אני מודה ל ווטנבה, M Gorczyca וחברים אחרים במעבדה Yoshihara להערות שימושיים דיונים. אני מודה סקוט ק &#39;ול&#39; Looger למניות זבובים, S Yokoyama להפגין ניסויים, Shinya Iguchi לעזרה טכנית, נובוקו Yoshihara על מידע מהותי. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי מענקי בריאות הנפש MH85958, וקרן Worcester ל שלי

1. לבנות את הזבובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את הפלטפורמה ממכסה של צלחת 35 מ&quot;מ פלקון ידי המסת דפנות וגילוף זה כדי ליצור זווית בעובי המתאים (איור 1 א &#39;, איור 2). לקדוח חור במצע לקבל את ראש זבוב (איור 1 א, ב), כך את איברי הפה חשופים באופן חופשי לחלק החיצוני של חדר (איור 1 א). חותכים את הקצה של קצה Pipetman, עם גודל התאמת זבוב כדי לצפות. הדבק קצה לפלטפורמה כפי שמוצג באיור 1 א כדי להשלים את הזבובים (איור 2). </li></ol> 2. הכנת טוס לצורך השגחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרעיב את הזבוב הבוגר במשך 24 שעות במהירות של 25 ° C לפני הניסוי, על ידי הצבתו בתוך בקבוקון עם מגבת נייר רטוב בלבד, אם רעב הוא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבוב ידי הצבתו בתוך צינור פלסטיק 15 מ&quot;ל עומד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, הכנס זבוב לתוך תא שלזבובים, בעדינות זבוב עד שהוא לא מסוגל לזוז. לאחר מכן, להוסיף תוסף כדי לשמור על זבוב. (איור 1 א, ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החלקים שמסביב של חוטם הפרוקסימלית (הבמה) עד לקצה הפנימי של החור, למרוח כמות קטנה של דבק אור ריפוי (Tetric EvoFlow) לצדדים ומעל דוכן מבחוץ (חצים באיור 3). כמו כן, החל את הדבק מבפנים הזבובים לחלל בין החלק הגבי של הראש לקצה הפנימי של החור (1B איור). כדי לאפשר במה לנוע בחופשיות, יש להיזהר כדי למנוע כל דבק מגע הבמה באמצעות עפעף (או משהו דומה) כדי להפיץ את הדבק. לבסוף, לרפא את הדבק עם התאורה החלשה של אור כחול מספיק לרפא כדי למנוע נזק זבוב מחום יתר. הסר את תקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוט כדי להחזיק את הבמה מבוטלת חלקית (חץ איור 3) עשוי להיות מועסק על מנת לייצב את זבוב &quot;של ראש על ידי הימנעות בליטה של חלק בלוע כדי SOG ולחשוף את החלק הגחוני של SOG, במיוחד עבור מסופי הדמיה presynaptic של נוירונים Gr5a 8, אשר מכוסים על ידי חלק של הלוע, כאשר חוטם הוא חזר בו באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את פני השטח של פלטפורמה עם המכילים סוכר ללא מלח (מ&quot;מ): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4.5, CaCl 2, 1.5, ו-HEPES NaOH, 5 עם pH של 7.1 10. זה מלוחים סוכרוז ללא יש tonicity דומים לאלה של נפוץ בשימוש סוכרוז המכיל salines כגון HL3.1 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את הראש הקפסולה באמצעות סכין טונגסטן מלקחיים עם עצות כמו מספריים מחודדים, שהוא מכשיר מחוייט ועוצב במקור על ידי ד&quot;ר Kageyuki Yamaoka, יפן, אל הסרטון לציפורן ואת קנה הנשימה לחשוף SOG (איור 4). קצה הגחון של לציפורן הראש נחתך כמו הגחון ככל האפשר ואילו חתך בקצה הגב לא היה קריטי. ראשית, חתך דרךבקצה האחורי באמצעות סכין טונגסטן. לאחר מכן, לחתוך בצד את הקצוות הקדמי באמצעות מלקחיים מחודדים. פיסת העור המת חתך יש הרים עם מלקחיים את הסיר. העצבים אנטנות מחושים יש לגזור על ידי מלקחיים מחודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע חפצים התנועה במהלך ההקלטות, המוח חייב להיות מיוצב באמצעות הסרת חלקים מסוימים של זבוב. ראשית, להסיר באופן סלקטיבי שקי אוויר בין SOG ו לציפורן. חותכים את הוושט בסוף לכיוון הלוע ובסוף נכנס SOG להסיר את הקשר בין הלוע ואת המוח. אחר כך שולף שריר 16 12, ולבסוף, לנתק את כל קנה הנשימה חיבור המוח לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבענו הזבובים שלנו על הבמה של מיקרוסקופ אולימפוס BX51WI מחובר למערכת מסתובב הדיסק confocal מיקרוסקופ (Improvision ב PerkinElmer) (איור 5). טבילה במים העדשה, למשל 40X/0.8 NA, היה שקוע לאמבטיה (איור 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + הדמיה של המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + הדמיה באמצעות GCaMP3.0 1, 9 בוצעה באמצעות שיטת שהוקמה על ידי מרלה et al. 8 (איור 6). באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal (Improvision), לקחת חלק אופטי יחיד 4Hz עם זמן חשיפה של 122ms באמצעות 491nm לייזר עירור, תוך התמקדות על האזור של עניין (גוף התא של הנוירון המוטורי, או interneuron או מסופי presynaptic של עצב סנסורי התעורר אצלם) עם תוכנת מהירות, ver. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. מגרה את חוטם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate 100mm סוכרוז בתמיסה מימית לתוך מחט המזרק עם פתיל קטן (היא עשויה מנייר washi יפנית, ראו טבלה של חומרים כימיים מסוימים) בולט מקצה (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוק טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז על הפתיל, אם כן, לשאוב אותו, מיד beforדואר יישום הפתיל נייר ספוג washi אל קצה חוטם את. הפתיל נייר washi צריך להיות מיושם רק לרגע, כדי למנוע שובע (איור 8). מעקב אחר תגובת הרחבה חוטם (PER) התנהגות באמצעות מצלמת CCD מחובר מיקרוסקופ לנתיחה (איור 5) בו זמנית עם Ca 2 + הדמיה. נתונים יש להביא בתוך שעה לאחר תחילת לנתיחה, כי התגובה PER לא נשמר יותר משעה בתנאים אלה. </li></ol> 5. נציג תוצאות הנוירונים המוטוריים של מד הזווית הבמה, זוג השרירים העיקריים האחראים על הרמת דוכן להארכת חוטם, דווחו להראות התגובות לגירויים חזקים מתוקים 13. איור 9 מראה של CA 2 + אותות דרך GCaMP3.0 1, 9 לידי ביטוי גל 4 הנהג, E49 13, מגוף התא של הנוירון המוטורי. כפי שניתן לראות בסרטון, robuרחוב PER נצפתה בתיאום עם עלייה Ca 2 + האות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של המוח פליי חיים הדמיה Electrophysiology שלב (זבובים). , הזבובים בנוי כך הזווית של הקיר מאפשר ראש זבוב לצאת ישר. שלושה קטעים של חוטם זבובים הם בצבעים, במה הוא מגנטה. זבוב מוכנס לתוך החדר עם מלקחיים, וחתיכת לחתוך מסוף עצה Pipetman הוא פקוק לתוך האחורי של החדר כדי לחסום את זבוב לברוח. ב &#39;חור משועמם כדי להתאים את ראשו של זבוב. הפערים שנותרו סגורים עם דבק אור ריפוי כמצוין כדי להבטיח שאין נזילות. אחרי דבק ריפא, עצה Pipetman כמו תקע מוסר. מלח הוא שפך לתוך את הזבובים האלה כי פני השטח של המוח מכוסה לחלוטין. יש להבטיח כי אין דליפה מלוחיםלאינג אל הקצה הקדמי של הראש זבוב. אזור מוצל מוקף בקו מקווקו בלוח ב &#39;מראה את החלק שיש גזור החוצה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> איור 2. תצלום של הזבובים. הקיר בצורת חצי סהר של דבק (מאקדח דבק) נעשה כדי לשלוט על זרימת תמיסת מלח במהלך זלוף, וכדי להפחית את כמות מלוחים בשימוש. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> איור 3. תצוגה חזיתית של זבוב רכוב הזבובים. תמונה זו מראה כיצד זבוב מוגדר הזבובים, ואיך דבק אור ריפוי מוחל סביב ראשו של זבוב (חיצים) כדי ליצור חותם מלוחים הוכחה. אם כל ההדלפות מלוחים ועד החדק של זבוב, אז הניסוי ייכשל. חוט (ראשי חץ) קשור בשלב זה לקיים את חוטם במצב, כך שזה לא retrac לחלוטין<html> טד. אחרת זה היה לחסום את החלק הגחוני יותר SOG ולגרום חפצים ותנועה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> באיור 4. העליונה לאור את הזבובים זבוב גזור. תמונה זו מראה SOG חשיפה של הסרת העור המת הבאה לטוס. הוושט, שריר 16 ו tracheae מחובר למוח, כמו גם נבחרות אוויר שקי גם הוסר כדי למנוע מהם להפריע את המוח, מה שעלול להוביל את החפצים אותות סידן. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> איור 5. מכשיר ניטור. מנגנון זה מורכב מ מיקרוסקופ אולימפוס BX51WI מחובר למערכת מסתובב הדיסק confocal מיקרוסקופ (Improvision), וצד רכוב Nikon SMZ800 מיקרוסקופ. התקנה זו מאפשרת הדמיה חי של פעילות המוח במהלך PER התנהגות. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; איור 6. תמונות להצגה הצדדית של הזבובים. שכבה דקה של תמיסת מלח דחוקה בין עדשת מים לטבילה 40X ו זבוב. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> איור 7. סכמטי להכנת פתיל נייר washi. יפני דקיק-washi הנייר הוא קלף יפני מסורתי שהוא דק מאוד חלקה (Haibara, יפן). הוא גם חזק מאוד והוא יכול לשמור על כמות גדולה של נוזלים. נייר washi יש לחתוך טרפז עם ממדים ספציפיים מאוד, 0.3 מ&quot;מ ו 0.7 מ&quot;מ רוחב, ו - 4-5 מ&quot;מ באורך (א). זה טרפז מוכנס לתוך קצה מחט המזרק G 23 מהצד 0.7 מ&quot;מ ניתן התייצב דרך הכניסה של סיכה חרק, אשר כפופות לצורה-V (ב). ג, נייר הופך washi החשיפה הבאה שקוףלנוזל, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור ניסוי זה. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> איור 8. גירוי של חוטם על לזבובים בעלי הפתיל-washi. הפתיל נייר washi בקצה של מחט המזרק מוחל לרגע באמצעות מניפולטור ג&#39;ויסטיק ביד אחת. המחט מחוברת דרך צינור גמיש כדי ההזרקה מניפולציות עם זאת, עבור aspirating ופריקה פתרון סוכרוז. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> איור 9. נציג תוצאות. ולדירה, התנהגות רשמה באמצעות מצלמת CCD מותקנת סטראו. צפיות הקדמי של זבוב מורעבת עם כ חוטם ארוך (חיצים) לפני גירוי, על גירוי, ואחרי גירוי עם הפתיל המכילה 100 סוכרוז mM מימית פתרון (ראש חץ). תאורה נעשה על ידי לייזר 491 ננומטר שימושעבור GCaMP פלואורסצנטי. ב, סוכרוז הנגרמת GCaMP 3.0 תגובה הנוירון המוטורי של מד הזווית של שריר דוכן במצב הרעבה. הפאנל העליון, לפני גירוי, הפאנל התחתון, מיד לאחר הגירוי. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. ג, כימות בתגובה סוכרוז הנגרמת 3.0 GCaMP. הנוירון המוטורי מגיב לגירוי סוכרוז על ידי גידול חד של הקרינה ואחריו שלב החזרת מספר שניות עד לקו הבסיס.

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li><li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel.">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hungry Fly. , (1976).</li><li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proboscis+Extension+Response+(PER)+Assay+in+Drosophila.">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li><li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category.">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Miller, A., M, D. e. m. e. r. e. c. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-534 (1950).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth.">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; אין לי מה לחשוף.</p

הזבובים מאפשר הקלטה בו זמנית של Ca 2 + האותות והתנהגות למשק. גם עם המוח נחשף להתנהגות מלוחים PER רגיל נצפתה. באמצעות פתיל יפני דקיק-washi במקום הפתיל Kimwipe שימוש method7 נימי המקורי מאפשר התנהגות PER לשחזור מאוד יציבה מונעת את הצורך להיות מיומנים בקבלת ובחירת הפתיל Kimwipe טוב. העצות הניסוי האמור לעיל אפשר לנו בהצלחה למנוע הפרות סדר על ידי תנועה של חוטם, שמוביל הקלטה יציבה מאוד של Ca 2 + אותות עם רעש נמוך. מדי פעם, הסרת הרקמה לא היה די כדי לחשוף תאים או לדכא את התנועה כראוי, מה שמוביל לתוצאות עניים. עם זאת, ברגע שהיינו מיומן, יותר מ 80% של ההכנות הניב תוצאות טובות. מתודולוגיה זו היא לא רק Ca 2 + הדמיה, אבל יכול גם להיות מותאם הדמיה כל חי תוך שמירה על PER התנהגות. לדוגמה, אנו יכולים לגשת לכל תא באמצעותהשימוש אלקטרודות ישירות להקליט פעילות. בשילוב עם מיקרוסקופ שני הפוטונים עירור, אנו מסוגלים לבצע זמן לשגות הדמיה של מבנה סינפטי, מה שיכול להיות קשור לשינויים התנהגותיים. לכן, שיטה זו של הדמיה מוחית עם תצפית התנהגותית היא לא רק ערך לנתיחה פונקציונלי של הרשת העצבית, אך יכול לשמש ככלי רב עוצמה, כדי לקשר בין 14 הפלסטיות הסינפטית את המנגנונים מאחורי הזיכרון.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ציוד / מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar vivadent </td><td> M04115 </td><td> אור ריפוי דבק </td></tr><tr><td> BX51WI מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> BX51WI </td><td> עם עדשת 40X (NA 0.8) טבילה במים המטרה </td></tr><tr><td> ספינינג מערכת confocal דיסק מיקרוסקופ </td><td> Improvision ב PerkinElmer </td><td></td><td> עם לייזר 491 ננומטר </td></tr><tr><td> סטראו </td><td> ניקון </td><td> SMZ-800 </td><td> מחוברת זרוע הנדנדה. צפה סטריאו עדיין זמינה עם הקלטת וידאו </td></tr><tr><td> יפני דקיק-washi נייר </td><td> Haibara, יפן </td><td></td><td> סוג מיוחד של נייר יפני מסורתי </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> הדמיה מקור </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 פיקסלים SONY CCD </td></tr><tr><td> ג&#39;ויסטיק מניפולטור </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

כדי לחקור רשתות נוירונים מבחינת תפקידם בהתנהגות, עלינו לנתח כיצד נוירונים פועלים כאשר כל דפוס התנהגות נוצרת. לפיכך, הקלטות בו זמנית של הפעילות העצבית התנהגות חיוניים, כדי לקשר בין פעילות המוח להתנהגות. עבור ניתוחים התנהגות כאלה, זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מאפשרת לנו לשלב אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית כגון GCaMP 1, כדי לפקח על הפעילות העצבית, ולהשתמש מניפולציות גנטיות מתוחכמות עבור טכניקות optogenetic או thermogenetic באופן ספציפי הפעל זיהו נוירונים 2-5. השימוש בטכניקה thermogenetic הוביל אותנו למצוא נוירונים קריטיים עבור התנהגות האכלה (המבול et al., תחת גרסה). כחלק העיקרי של התנהגות האכילה, בוגר תסיסנית מרחיב חוטם שלה להזנת 6 (בתגובה חוטם הארכה; PER), מגיב לגירוי מתוק מתאי החישה על חוטם שלה או טרסי. שיתוףmbining פרוטוקול PER 7 עם טכניקה סידן באמצעות הדמיה 8 GCaMP3.0 1, 9, הקמתי מערכת ניסיונית, שבה אנו יכולים לעקוב אחר פעילות של נוירונים במרכז האכלה - גנגליון suboesophageal (SOG), בו זמנית עם תצפית התנהגותית של חוטם את. אני עיצבו מנגנון (&quot;המוח פליי חיים הדמיה שלב Electrophysiology&quot;: &quot;זבובים&quot;) כדי להתאים למבוגרים תסיסנית, המאפשר חוטם שלה כדי לנוע בחופשיות תוך המוח שלה חשוף אמבטיה עבור Ca 2 + הדמיה דרך העדשה טבילה במים . הזבובים מתאים גם סוגים רבים של ניסויים חיים על המוח לעוף כמו הקלטה אלקטרו או זמן לשגות הדמיה של מורפולוגיה הסינפטי. כי את התוצאות של הדמיה חיה יכול להיות מתואמים ישירות עם התנהגות PER בו זמנית, מתודולוגיה זו יכולה לספק מערכת ניסיונית מצוינת ללמוד עיבוד מידע של רשתות נוירונים, ואיך זה גפעילות ellular מצמידים לתהליכים פלסטיק זיכרון.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

זבוב הפירות,<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt;, חוטם שלה משתרע על האכלה, להגיב לגירוי סוכר חוטם שלה או שורש הרגל. אני שילבו תצפיות על התגובה הרחבה חוטם (PER) עם טכניקת הדמיה סידן, מאפשר לנו לפקח על הפעילות של הנוירונים במוח, בעת ובעונה אחת עם תצפית התנהגותית.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.6K Views.  University of Massachusetts Medical School. זבוב הפירות, תסיסנית melanogaster, חוטם שלה משתרע על האכלה, להגיב לגירוי סוכר חוטם שלה או שורש הרגל. אני שילבו תצפיות על התגובה הרחבה חוטם (PER) עם טכניקת הדמיה סידן, מאפשר לנו לפקח על הפעילות של הנוירונים במוח, בעת ובעונה אחת עם תצפית התנהגותית.

Video: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Immunology and Infection

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ניטור אירועים אפילפטיים בדרוזופילה באמצעות הדמיית סידן

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

זרקור על המחבר: תובנות לגבי הטכניקות והממצאים של ההתקדמות האחרונה בחקר האפילפסיה 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

מדידת תגובות פיזיולוגיות של

הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה