGL לחצאים, וכתוצאה מכך IGL העליון מול ML וIGL נמוך מול החומר הלבן ולספור נוירונים GFP חיובי המתגוררים בכל מחצית. הערה: ספירת תאי עצב GFP החיובי של כל סעיף באופן עיוור. </li&gt; </ol> 3. מדידת אורך דנדריט, רוכשת את תמונות של סעיף ב x, y, z מטוס באמצעות מיקרוסקופ confocal הערה: לדוגמא, השתמש 40 תמונות לסעיף 40 מיקרומטר עם z-stwp של 1 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרה פתוחה תמונה בתוכנה, Imaris, כדי ליצור תמונת 3D של דנדריטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על מצב &quot;לעלות&quot; כדי להציג נוירון ב-3D. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot5.jpg" width="500px" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &#39;הוסף נימה חדשה&#39; ולחץ על &quot;דלג יצירה אוטומטית &#39;כדי להתחיל מעקב חצי אוטומטי. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot6.jpg" width="500px" /> הערה: לנתח כל תמונת 3D בצורה עיוורה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &#39;צייר&#39; ו &#39;AutoPath&#39;. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot7.jpg" width="500px" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את סמן העכבר על גגוף ell וShift + עכבר ימני לחצו כדי לבחור את הגוף של התאים. הערה: Autocalculation ידי תוכנה עשויה לדרוש כמה דקות. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot8.jpg" width="500px" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נתיבים לחוט הלהט (דנדריט) בעזרת Shift + לחיצת עכבר שמאלית. הערה: ניתן דמיינו נתיבים בזמן אמת. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot9.jpg" width="500px" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לחלון סטטיסטיקת נימה ולחץ על &#39;ערכים ספציפיים&#39; מפורטים &#39;ו&#39; אורך חוט להט דנדריט (סכום) &#39;לסכום בסך הכל אורך דנדריט. <img alt="צילום מסך" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot10.jpg" width="500px" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במבחנים סטטיסטיים מתאימים כדי לנתח את הנתונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography.">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).</li><li>Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+cerebellar+cell+specification+and+differentiation.">Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).</li><li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum.">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li><li>Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+molecular+codes,+and+circuitry+produce+the+three-dimensional+complexity+of+the+cerebellum.">Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum.</a> Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li><li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development.">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li><li>Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+phases+of+migration+of+cerebellar+granule+cells+guided+by+axonal+and+dendritic+leading+processes.">Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes.</a> Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).</li><li>Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+neuroscience.">Cellular and molecular neuroscience.</a> , 419-41 .</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultures+of+cerebellar+granule+neurons.">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Rivas, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+and+cytoskeletal+organization+of+migrating+cerebellar+granule+neurons.">Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons.</a> J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).</li><li>Kuhar, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+patterns+of+gene+expression+define+four+stages+of+cerebellar+granule+neuron+differentiation.">Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation.</a> Development. 117, 97-104 (1993).</li><li>Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+target+neurons+provide+a+stop+signal+for+afferent+neurite+extension+in+vitro.">Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro.</a> J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).</li><li>Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+and+fasciculation+linked+to+differential+expression+of+BDNF+and+NT3+receptors+in+developing+cerebellar+granule+cells.">Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells.</a> J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).</li><li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+kainate+receptor+phenotypes+in+immature+and+mature+mouse+cerebellar+granule+cells.">Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells.</a> Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).</li><li>Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain).">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain).</a> Science. 303, 1026-1030 (2004).</li><li>Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta-Smad2+signaling+regulates+the+Cdh1-APC/SnoN+pathway+of+axonal+morphogenesis.">TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis.</a> J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).</li><li>Stegmuller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-400 (2006).</li><li>Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p250GAP+is+a+novel+player+in+the+Cdh1-APC/Smurf1+pathway+of+axon+growth+regulation.">p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3+ligase+Cdh1-anaphase+promoting+complex+operates+upstream+of+the+E3+ligase+Smurf1+in+the+control+of+axon+growth.">The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth.</a> Development. 139, 3600-3612 (2012).</li><li>Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII-NeuroD+Signaling+Pathway+Specifies+Dendritic+Morphogenesis.">CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis.</a> Neuron. 41, 229-241 (2004).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cdc20-APC+ubiquitin+signaling+pathway+regulates+presynaptic+differentiation.">A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation.</a> Science. 326, 575-578 (2009).</li><li>Litterman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+OBSL1-Cul7Fbxw8+ubiquitin+ligase+signaling+mechanism+regulates+Golgi+morphology+and+dendrite+patterning.">An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning.</a> PLoS Biol. 9, (2011).</li><li>Kim, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+Cdc20-APC+pathway+controls+dendrite+morphogenesis+in+postmitotic+neurons.">A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons.</a> Cell. 136, 322-336 (2009).</li><li>Shalizi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-regulated+MEF2+sumoylation+switch+controls+postsynaptic+differentiation.">A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation.</a> Science. 311, 1012-1017 (2006).</li><li>Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Centrosomal+E3+Ubiquitin+Ligase+FBXO31-SCF+Regulates+Neuronal+Morphogenesis+and+Migration.">The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKIIbeta+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nat. Neurosci. , (2011).</li><li>Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC+channels+promote+cerebellar+granule+neuron+survival.">TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival.</a> Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).</li><li>Huynh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isoform-specific+SnoN1-FOXO1+repressor+complex+controls+neuronal+morphogenesis+and+positioning+in+the+mammalian+brain.">An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain.</a> Neuron. 69, 930-944 (2011).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+neuronal+polarity+and+morphogenesis+in+the+mammalian+brain.">Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain.</a> Neuron. 72, 22-40 (2011).</li><li>Calissano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+insulin-like+growth+factor+I+exerts+a+trophic+action+and+confers+glutamate+sensitivity+on+glutamate-resistant+cerebellar+granule+cells.">Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

יתרונות ומגבלות של תאר במבחנה בשיטות vivo: CGNs תרבית מעכבר והחולדות מתאימים באותה מידה גם עבור ניתוחים מורפולוגיים. בשל הגודל גדול יותר של המוח הקטן עכברוש, התשואה של CNGs מגורי חולדה עולה על זו של גורי עכבר 3-4x. מלבד CGNs, ניתן להשתמש בנוירונים בקליפת המוח והיפוקמפוס כמערכת תרבות גם כן. שיטת פוספט סידן גורמת ליעילות נמוכה (.01-5%) transfection, אשר הוא רצויה לנתח את המורפולוגיה של תאי עצב בודדים. ניתן להשתמש בשיטות transfection lipophilic אלטרנטיבית גם כן, אבל הם יקרים מדי ללא רווח נוסף. יש להימנע שיטות transfection ויראלי של תרבויות בצפיפות גבוהה כגון CGNs כיעילות גבוהה תקשה מאוד להבחין תהליכים בודדים. בCGNs, אנחנו בדרך כלל למצוא מתאם של יעילות transfection וימים במבחנה. עוד נוירונים היו תרבותיים, מושפע פחות הם יהיו בלחץ-Induced transfection. כתוצאה מכך את יעילות transfection תהיה לעלות. כמו כן, להתמקד במנגנונים פנימיים של צמיחת האקסון ואינה כולל את השפעתם של גורמי גדילה שמקורם בסרום הווה בתקשורת, יכול להיות מתורבת CGNs בתקשורת הישרדות בתוספת אינסולין, פונדקאית זול לגורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1 ), אשר מקדם את ההישרדות עצבית 35. שינוי תקשורת מתקשורת מלאה לתקשורת המכיל אינסולין חייב להתרחש גם בDIV 0 או 1 DIV כדי למנוע סרום / אפופטוזיס KCl--Induced נסיגה. הניתוח של צמיחת דנדריט יכול להתבצע מקביל לassay צמיחת האקסון. חשוב עם זאת כדי לשמור על CGNs בתקשורת בתוספת KCl כדי לדמות פעילות נוירונים, המקדמת פיתוח הדנדריטים. ניתוח של נדידת נוירונים צריך להתבצע באמצעות טכניקת in vivo electroporation. Transfection של נוירונים בתרבית בדרך כלל יהיה כרוךcotransfection של לפחות שני פלסמידים: קידוד פלסמיד סמן transfection, אשר יכול להיות קידוד פלסמיד לחלבון פלואורסצנטי (למשל GFP), או ב-Galactosidase, וגם RNAi או פלסמידים ביטוי יתר. כדי להבטיח את coexpression המוצלח של פלסמידים, הכמות המומלצת של סמן transfection צריכה להיות 10% מהסכום הכולל של ה-DNA (2-2.5 מיקרוגרם / היטב צלחת 24 היטב). הקמנו בעבר כי transfection של כמויות שווה של דנ&quot;א (GFP יחד עם DsRed) תוצאות בלמעלה מ 85% מתאי העצב coexpressing שני פלסמידים 22,24. צריך מציאה, ביטוי יתר או חשיפה למולקולות קטנות לגרום למוות של תאים עצביים, קידוד פלסמיד Bcl-XL ניתן cotransfected כדי להבטיח את הישרדות ללא תופעות עצביות על מורפולוגיה 20. Cotransfection של עד שלושה או ארבעה פלסמידים הוא גם לא בעייתי, וזה שימושי לבצע epistasis מנתח להקים מסלול ליניארי או סינרגיה של שני חלבונים בהאקסון או דנדריט Growth. כאן, ניתן cotransfected שני RNAi העצמאי או פלסמידים ביטוי יתר או שילוב של שניהם יחד עם סמן transfection. In vivo טכניקת electroporation היא שיטה אידיאלית לניתוח של העברה עצבית בפיתוח המוח הקטן קליפת המוח. זהו יתרון להשתמש גורים מזן לבקן, בהשוואה לזן עם גוון עור כהה. כמו כן, קל יותר לעבוד עם גורי חולדה בשל cerebella בגודל הגדול יותר שלהם. בידיים שלנו, כמעט כל cerebella הם GFP חיובי אך בדרגות שונות. יש המוח הקטן electroporated היטב נוירונים GFP חיובי רבים מאה, המוח הקטן קשה-transfected פחות מ 100. עם קצת תרגול, זה גם אפשרי להשתמש עכברים אם עכברים הטרנסגניים דרושים למחקר. שיטה זו היא מהירה יותר באופן משמעותי מהדור של עכברים הטרנסגניים, והיא מאפשרת לניתוח של תנאים שונים (אובדן של פונקציה, לזכות-of-פונקציה ופונקצית מבנה-ניתוחים). IVE לא require Stereotaxis, מנורת שולחן מתכווננת מספיק כדי לאתר את המוח הקטן של גור לבקן די שקוף. זה יהיה גם לקצר את זמן הליך לגור ובהרדמה קצרה עם די isoflurane. אולם זה דורש קצת תרגול כדי למקד את האזור הנכון ובכך להשתלט על הטכניקה. בעיות התפתחותיות הנגרמות על ידי מציאה או ביטוי יתר הן חסרות משמעות בשל המניפולציה הגנטית regionalized של המוח הקטן. זה מאפשר הניתוח של מנגנון פנימי כתוצאות electroporation בדפוס פסיפס של נוירונים גנטיים שונה המוטבעים בסביבה מסוג בר. החסרון הוא שהחולדות או עכברי electroporated לא יכולות להיות נתון למבחן התנהגותי עקב כמות הנמוכה של תאי עצב transfected. כדי להבטיח את coexpression של פלסמידים בנוירונים, אנו ממליצים cotransfection עם ה-GFP קידוד פלסמיד (או כל חלבון פלואורסצנטי אחר) מתחת לאמרגן נוירון הספציפי כדי למנוע את visualization של תאי גליה transfected. אפקטים שיגרמו להקטנה של אורך אקסון ניתן לאתר בקלות ונמדדו 24. לעומת זאת, מבחינה טכנית אי אפשר לכמת את ההשפעות ממריצות על אקסונים שלא ניתן לייחס כל האורכים שלהם. Defasciculation של סיבים מקבילים עם זאת הוא למדידה 20. אותו הדבר נכון גם להערכת אורך דנדריט ו23,24,30 נדידת נוירונים. אנחנו בדרך כלל לבצע את הניתוחים שלנו 5 ימים לאחר electroporation. זה כמובן אפשרי לבצע את הניתוח מוקדם יותר ומאוחר יותר. נקודת זמן מאוחרת יותר מומלצת לבחון את הקמתה של טפרים הדנדריטים 29, המייצגים את הקשר הסינפטי בין CGNs וסיבי אזובי. כדי לסיים את הניתוח, חשוב לבחור את המבחן הסטטיסטי המתאים. לשם כך, יש לקחת בחשבון אם הערכים של הקבוצות לעקוב אחר התפלגות נורמלית (למשל אקסון או אורכי דנדריטים), ואם 2 או מ &#39;בצר מ 2 קבוצות כלולים בניתוח. עבור 2 קבוצות, אנו משתמשים במבחן של הסטודנטים, ליותר מ -2 קבוצות ANOVA. צריכים לעקוב אחר ערכי הפצה הלא נורמלית (למשל הגירה למרחקים), מבחן מאן ויטני U ומבחן קרוסקל וואליס צריך לשמש עבור 2 או יותר מ -2 קבוצות, בהתאמה.

המוח הקטן הוא מערכת מצוינת ללמוד מנגנונים של צמיחת האקסון ונדידה. המוח הקטן כבר את הנושא של מחקרים אנטומיים משחר מדעי המוח 1. מיקרוסקופ מודרני וטכניקות immunohistochemical הרחיבו באופן משמעותי ומעודן תגליות הראשוניות על ידי סנטיאגו, רמון, וקחל 2-4. גנטיקה עכבר ומחקרים מולקולריים חשפו גורמי גדילה ושעתוק חיוניים בשליטה על התפתחות המוח הקטן, מה שהובילו להבנה טובה יותר של אירועים קריטיים דרושים לחיווט נכון סוגים שונים של תאי עצב, כולל נוירונים במוח קטנים גרגיר (CGNs) 5-7 של. המוח הקטן הוא נגזר של rhombomere 1 של המוח האחורי פיתוח 8. השפתיים rhombic, שהוא חלק מהגג של חדר 4 ה, מולידה אבות נוירון גרגר המוח הקטן, אשר יהוו את האוכלוסייה עצבית הרבות ביותר בהמוח הקטן בוגר 9. בעקבות הגירה מקורי, הם להתיישב בanlage המוח הקטן. הנה, מיטוזה של מבשרי נוירון הגרגר מובילה להתרחבות הדרמטית של השכבה החיצונית הפרטנית (EGL), המתרחש לאחר לידה במכרסמים. מEGL, הנוירונים להתחיל נודדים פנימה דרך השכבה המולקולרית (מ&quot;ל), בעבר בשכבת תא פורקינג&#39; סופו של דבר לקחת את מגוריו בשכבת גרגרים הפנימיים (IGL 2). במהלך תהליך נדידה זו, הם רוכשים צורה דו קוטבית עם שני אקסונים הארכה לML. על הגירה נוספת, גוף התא נודד הרחק מאקסונים ושני תהליכי הפתיל כדי ליצור האקסון אחד מפוצל, בצורת אות T 10. בהמשך לכך, אקסונים אלה fasciculate ומכונים סיבים במקביל כ. לאחר שהתיישב בIGL, CGNs לגדול דנדריטים, המהווים טפרים הדנדריטים להקים סינפסות עם סיבי אזובי. כדי לבחון תהליכים בסיסיים במוח הקטן מתפתח, בשילוב במבחנה בapproac vivoשעות מאפשרת לתוצאות ומסקנות אמינות. CGNs הם לא רק נוירונים הרבים ביותר של המוח הקטן, אלא של כל המוח ויכול להיות מתורבת לטוהר גבוה 11-13. בתרבות, אוכלוסייה עצבית הומוגנית מאוד זה הופך במהירות postmitotic ורוכשת מורפולוגיה קוטב עם אקסונים ודנדריטים לזיהוי בקלות. CGNs התרבית הוכיחו להיות מאוד שימושי כדי ללמוד היבטים שונים של התפתחות עצבית הכוללים ריבוי אב, בידול, אקסון ופיתוח דנדריט, נדידת נוירונים, אפופטוזיס ומאפייני אלקטרו (14-19 ועוד רבים אחרים). השימוש במניפולציה גנטית הרחיבה את הרבגוניות של CGNs התרבותי ואיפשר לתובנה מכניסטית נוסף לאירועים האמורים. Transfection של נוירונים בתרבית באמצעות סידן זרחה יעילות נמוכה או שיטות lipophilic אחרי immunocytochemistry עם סמני קוטביות או הוא מסייע ניתוח נתמך תוכנהtates ההערכה למשל המורפולוגיה של נוירונים בודדים בתרבות עצבית צפופה. עם גישה זו, תפקידם של חלבונים של עניין צמיחת האקסון או דנדריט ניתן ללמוד 20-25,26-28. מערכת תרבות אולם זה היא פחות שימושי לנתח נדידת נוירונים כהגירה היא מוגבלת מאוד בתרבויות בצפיפות גבוהה ותדרוש cocultures. הניתוח במבחנה של האקסון וצמיחת דנדריט גם מאפשר הבדיקה של חלבונים ביניהם של מסלול איתות באמצעות שילובים של התערבות RNA (i), על ביטוי או מולקולות קטנות. כדי לבסס את הרלוונטיות של החלבון של העניין בהאקסון ורגולציה צמיחת דנדריט או נדידת נוירונים, electroporation in vivo הטכניקה (IVE) מאפשר הניתוח בפיתוח המוח הקטן קליפת המוח. בשל העובדה שפיתוח המוח הקטן במכרסמים משתרע דרך כלשבועות לאחר הלידה הראשון, המוח הקטן מייצג accessibמבנה המוח le למניפולציות גנטיות כדי לבחון פיתוח אקסונים ודנדריטים, נדידת נוירונים, synaptogenesis ואפופטוזיס 20-24,29,30,26,27,31-34. בנוסף, מערכת מודל זה שימושי גם להיבטים אחרים של התפתחות עצבית הדורשים את קליפת המוח הקטן בשלמותה כגון pathfinding האקסון, חיווט וקישוריות של תאי עצב ונוירון, גליה אינטראקציות יחדיו, פרוטוקול זה מספק במבחנה בטכניקות vivo כדי להתמודד עם גישה משלימה לגבי המורפוגנזה ונדידת נוירונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="541">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">DMEM</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">11960-044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">BME</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">41010-026</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Insulin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Si-1-4011</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-2533</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:160px;">CaCl2</td>
			<td style="width:125px;">Appli-Chem</td>
			<td style="width:88px;">A3652</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:125px;">Actavis Deutschland</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Tissue-Tek OCT</td>
			<td style="width:125px;">Sakura</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:160px;">Material Name</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:168px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">ECM 830 and tweezertrodes</td>
			<td style="width:125px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:160px;">Epifluorescence microscope and camera</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:125px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">ImageJ</td>
			<td style="width:125px;">NIH</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Imaris 7.4.2</td>
			<td style="width:125px;">Bitplane, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:125px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">MS Excel</td>
			<td style="width:125px;">Microsoft</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Loading tip 1-200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">4853</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Pipette tip 200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:88px;">70.760.502</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Microlance 3 needle, 30 gauge</td>
			<td style="width:125px;">BD</td>
			<td style="width:88px;">302200</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">50 &#181;l gastight Syringe 1705</td>
			<td style="width:125px;">Hamilton</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Glass coverslips&#160;</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific Menzel Glaeser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration

אירועים התפתחותיים במוח כולל המורפוגנזה ונדידת נוירונים הם מתוזמרים מאוד תהליכים. במבחנה in vivo מנתחים לאפשר לאפיון מעמיק כדי לזהות מסלולים מעורבים באירועים אלו. נוירונים גרגיר cerebellar (CGNs) המופקים מהמוח הקטן מתפתח הם מערכת מודל אידיאלית המאפשרת לניתוחים מורפולוגיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד לתפעל גנטי CGNs ואיך ללמוד-axono וdendritogenesis של נוירונים בודדים. בשיטה זו ניתן להשוות את ההשפעות של התערבות RNA, ביטוי יתר או מולקולות קטנות כדי לשלוט בנוירונים. בנוסף, קליפת המוח הקטן המכרסם היא נגישה בקלות במערכת vivo בשל ההתפתחות לאחר הלידה הדומיננטית שלה. גם אנחנו מציגים את in vivo electroporation טכניקה כדי לתפעל גנטי cerebella לפתח ולתאר במוח קטן שלאחר מכן מנתח כדי להעריך מורפולוגיה עצביתnd הגירה.

<html> כדי לנתח את המורפולוגיה של CGNs בתגובה לתנאי culturing שונים, אנו transfected תאי העצב בDIV 0 כפי שתואר לעיל. לאחר transfection, אנו ממוקמים קבוצה אחת של תאי עצב לתוך מדיום מלא (BME, 10% נסיוב עגל, 2 מ&quot;מ PSG, 25 מ&quot;מ KCl) וקבוצה נוספת לאינסולין בינוני מכיל מינימאלי (BME, 25 גלוקוז מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ PSG, 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין). אנחנו חשופים לנוירונים immunocytochemistry באמצעות נוגדן ה-GFP ב1 DIV, 2, ו -3, ואחריו על ידי מדידת אקסונים ודנדריטים לסט 1 ואקסונים רק לקבוצה 2. בשל סרום וKCl, המספק גורמי גדילה ופעילות עצבית לחקות, בהתאמה, אקסונים ודנדריטים שפותח וגדל במהירות על פני חלון הזמן מצויינים (איור 4 א). צמיחת אקסון של קבוצה 2 הייתה בעיקר תוצאה של גירוי פנימי ובכך מופחתת בהרבה. דנדריטים זאת הצליחו להתפתח כראוי בשל חוסר בסרום וKCl, שיעודד צמיחת דנדריט (איור 4). s = &quot;jove_content &#39;עבור: לשמור-together.within-page =&#39; תמיד &#39;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח של האקסון ודנדריט צמיחה בCGNs (A, B) CGNs, transfected עם ה-GFP קידוד פלסמיד בDIV 0, היה בתרבית למשך 1, 2, או 3 ימים בכל מדיום מלא (), או BME בתוספת אינסולין (ב). לאחר קיבוע, נוירונים היו נתונים immunocytochemistry באמצעות נוגדן ה-GFP ואורכי האקסון ודנדריט נמדדו. כולל של 82 () ו65 הנוירונים (B) נמדדו (ANOVA, * p &lt;0.05, *** p &lt;0.001, אומר + SEM). חצים לבנים וראשי חץ צהובים מצביעים על האקסונים והדנדריטים, בהתאמה. סרגל קנה מידה שווה 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51070/51070fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. כדי לבצע ניתוח מורפולוגי של cerebella החולדה, אנו נתון גורי P4 לאייב כפי שתוארו לעיל ומבודד cerebella 5 ימים לאחר מכן. אימונוהיסטוכימיה של 40 מיקרומטר cryosections העטרה גילתה כי נוירונים GFP חיובי 86% ירדו מEGL לIGL (איור 5 א). בין אלה, 50% שנצפו בחלק העליון של EGL ו36% הגרו יותר אל תוך החלק התחתון של IGL. גם אנחנו נקבע דנדריט צמיחה של שלושה cerebella electroporated העצמאי ואורכים לעומת ממוצע (איור 5). <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig5.jpg" /> איור 5. ניתוח של העברה עצבית ואורך דנדריט בcerebella vivo electroporated. Cerebella שלגורי החולדה P4 היו electroporated עם פלסמיד pSyn-GFP ומבודד 5 ימים לאחר מכן. 40 מיקרומטר סעיפי העטרה היו נתונים לאימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדני ה-GFP. () לוקליזציה של CGNs במוח קטן הוערכה. (קרוסקל ווליס, תיקון מאן ויטני, * P &lt;0.05, *** P &lt;0.001) (ב) אורך דנדריט סה&quot;כ נמדד באמצעות תוכנת Imaris (ANOVA, תיקון Bonferroni, NS = לא משמעותי, אומר + SEM). חצים מצביעים על גופי תא CGN. ראשי חץ עולה דנדריטים. סרגל קנה מידה שווה 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51070/51070fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration at JoVE.com

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

genetic-manipulation-cerebellar-granule-neurons-vitro-vivo-to-study

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

13.6K Views.  Max Planck Institute of Experimental Medicine.  המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב. 

Video: Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...