עבודה זו מומנה על ידי NIH R01EY020560-01 ועל ידי חוקר WM Keck יאנג פרס למחקר רפואי. המחברים מבקשים להודות יוסף Bedont עזרתו במהלך הדמיה של ההכנות זריקות הרשתית.

1. הכנה פלסמיד עבור electroporation ריכוז ה-DNA הנדרש electroporation הוא 5μg/μl. זה בדרך כלל דורש פלסמידים הרצוי להיות מוגבר באמצעות מקסי-prep (Qiagen) או בשיטה שוות ערך ואחריו טיהור וריכוז הדנ&quot;א לכמות העבודה. השלבים הבאים מתארים את הכנת ה-DNA לכמות העבודה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 100 מיקרוגרם של ה-DNA (מ prep-מקסי או שווה ערך) לדלל את נפח μL 100 על מנת להקל על מניפולציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פנול; כמות של פנול יש לחשב להשיג 60 כ DNA / נפח% יחס (DNA מיקרוגרם: הנפח הכולל), דהיינו: 100 מיקרוגרם DNA (ב μL 100) בתוספת 67 μL פנול (100 מיקרוגרם: 167 μL). מערבבים היטב, אל פיפטה למעלה ולמטה מכיוון שהדבר עלול לגרום מריחה מוגזמת של ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ה-DNA במשך 5 דקות ב 14,000 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ולהוסיף כלורופורם באמצעות ה-DNA זהה: יחס הנפח הכולל בשלב 1.2, לערבב כמתואר ב 14,000 סל&quot;ד בשלב 1.2 ו - ספין במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant, להוסיף נפח supernatant 10% נתרן אצטט M 3 לפתרון ה-DNA, מערבבים בעדינות ומוסיפים 2.5 X נפח supernatant של אתנול 100%. מערבבים על ידי היפוך. ה-DNA צריך לזרז את הפתרון במהלך הערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ה-DNA על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 14,000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו עם 350 μl של אתנול 70%, ספין ב 14000 סל&quot;ד במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש גלולה ואז לפזר את ה-DNA 1 X PBS (ביולוגיה בכיתה נייד) כדי 5μg/μL. אל overdry מדגם כמו זה יקשה מאוד להתמוסס אל תוך PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מהיר צבע ירוק (10% מניות) לפתרון ה-DNA, את הריכוז הסופי של צבע היא 0.1%, לשמש נותב זריקה. </li></ol> 2. הזרקת Subretinal של דנ&quot;א השלבים הבאים מתבצעים בסיוע stereomicroscope. התאמן לאחר סיום תהליך של פתיחת העין, חתך, הזרקת לוקח פחות מ -1.5 דקות וזה לא מספיק זמן גור הרדים שצריך להתאושש. באמצעות מחט חדה של 30 מד, לפתוח בזהירות את העין על ידי חיתוך לאורך האפיתל junctional התמזגו (איור 1C). אין להפעיל כוח מוגזם כמו זה עלול לגרום חיתוך של העין הבסיסית. הימנע חיתוך מעבר לטווח של צומת העפעף כמו זה יגרום לדימום שיכול לטשטש את הזריקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים היילוד על קרח למשך מספר דקות (איור 1 א), לא לקבור את הגורים בקרח, זה עלול לגרום לתמותה. משך הזמן משתנה על הקרח מן הגור אל גור, בדרך כלל 5 דקות מספיקה אבל העכברים צריכים להיות במעקב צמוד כפרטים עלול להגיב מהר מאוד או עשוי לדרוש חשיפה ארוך יותר על מנת להבטיח הרדמה המתאים. התנהגות קמצוץ כפה עם hemostats כדי לבדוק רפלקס נסיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להקל על ההזרקה של ה-DNA למרחב subretinal העין חייב להיות הראשון נפתח. ספוגית העין להיות מוזרק עם 70% אלכוהול איזופרופיל הכנה (Tyco הבריאות) ולזהות את האפיתל junctional שבו התמזגו שני העפעפיים באים ביחד (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט חדה של 30 מד, לפתוח בזהירות את העין על ידי חיתוך לאורך האפיתל junctional התמזגו (איור 1C). אין להפעיל כוח מוגזם כמו זה עלול לגרום חיתוך של העין הבסיסית. הימנע חיתוך מעבר לטווח של צומת העפעף כמו זה יגרום לדימום שיכול לטשטש את הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על חדירה של העין על ידי מחט קהה הזרקת הסתיים להשתמש קצה מחט 30-guage לעשות חתך קטן בלובן העין סמוך לצומת עם הקרנית (איור 1E). לא לחדור עמוק מדי כי זה עלול לגרום לנקב של העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 0.3 μl של פתרון ה-DNA לתוך 33 מד בוטה מחט הזריקה הסתיים באמצעות הדרגתיים מזרק כדי למדוד את נפח בנפרד עבור כל הזרקה (מחט קוטר חיצוני 0.52 מ&quot;מ, קוטר פנימי 0.13 מ&quot;מ; Exmire microsyringe; איטו קורפ). הכנס את המחט לתוך החתך עד ההתנגדות של הקיר scleral מנוגדות מורגשת. להיזהר חודר את העדשה כמו את המחט עובר דרך תא vitreal (איור 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק 0.3 μl של פתרון ה-DNA לתוך החלל subretinal באמצעות האצבע או האגודל כדי לוחץ על המתג מזרק. הנסיין חייב להיות זהיר כדי לשלוט על מהירות של דיכאון הבוכנה כך את הקצב שבו הפתרון הדנ&quot;א מוזרק לתוך חלל subretinal לא לעבור את הקצב שבו הפתרון DNA מתפשט במרחב subretinal (איור 2C). פתרון ה-DNA הוא צמיג כל כך חשוב כי את המחט לא נלחץ חזק מדי על הקיר scleral מנוגדים כמו זה עלול לגרום הדנ&quot;א לא להיות מוזרק או לא מתפשט באופן שווה. זריקה מוצלחת תביא עודהתפשטות של פתרון ה-DNA חלק משטח subretinal. אזורים של הרשתית עם ובלי הבסיס נותב ירוק צריך להיות ברור מתי לסובב את החיה מוזרק. </li></ol> 3. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation מבוצעת באמצעות בקוטר 10 מ&quot;מ פינצטה אלקטרודה (דגם # 522; מכשירים BTX). משרים את האלקטרודה פינצטה ב PBS על מנת למקסם את המוליכות החשמלית של האלקטרודה לחיה מקום ראש הגור הזריק בין האלקטרודות בעין מוזרק הסמוכים אלקטרודה הקוטב החיובי וגם את העין הלא מוזרק סמוך לקוטב שלילי אלקטרודה (איור 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בחמש לחיצות מרובע באמצעות גנרטור הדופק: הדופק כל 80 וולט ו 50 אלפיות השנייה באורכה עם מרווח 950 אלפית השנייה בין הפולסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגורים electroporated כעת יש חימם עד שהם להתאושש מן ההרדמה את הקרח. ניתן לעשות זאת על ידי הצבת את הגורים מתחת לפנס ההתחממות או על גבי שקופית חם. אם באמצעות שקופיות חם להבטיח כי כרית מתאימה ממוקם בין משטח המתכת הגור מחלים. לאחר התאוששות להחזיר את הגורים electroporated לאמא שלהם. </li></ol> 4. הכנת עיניים לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעה של קצירת וניתוח של הרשתית electroporated מבוצע בכפוף מטרות הניסוי. ביטוי של GFP ניתן דמיינו גסה 3 ימים לאחר electroporation. עבור cryoembedding ואת חתך המשך כדלהלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן חיות electroporated ב timepoint הרצוי. Disect את העין electroporated ולתקן paraformaldehyde ב -4% ב -4 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את הרשתית של העין על ידי מיקרו לנתח משם את בלובן העין, הקרנית, העדשה, דמית העין ו אפיתל הפיגמנט ברשתית. הרשתיות גזור עשוי להיות מנותח תחת פלואורסצנטי גסה לקבוע את היעילות של electroporation. מעבירים את הרשתיות לפתרון סוכרוז 30% לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת הרשתיות לתוך אוקטובר cryo-הטמעת המדיה (סאקורה Finetek ארה&quot;ב) ולאחסן ב -80 ° C. הרשתיות יכול עכשיו להיות מחולק על cryotome וכבש על שקופיות הזכוכית. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמאות P0 הרשתיות בילוד electroporated עם הביטוי pCAG-EGFP פלסמיד מוצגים 3 ימים לאחר electroporation (P3) ו 14 הימים הבאים electroporation (P14) בתרשים 4. אזור של רקמת הרשתית electroporated משתנה מניסוי לניסוי, תלוי במידה של נזק לרקמות שנגרם במהלך ההזרקה ואת שויון התפשטותה של פתרון ה-DNA לתוך החלל subretinal. בדרך כלל 9-10% של הרשתית electroporated יכלול תאים שילבו בהצלחה והביע פלסמיד הציג. עם זאת, כאשר הפקטורינג מורפולוגיה רקמות יעילות electroporation רק 40-60% של הרשתית electroporated יהיה מתאים ניתוח השוואתי. היווצרות רוזט ועל ניתוק הרשתית באתר של חדירת המחט הוא כמעט תמיד ציין את האזור הזה לא אמור לשמש לניתוח. DNA בהצלחה להפיץ במהלך התוצאות microinjection ברקמות electroporated ביעילות לרוחב לאתר של חדירת מחט ללא רוזטות וניתוק. דבקת היא גם דאגה הניסוי חשוב וכמעט תמיד מתרחשת באתר של חדירת המחט. עם זאת, כמו היווצרות שושנת ועל ניתוק הרשתית, דבקת הוא בדרך כלל לא משמעותי ברקמת electroporated רוחבית. סמנים immunohistochemical כגון חלבון גליה חומצי fibrillary (GFAP) יכול להיות מנוצל כדי לקבוע אם רמות דבקת תגובתי באזורים ניתח בגדר סף מקובל. הרשתית מחולק הוכחת כי את המורפולוגיה של הרשתית electroporated נשאר שלם וכי תוויות EGFP ביטוי בתאים בודדים electroporated מוצגים. דוגמאות 3 ימים לאחר electroporation P0 (איור 4A-C) 14 ימים לאחר electroporation P0 (איור F-4D) מוצגים. ב הרשתיות P3 רוב התאים electroporated ממוקמות בשכבת neuroblastic (העל) של הרשתית, ולא להפגין מאפיינים מורפולוגיים ברורים של כל אחד תאים עצביים או גליה מובחן של הרשתית (איור 4 ב &#39;, ג&#39;). על ידי P14 תאים electroporated ניתן למצוא שכבת הגרעין החיצוני (ONL) לבין שכבת הגרעין הפנימית (INL) של הרשתית. יתר על כן התאים שכותרתו שונים עכשיו להציג סימני ההיכר המורפולוגיים האופייניים של נוירונים הבדיל כולל interneurons של INL, photoreceptors, ואת גליה מולר (איור 4E, F). <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. הרדמה של עכבר (P0) הגור הנולד ופתיחת עין הזרקת subretinal של פתרון ה-DNA. א) גור ילודים דגש עלמצע של קרח כתוש עבור הרדמה. Eye להיות מוזרק ממוקם מטה נגד הקרח. ב) המיקום של האפיתל junctional התמזגו (B, חץ) של העפעפיים כדי לגזור על פתיחת העין. ג) חיתוך של העפעפיים לאורך האפיתל junctional התמזגו (C, חץ) כדי לחשוף את העין. ד) עין שנפתחו בעקבות חיתוך בצומת התמזגו. E), מבצעים חתך מתחת לעין ב sclera מתחת הקרנית כדי להקל על הכניסה קלה של המזרק בוטה הסתיים מיקרו הזרקה. סולם ברים, B, C, D, E: 4 מ&quot;מ. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. החדרת הבוטה הסתיים הזרקת מיקרו מזרק זריקה של פתרון ה-DNA פלסמיד לחלל subretinal. א) סכמטית Cartoon הוכחת את הכניסה הנכונה של המזרק מיקרו הזרקה לתוך העין והתיישבות של קצה מזרק לחלל subretinal. הזרקה של פתרון ה-DNA לתוך תא זגוגי, מעבר של המזרק דרך עין לשקע, או הזרקה לתוך העדשה תגרום ניסויים נכשל עם כמה אם בכלל תאים electroporated. ב) חדירה של המזרק לתוך החתך עשוי בקיר ההתיישבות scleral של קצה מזרק לחלל subretinal. ג) הזרקה של פתרון ה-DNA לתוך החלל subretinal. סולם ברים, B, C: 4 מ&quot;מ. קיצורים כדלקמן: R-הרשתית, L-עדשה, V-זגוגי, SRS-subretinal בחלל, BES-בוטה הסתיים מזרק. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. אוריינטציה של האלקטרודה פינצטה על העכבר עבור electroporation. א) סכמטית Cartoon הוכחת את הכיוון של משוטים החיוביים והשליליים של האלקטרודה פינצטה יחסית העין electroporated. הירוק מייצג את המיקום של ה-DNA מוזרק אל תוך החלל subretinal. חיצים רצתי מייצגים את התנועה electrophoretic של דנ&quot;א מוזרק טעונים שלילית כלפי האלקטרודה החיובית. אלקטרופורזה הד.נ. א מתרחש מהחלל subretinal הסמוכים האלקטרודה השלילית לתוך הרשתית אשר מכוונת לעבר האלקטרודה החיובית. ב) ההנעה החיובית של פינצטה ממוקם בסמוך ל-DNA microinjected העין ואת ההנעה שלילי ממוקם סמוך לעין הלא מוזרק. ג) הגדלה של התמונה גבוהה פינצטה מיקום האלקטרודה על העכבר הילוד. כקווים מקווקווים מייצגים את כיוון התנועה של ה-DNA electrophoretic לעבר האלקטרודה החיובית. סרגל קנה מידה, C: 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. העכבר הרשתיות ילודים (P0) electroporated עם pCAG-EGFP ונותחו ביום הלידה 3 (P3) יום לאחר הלידה 14 (P14). AC) תמונות Confocal של הרשתית P3 מחולק electroporated עם pCAG EGFP ב-P0. רוב התאים electroporated לשבת בשכבה neuroblastic הרשתית (העל). (DF) תמונות Confocal של הרשתית P14 מחולק electroporated עם pCAG EGFP ב-P0. תאים Electroporated ניתן לזהות שכבת הגרעין החיצוני (ONL) לבין שכבת הגרעין הפנימית (INL) של הרשתית. סולם ברים, AF: 50 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Neumann, E., Rosenheck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+changes+induced+by+electric+impulses+in+vesicular+membranes.">Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).</li><li>Turnbull, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Letter:+Letter:+An+alternate+explanation+for+the+permeability+changes+induced+by+electrical+impulses+in+vesicular+membranes.">Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).</li><li>Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+ion+flow+in+Escherichia+coli+B+and+electrical+sizing+of+bacterias.">Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias.</a> Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).</li><li>Kinosita, K., Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-induced+pore+formation+and+hemolysis+of+human+erythrocytes.">Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+directs+rod+photoreceptor+development.">Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development.</a> Neuron. 61, 234-246 (2009).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+hormone+receptor+ERRbeta+controls+rod+photoreceptor+survival.">The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).</li><li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Core+Paired-Type+and+POU+Homeodomain-Containing+Transcription+Factor+Program+Drives+Retinal+Bipolar+Cell+Gene+Expression.">A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression.</a> J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בשנת vivo electroporation מייצג שיטה מהירה ויעילה לטרנספורמציה של תאים ברשתית עם פלסמידים ביטוי ה-DNA. שיטה זו מאפשרת לבצע את הניסוי רווח של מחקרים לתפקד ectopically על ידי החדרת גן של עניין בשליטת היזם הביע בכל מקום בגוף או לבצע אובדן של מחקרים לתפקד באמצעות בונה shRNA מיקוד גנים ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> מאגר רווי פנול </td><td> Invitrogen </td><td> 15513-039 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> JT בייקר </td><td> 9180-03 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> נתרן אצטט </td><td> JT בייקר </td><td> 3470-05 </td><td> 3 מ &#39;מניות </td></tr><tr><td> מהיר גרין FCF </td><td> פישר ביוטק </td><td> BP123-10 </td><td> 10% מניות </td></tr><tr><td> איזופרופיל אלכוהול הכנה </td><td> Tyco Healthcare </td><td> 6918 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 30 guage מחט </td><td> Terumo רפואי קורפ </td><td> SG2-3013 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Exmire microsyringe </td><td> איטו Corporation </td><td> MS * E05 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Tweezertrode (אלקטרודה פינצטה) </td><td> כלי BTX, Genetronics בע&quot;מ </td><td> 522 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> אלקטרו כיכר Porator (electroporator) </td><td> כלי BTX, Genetronics בע&quot;מ </td><td> ECM 830 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> אוקטובר מתחם </td><td> סאקורה Finetek ארה&quot;ב </td><td> 4583 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of developing mouse retina

אפיון פונקציונלי של גנים הביע במהלך התפתחות הרשתית יונקים עדיין מהווה אתגר משמעותי. ג&#39;ין מיקוד ליצור הפסד או מותנה המכונן של knockouts פונקציה נשאר עלות עבודה אינטנסיבית, כמו גם זמן רב. הוספת לאתגרים אלה, הרשתית הביע גנים ייתכן תפקידים חיוניים מחוץ הרשתית המוביל בלבול מכוון בעת ​​שימוש בגישה בנוקאאוט. יתר על כן, היכולת להביע ectopically גן ברווח של הניסוי פונקציה יכול להיות יקר מאוד כאשר מנסים לזהות את תפקיד מפרט תא גורל ו / או בידול סופנית. אנו מציגים שיטה שילוב מהיר ויעיל של פלסמידים DNA לתוך הרשתית עכבר בילוד ידי electroporation. היישום של דחפים חשמליים קצר מעל כוח תוצאות מסוימות בתחום לעלייה זמנית בחדירות הממברנה הפלסמטית, להקל על העברת החומר על פני קרום 1,2,3,4. עבודתו פורצת הוכיח כי electroporation יכול להיות מנוצל כאמצעי להעברת גנים לתאי יונקים ידי גרימת היווצרות קרום הידרופילי הנקבוביות פלזמה המאפשר מעבר של DNA טעון דרך bilayer השומנים 5. הפיתוח הטכני רציף הביא לקיומה של electroporation כשיטה ב vivo העברת גנים ברקמות עכבר מרובים כולל הרשתית, השיטה המתוארת להלן 6, 7, 8, 9, 10. פתרון ה-DNA מוזרק אל תוך החלל subretinal כך DNA ממוקם בין אפיתל הפיגמנט ברשתית הרשתית של העכבר (P0) בילוד ו פולסים חשמליים מוחלים באמצעות אלקטרודה פינצטה. מיקום רוחבי של העיניים העכבר מאפשר התמצאות קלה של האלקטרודה פינצטה את היישור הכרחי מוט ה-DNA הרשתית חיובי שלילי מוט. שילוב ביטוי נרחב של הגנים הועבר ניתן לזהות על ידי יום לאחר הלידה 2 (P2). בשל העדר ההגירה רוחבי משמעותי של תאים ברשתית, אזורים electroporated ולא electroporated נוצרות. Non-electroporated אזורים עשויה לשמש היסטולוגית בקרות פנימיות ובמידת הצורך. Electroporation רשתית ניתן להשתמש כדי לבטא את הגן תחת מקדם בכל מקום, כגון החטיבה, או לשבש את תפקוד הגן באמצעות בונה shRNA או Cre-recombinase. ביטוי ממוקד יותר ניתן להשיג על ידי תכנון בונה עם היזמים תאים ספציפיים גן. ויזואליזציה של תאים electroporated מושגת באמצעות בונה bicistronic להביע GFP או על ידי שיתוף electroporating ביטוי של GFP לבנות. יתר על כן, בונה מרובות ניתן electroporated לחקר תופעות גן קומבינטורית או רווח והפסד בו זמנית של פונקציה של גנים שונים. Electroporation רשתית עשוי גם להיות מנוצל לצורך ניתוח של cis-הרגולציה אלמנטים גנומית ידי יצירת בונה ביטוי הולם מוטנטים המחיקה. ניסויים כאלה יכולים לשמש כדי לזהות cis-הרגולציה האזורים מספיק או נדרש ביטוי גנים ספציפיים תא 11. ניסויים אפשריים מוגבלים רק על ידי זמינות לבנות.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

שיטה שילוב של פלסמיד דנ&quot;א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים פונקציה<em&gt; In vivo</em&gt; מוצג. שיטה זו מנצל להגדיל את חולף על החדירות של קרום התא פלזמה המושרה על ידי יישום של שדה חשמלי חיצוני.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

in-vivo-electroporation-of-developing-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

20.7K Views.  Johns Hopkins School of Medicine. שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים פונקציה In vivo מוצג. שיטה זו מנצל להגדיל את חולף על החדירות של קרום התא פלזמה המושרה על ידי יישום של שדה חשמלי חיצוני.

Video: In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר