עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הבסיסית והיישומית של גואנגדונג (מענק מס '2022A151111123 לג'ינג-דה קיאו) ותוכנית לשפר את המחקר המדעי ב- GMU (ג'ינג-דה קיאו). עבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית Enihancement Innovation Ability של האוניברסיטה הרפואית של גואנגזו (מימון מס '02-408-2304-02038XM).

1. פרוטוקול לבדיקה רגישה למפץ
<ol><li>ביסוס זבובי הניסוי על ידי חציית קו הנהג tub-Gal4 עם קו UAS-cac-RNAi דרך מערכת Gal4/UAS21. אספו את הזבובים הבתוליים של קו אמבט-Gal4 ואת הזבובים הזכרים של קו UAS-cac-RNAi . לאחר מכן, העבירו את הזבובים הבתולים והזכרים לאותו בקבוקון כדי לקצור את הצאצאים. הערה: קו דרייבר tub-Gal4 יאפשר להשיג הפלה גלובלית של גן ה-cac . השתמש בקו UAS-cac-RNAi כקבוצת הבקרה.</li>
	<li>לאחר 3-5 ימים של אקלוסיה, הרדימו בעדינות את הזבובים באמצעות 100% CO2 (ציוד הרדמה CO2 ) ואספו הן את זבובי האמבט-Gal4>UAS-cac-RNAi והן את זבובי ה-UAS-cac-RNAi בעזרת מברשת. העבירו את הזבובים האלה לבקבוקוני מזון חדשים ונקיים יום אחד לפני הבדיקה כדי לוודא שהם מוכנים היטב.</li>
	<li>הרדימו בעדינות את הזבובים באמצעות CO2. לאחר ההרדמה, הניחו בזהירות 4-6 זבובים בבקבוקונים טריים בודדים. אפשרו לזבובים להתאושש מההרדמה במשך כשעה לפני שהמשיכו בבדיקה. הערה: עבור כל גנוטיפ נבדקו לפחות חמישה ניסויים, וכל ניסוי כלל שישה בקבוקונים של זבובים.</li>
	<li>הגדר את ציוד ההקלטה. מקם מצלמה (720-1080P, 30-60 FPS לפחות, מיקוד אוטומטי נעול) על חצובה מול לוח מחיק. כוונן את מיקוד המצלמה באופן ידני באמצעות בקבוקון ריק כדי להבטיח צילומים ברורים ומדויקים.</li>
	<li>השתמש במערבל מערבולות כדי לבצע את ההתנהגות דמוית ההתקף המושרה באופן מכני. מניחים כל בקבוקון המכיל 4-6 זבובים על מערבל המערבולת ומפעילים אותו במצב הגבוה ביותר (2800 סל"ד) למשך 10 שניות בדיוק. לאחר המערבולת, הניחו מיד את הבקבוקון על הלוח.</li>
	<li>התבוננו בזבובים ותיעדו כל התנהגות דמוית התקף שהם מפגינים. הערה: התנהגות דמוית התקף שנצפתה בזבובים מורכבת משלושה שלבים: התקף (המתבטא בכנפיים רוטטות), שיתוק והתאוששות24. היחס בין זבובי ההתקפים לזבובים שנבדקו הוגדר כשיעור ההתקפים.<ol><li>מדדו את זמן ההתאוששות כזמן הדרוש לאחר מערבולות עד שהזבובים יחזרו לעמוד זקוף25.</li>
	</ol></li>
</ol>2. פרוטוקול להדמיית סידן במוח ex vivo
<ol><li>הקימו את זבובי הקו tub-Gal4>UAS-GCaMP6m ו-tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi , בהתאמה. צור את הזבובים באמצעות מערכת ביטוי בינארי Gal4/UAS21 כדי לאפשר ניטור של פעילות הסידן במוח ex vivo .</li>
	<li>הכינו את תמיסת הדיסקציה כמתואר במתכון המצורף (טבלה 1)26.<ol><li>הכן את הפתרון החיצוני כמתואר בטבלה 1. כוונן ל- pH 7.2 עם NaOH וכוונן את האוסמולריות ל- 250-255 mOsm/L. הערה: ניתן לאחסן את התמיסה החיצונית בטמפרטורה של 4°C למשך שבוע אחד.</li>
		<li>להכנת תמיסת הדיסקציה, הוסף 9 יחידות של תרחיף פפאין ול-ליזין (2 מ"ג/מ"ל) ל-600 מיקרוליטר של התמיסה החיצונית. מערבבים את התמיסה וממתינים 15 דקות עד שהפתרון ברור. הערה: מומלץ להשתמש בתמיסת הדיסקציה תוך 4 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לערבב את התמיסה החיצונית במי מלח מחומצנים (95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני) למשך 5 דקות לפני השימוש. השתמשו בפיפטה כדי להעביר כ-10 מיקרוליטר מתמיסת הדיסקציה לצלחת פטרי. פתרון זה יספק את התנאים הדרושים לדיסקציה והדמיה של המוח.</li>
	<li>נתחו בזהירות את המוחות של קווי tub-Gal4>UAS-GCaMP6m ו-tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi באמצעות מחטי המזרק והמיקרוסקופ. עקוב אחר הפרוטוקול שנקבע לדיסקציה מוחית27.</li>
	<li>השתמשו בפיפטה כדי להעביר את המוח המוכן לצלחת הקלטה המכילה 5 מ"ל של תמיסה חיצונית טרייה ושתקו את המוח באמצעות מחזיק C-sharp בצלחת ההקלטה למשך 3-5 דקות להתאוששות. הערה: מחזיק C-sharp היה עשוי חצי עיגול מתכתי בקוטר 7 מ"מ שנחצה על ידי סיבים מקבילים במרחק 0.5 מ"מ זה מזה.</li>
	<li>הקמה ורכישה של הדמיה קונפוקלית<ol><li>עבור דימות קונפוקלי, צלם כל מוח עם מטרה של 20x ומצב סריקה xyt. זהה את נוירוני גוף הפטריות עם הגברה דיגיטלית נוספת של 4.5x המבוססת על הגברה אופטית פי 20. הערה: ניתן לצלם כל מוח ex vivo במשך יותר משעה אחת.</li>
		<li>קבל את כל פליטת המוח-GCaMP6m בעירור לייזר של 488 ננומטר עם עוצמת לייזר של 16 μw. הגדר את פרמטרי הסריקה למהירות של 400, עם גודל פיקסל של 256 פיקסלים x 256 פיקסלים. השתמש בקצב רכישה של 5.3 הרץ והקלט למשך 3 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>זהה 5-8 ROI בכל מוח ונתח את הפלואורסצנטיות. לקבוע באופן ידני את גוף התא של נוירונים בגוף פטריות כמו האזור של עניין28.<ol><li>תייגו את תאי העצב שזוהו ומדדו את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם באמצעות ImageJ. נתח את נתוני הפלואורסצנטיות של GCaMP6m באמצעות %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). הגדירו את הפלואורסצנטיות התוך-תאית, הגדלה בין 2 ל-2.5 סטיות תקן מעל קו הבסיס, כקוצים קטנים, ואת הפלואורסצנטיות התוך-תאית, הגדלה של יותר מ-2.5 סטיות תקן מעל קו הבסיס, כקוצים גדולים. נתח את התדירות של קפיצות סידן על ידי מבחן t של התלמיד. הערה: F0 הוגדר כקו הבסיס על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של 5 המסגרות הראשונות בהחזר השקעה, F1 כעוצמת הפלואורסצנטיות של נקודת הזמן הנתונה, ו- B כרקע ללא פלואורסצנטיות. פעילויות פיזיולוגיות זמניות של תאי עצב עוזרות גם להבדיל אותם מסימני רעש.</li>
	</ol></li>
</ol>

ניטור אירועים אפילפטיים בדרוזופילה באמצעות הדמיית סידן

<ol>
	<li>Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy+in+adults.">Epilepsy in adults.</a> Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).</li><li>Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy+genetics:+Clinical+impacts+and+biological+insights.">Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights.</a> Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy-associated+genes.">Epilepsy-associated genes.</a> Seizure. 44, 11-20 (2017).</li><li>Oliver, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes4epilepsy:+An+epilepsy+gene+resource.">Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource.</a> Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).</li><li>Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+antiseizure+drugs+and+the+ketogenic+diet.">Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).</li><li>Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+gated+sodium+channel+genes+in+epilepsy:+Mutations,+functional+studies,+and+treatment+dimensions.">Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions.</a> Front Neurol. 12, 600050 (2021).</li><li>Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pentetrazol+on+neuronal+activity+and+on+extracellular+calcium+concentration+in+rat+hippocampal+slices.">Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices.</a> Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).</li><li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+neural+activity.">In vivo imaging of neural activity.</a> Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li><li>Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+seizure+activity+in+a+novel+developmental+seizure+model.">In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model.</a> Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).</li><li>Ishimoto, H., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+calcium+imaging+for+visualizing+brain+responses+to+endocrine+signaling+in+drosophila.">Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila.</a> J Vis Exp. 136, 57701 (2018).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+calcium-sensitive+photoproteins+aequorin+and+obelin.">Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).</li><li>Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoproteins+as+biological+calcium+indicators.">Photoproteins as biological calcium indicators.</a> Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+gcamp+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+dendritic+excitation+in+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex+in+vivo.">Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo.</a> Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).</li><li>Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+in+the+living+brain:+Prospects+for+molecular+medicine.">Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine.</a> Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).</li><li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release.">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).</li><li>Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+neuronal+activity+in+drosophila+can+identify+anticonvulsive+compounds.">Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds.</a> PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).</li><li>Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure+and+epilepsy:+Studies+of+seizure+disorders+in+drosophila.">Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).</li><li>Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila.</a> Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li><li>Liu, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategies+based+on+behavioral+and+electrophysiological+methods+for+epilepsy-related+gene+screening+in+the+drosophila+model.">Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model.</a> Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+odor-evoked+distributed+neural+activity+in+the+drosophila+mushroom+body.">Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body.</a> Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unc13b+variants+associated+with+partial+epilepsy+with+favourable+outcome.">Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome.</a> Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).</li><li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+suppression+involving+behavioral+mutants+with+altered+nerve+excitability+in+drosophila+melanogaster.">Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster.</a> Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).</li><li>Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+whole-cell+recordings+in+adult+drosophila+brain.">Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain.</a> Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).</li><li>Gu, H., O'dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+recordings+from+brain+of+adult+drosophila.">Whole cell recordings from brain of adult drosophila.</a> J Vis Exp. (6), 248 (2007).</li><li>Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-timing-dependent+plasticity+at+incoming+synapses+of+the+mushroom+body+facilitates+olfactory+learning+in+drosophila.">Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila.</a> Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).</li><li>Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+CACNA1A+deficiency+against+seizure+in+the+CACNA1A-CELSR2+digenic+knockdown+flies.">Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies.</a> Research Square. , (2023).</li><li>Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cav2.1+voltage+activated+calcium+channels+and+synaptic+transmission+in+familial+hemiplegic+migraine+pathogenesis.">Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis.</a> J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).</li><li>Le Roux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cacna1a-associated+epilepsy:+Electroclinical+findings+and+treatment+response+on+seizures+in+18+patients.">Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients.</a> Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).</li><li>Alehabib, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+spectrum+of+p/q+type+calcium+channel+cav2.1+in+epileptic+patients.">Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).</li><li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cacna1a+mutations+associated+with+epilepsies+and+their+molecular+sub-regional+implications.">Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications.</a> Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).</li><li>Indelicato, E., Boesch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genotype+to+phenotype:+Expanding+the+clinical+spectrum+of+cacna1a+variants+in+the+era+of+next+generation+sequencing.">From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing.</a> Front Neurol. 12, 639994 (2021).</li><li>Saras, A., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+calcium+channel+gene+cacophony+suppress+seizures+in+drosophila.">Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila.</a> Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).</li><li>Cozzolino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+epileptiform+activity+in+zebrafish+by+statistical-based+integration+of+electrophysiology+and+2-photon+ca2++imaging.">Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging.</a> Cells. 9 (3), 769 (2020).</li><li>Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+seizure+induction+methods+in+drosophila.">Characterization of seizure induction methods in drosophila.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li><li>Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+joy+of+balancers.">The joy of balancers.</a> Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יון הסידן משמש כשליח שני מכריע, וממלא תפקיד מרכזי במגוון תגובות פיזיולוגיות ופתופיזיולוגיות להפרעות כימיות וחשמליות כאחד. יתר על כן, היסוד הטופולוגי של ערוצי P/Q הפרה-סינפטיים, המקודדים על ידי הגן CACNA1A האדם, זוהה כאחראי לתיווך פריקה של מוליכים עצביים שונים, כולל גלוטמט 30,31,32</su...

אפילפסיה, הפרעה נוירולוגית כרונית מורכבת המאופיינת בהישנות של התקפים ספונטניים וללא התגרות ופעילות חריגה ברשת העצבית, השפיעה על יותר מ -70 מיליון אנשים ברחבי העולם, מה שהופך אותה לאחת המחלות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר1 ומוביל לנטל כבד של משפחות וחברה. בהתחשב בהשפעת האפילפסיה, נערכו מחקרים רבים לזיהוי האטיולוגיה של התקפים, אשר גנטיקה אושרה כגורם עיקרי לסוגים רבים של אפילפסיה או תסמונות אפילפטיות. בעשורים האחרונים, התקדמות בטכנולוגיות גנומיות הובילה לעלייה מהירה בגילוי גנים חדשים הקשורים לאפילפסיה, הממלאים תפקיד מכריע בהתרחשות פרכוסים, כולל תעלות יונים וגנים שאינם תעלות יונים 3,4. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים והניתוח הפונקציונלי בין הגנים לפנוטיפים אפילפטיים אינם מובנים לחלוטין. זיהוי גנים ומנגנונים הקשורים לאפילפסיה מציע אפשרות לניהול יעיל של חולים 5,6.
אותות סידן ציטוסוליים הם מרכיבים מרכזיים בפעילות העצבית ובהעברה סינפטית. הדמיית סידן, כולל פרוסות מוח7, in vivo 8,9, ו- ex vivo10, שימשה לניטור פעילות עצבית11 כסמן לעוררות עצבית מאז שנות השבעים12,13. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם מדדי הסידן המקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת הרזולוציה של המוח הרחב והן ברמת הרזולוציה של תא בודד 14,15,16, שיש לה רמה גבוהה של דיוק מרחבי-זמני. שינויים בריכוז הסידן ובמעברים נצפו בפוטנציאלי פעולה ובשידור סינפטי, בהתאמה14, מה שמצביע על כך שהשינוי ברמות הסידן התוך-תאי מציג מתאם קפדני עם ההתרגשות החשמלית של נוירונים17,18. הדמיית סידן יושמה גם כמודל התקפים התפתחותי9 ובוצעה בדרוזופילה לבדיקת תרכובות נוגדות פרכוסים19.
Drosophila melanogaster כבר מסתמן כאורגניזם מודל רב עוצמה במחקר מדעי, כגון אפילפסיה, עבור גנטיקה מולקולרית מתוחכמת שלה בדיקות התנהגותיות20,21,22. יתר על כן, הכלים הגנטיים המתקדמים בדרוזופילה תרמו לביטוי של אינדיקטור סידן מקודד גנטית GCaMP6. לדוגמה, מערכות השעתוק הבינארי מבוססות Gal4 ו- UAS מאפשרות ביטוי ספציפי של GCaMP6 באופן מבוקר מרחבית וזמנית. מכיוון שדרוזופילה היא אורגניזם זעיר, הדמיית סידן in vivo דורשת מיומנויות תפעול מיומנות כדי לבצע התערבות כירורגית, שבה רק חלק קטן מהגב של המוח נחשף דרך חלון קטן14,23. במקביל, הדמיית סידן ex vivo במוח השלם של דרוזופילה יכולה לשמש לניטור אזורי העניין (ROIs) של המוח כולו.
במחקר זה, אנו מציגים הדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 כדי לעקוב אחר פעילויות אפילפטיפורמיות. CACNA1A הוא גן אפילפסיה ידוע, cac שייך ערוץ Cav2, שהוא הומולוג CACNA1A. התחלנו בניתוח המוחות של זבובי cac knockdown tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi והדמיתם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מצב סריקה xyt. לאחר מכן ניתחנו את השינויים באותות הסידן של החזר השקעה על ידי חישוב אינדיקטורים המכמתים אירועים דמויי התקפים ספונטניים, כגון ערך %ΔF/F ואירועי סידן של פלואורסצנטיות GCaMP6. בנוסף, ביצענו גירוי מכני על ידי מכונת מערבולת כדי לגרום לבדיקות התנהגות התקפים על זבובי cac-knockdown, כמו גם כדי לאמת את התוצאות של הדמיית סידן. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brushes</td>
			<td>Panera</td>
			<td>AAhc022-2</td>
			<td>for handling flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>SP8; Zeiss, Jena, Germany.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anesthesia machine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for Anesthetizing the flies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-sharp holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, for mounting the brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture vials</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>51-0500</td>
			<td>2.5 cm diameter, 9.5 cm height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version: 2.14.0</td>
			<td>for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly morgue</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, for handling flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>cac-RNAi</td>
			<td>27244</td>
			<td>from Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>GCaMP6m</td>
			<td>42750</td>
			<td>from Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>tub-Gal4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution camera</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for recording the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1480/02D</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4640010, 4640030, 4640050, 4640060</td>
			<td>for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150682- Glass Based Dish</td>
			<td>for holding the brain and calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-binocular microscope</td>
			<td>SHANG GUANG</td>
			<td>XTZ-D</td>
			<td>for handling flies and dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>pythonbio</td>
			<td>HCL0693</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod</td>
			<td>WEIFENG</td>
			<td>45634732523</td>
			<td>for recording the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z653438</td>
			<td>for performing the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whiteboard</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, foam pad or paper for background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for drosophila model of epilepsy

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית המאופיינת בהתקפים חוזרים, בקורלציה חלקית עם מוצא גנטי, המשפיעה על יותר מ-70 מיליון אנשים ברחבי העולם. למרות החשיבות הקלינית של אפילפסיה, הניתוח התפקודי של הפעילות העצבית במערכת העצבים המרכזית עדיין צריך להתפתח. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם ביטוי יציב של מדדי סידן מקודדים גנטית, כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת המוח והן ברמת הרזולוציה של תא בודד. Drosophila melanogaster התפתחה ככלי לחקר המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס אפילפסיה בשל הגנטיקה המולקולרית המתוחכמת שלה ומבחני ההתנהגות שלה. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדשני ויעיל להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. המוח כולו מוכן מקאק, גן אפילפסיה ידוע, זבובים להדמיית סידן במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות את הפעילות העצבית כהמשך לבדיקת התנהגות דמוית פרכוס. זבובי ה-cac הראו שיעור גבוה יותר של התנהגות דמוית התקפים ופעילויות סידן חריגות, כולל יותר קוצים גדולים ופחות קוצים קטנים מאשר זבובי בר. פעילויות הסידן היו בקורלציה להתנהגות דמוית התקף. מתודולוגיה זו משמשת כמתודולוגיה יעילה בסינון הגנים הפתוגניים לאפילפסיה ובחקר המנגנון הפוטנציאלי של אפילפסיה ברמה התאית.

Epilepsy, a complex chronic neurological disorder characterized by the recurrence of spontaneous and unprovoked seizures and aberrant neuronal network activity, has affected over 70 million individuals worldwide, making it one of the most common neurological diseases1 and leading to the heavy burdens of families and society. In consideration of the impact of epilepsy, many studies have been conducted to identify the etiology of seizures, of which genetics has been approved as a primary cause of many types of epilepsies or epileptic syndromes2. For the past decades, advances in genomic technologies have led to a rapid increase in the discovery of novel epilepsy-associated genes, which play a crucial role in seizure occurrence, including ion channels and non-ion channel genes3,4. However, the underlying mechanisms and functional analysis between the genes and epileptic phenotypes are incompletely understood. Identifying epilepsy-associated genes and mechanisms offers the possibility to the management of patients efficiently5,6.
Cytosolic calcium signals are pivotal elements in neuronal activity and synaptic transmission. Calcium imaging, including brain slices7, in vivo8,9, and ex vivo10, has been utilized to monitor neuronal activity11 as a marker for neuronal excitability since the 1970s12,13. Recent advancements in imaging technology, in combination with the genetically encoded calcium indicators (GECIs), such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels14,15,16, which has a high level of spatiotemporal precision. Changes in calcium concentration and transients were observed in action potentials and synaptic transmission, respectively14, indicating the alteration of intracellular calcium levels exhibits a strict correlation with the electrical excitability of neurons17,18. Calcium imaging has also been applied as a developmental seizure model9 and performed in Drosophila for screening anticonvulsive compounds19.
Drosophila melanogaster has been emerging as a powerful model organism in scientific research, such as epilepsy, for its sophisticated molecular genetics and behavioral assays20,21,22. Moreover, the advanced genetic tools in Drosophila have contributed to the expression of genetically encoded calcium indicator GCaMP6. For instance, the Gal4 and UAS-based binary transcriptional systems enable specific expression of the GCaMP6 in a spatially and temporally controlled manner. Since Drosophila is a tiny organism, in vivo calcium imaging requires proficient operation skills to perform a surgical intervention, in which only a small part of the dorsal of the brain was exposed through a small window14,23. At the same time, ex vivo calcium imaging in the intact brain of Drosophila can be used to monitor the regions of interest (ROIs) of the whole brain.
In this study, we present ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. CACNA1A is a well-known epilepsy gene, cac belongs to Cav2 channel, which is a homolog to CACNA1A. We began by dissecting the brains of cac knockdown flies tub-Gal4&#62;GCaMP6m/cac-RNAi and imaging them using a confocal microscope with xyt scanning mode. We then analyzed the changes in calcium signals of ROIs by calculating indicators that quantify spontaneous seizure-like events, such as %&#916;F/F value and calcium events of GCaMP6 fluorescence. Additionally, we performed mechanical stimulus by vortex machine to induce seizure behavior tests on cac-knockdown flies as well to validate the results of calcium imaging. Overall, this protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

זרקור על המחבר: תובנות לגבי הטכניקות והממצאים של ההתקדמות האחרונה בחקר האפילפסיה 

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

Recently, many epilepsy candidate gene have been found in gene tests and then readily by animal experiments. We deliver a set of techniques to study the epilepsy-related neural activity, including whole cell recording, evoked EPSP recording and the new one that we will introduce here, ex vivo calcium imaging. Since the integrity of the brain and its neural networks cannot be fully replicated in cell culture or brain slices, the main advantage of the current experiment is to obtain intact brain tissue while protecting neural networks from damage.We have established an ex vivo calcium imaging technique along with the band-sensitive seizure-like behavior assay for efficiently screening the epilepsy-associated genes and exploring the underlying mechanisms of epilepsy at the cellular level. We implemented isolated, intact Drosophila brain tissues for calcium imaging, which can avoid their complex surgical techniques and preserve the integrity of neural networks. And the ex vivo approach can also yield the superior signal to noise ratio when compared with the in vivo imaging techniques.

באמצעות פרוטוקול זה, מצאנו כי זבובי קאק הראו שיעורים גבוהים משמעותית של התנהגות דמוית התקף מאשר זבובי WT (17.00 ± 2.99 [n = 6] לעומת 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061; מבחן t של תלמיד, איור 1A). רוב זבובי tub-Gal4>UAS-cac-RNAi התאוששו תוך 1-5 שניות, בעוד שזבובי UAS-cac-RNAi התאוששו תוך 2 שני...

Watch this Scientific Journal Video about Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

לאחרונה, גנים רבים המועמדים לאפילפסיה נמצאו בבדיקות גנטיות ולאחר מכן בקלות בניסויים בבעלי חיים. אנו מספקים סדרה של טכניקות לחקר הפעילות העצבית הקשורה לאפילפסיה, כולל הקלטה של תאים שלמים, הקלטת EPSP מעוררת והחדשה שנציג כאן, הדמיית סידן ex vivo. מכיוון שלא ניתן לשכפל את שלמות המוח והרשתות העצביות שלו במלואן בתרבית תאים או בפרוסות מוח, היתרון העיקרי של הניסוי הנוכחי הוא קבלת רקמת מוח שלמה תוך הגנה על רשתות עצביות מפני נזק.ביססנו טכניקת דימות סידן ex vivo יחד עם בדיקת התנהגות דמוית התקף רגישה לפלסטר לסינון יעיל של הגנים הקשורים לאפילפסיה וחקירת המנגנונים הבסיסיים של אפילפסיה ברמה התאית. יישמנו רקמות מוח דרוזופילה מבודדות ושלמות להדמיית סידן, שיכולות להימנע מטכניקות הניתוח המורכבות שלהן ולשמר את שלמות הרשתות העצביות. וגישת ex vivo יכולה גם להניב יחס אות לרעש מעולה בהשוואה לטכניקות הדמיה in vivo.

ex-vivo-calcium-imaging-for-drosophila-model-of-epilepsy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

953 Views.  the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University. לאחרונה, גנים רבים המועמדים לאפילפסיה נמצאו בבדיקות גנטיות ולאחר מכן בקלות בניסויים בבעלי חיים. אנו מספקים סדרה של טכניקות לחקר הפעילות העצבית הקשורה לאפילפסיה, כולל הקלטה של תאים שלמים, הקלטת EPSP מעוררת והחדשה שנציג כאן, הדמיית סידן ex vivo. מכיוון שלא ניתן לשכפל את שלמות המוח...

Video: זרקור על המחבר: תובנות לגבי הטכניקות והממצאים של ההתקדמות האחרונה בחקר האפילפסיה 

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Bang-Sensitive Assay for the Study of Seizure-Like Behavior in Drosophila

Bang-Sensitive Assay for the Study of Seizure-Like Behavior in Drosophila  

To begin, collect the virgin flies of the tub-Gal4 hybrid line and the male flies of the UAS-cac-RNAi line. Transfer the virgin and male flies into the same vial to harvest the offspring. After three to five days of occlusion, use a brush to collect the offspring and the tub-GL4 UAS-cac-RNA flies.A day before testing, transfer the flies to new clean vials with food. Next, carefully place four to six carbon dioxide anesthetized flies into individual fresh vials. Place a camera on a tripod in front of a whiteboard.Manually adjust the camera's focus with an empty vial. Now, vortex the vials with the flies at the highest setting for 10 seconds. Immediately place the vial on the whiteboard and observe the flies for any seizure-like behavior.Measure the recovery time as the time required for the flies to regain the ability to stand upright. The cac knockdown flies showed significantly higher rates of seizure-like behavior than the wild type flies. The recovery percentage of knockdown flies within one second was significantly lower than the wild type flies.

בדיקה רגישה למפץ לחקר התנהגות דמוית התקף בדרוזופילה

Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis

Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis  

To begin, perfuse the external solution with oxygenated saline for five minutes. With a pipette, transfer 10 microliters of the dissection solution to a Petri dish. Now, use syringe needles and a microscope to carefully dissect the brains of the anesthetized established wild type and knockout flies.With a pipette, transfer the prepared brain into a recording dish with five milliliters of external solution. Immobilize the brains with a C sharp holder. Next, capture the confocal image of each brain at 20x.Use the XYT scanning mode and identify the mushroom body neurons at an additional 4.5 times digital amplification. Set the laser excitation to 488 nanometers with 16 micro watt laser power to acquire the whole brain GCaMP6m emission. Then set the scanning parameters to 1400 speed with a pixel size of 256 by 256 pixels.Set the acquisition rate to 5.3 hertz and record for three minutes. Analyze the fluorescence of five to eight regions of interest. Manually determine the cell body of mushroom body neurons as the region of interest.Use image J to label the identified neurons and measure their fluorescence intensities. Analyze the fluorescence data of GCaMP6m as shown. Define the intracellular fluorescence increasing between two and 2.5 standard deviations as small spikes and those increasing more than 2.5 standard deviations as large spikes.Calcium signals were observed in the mushroom body of flies. The cac knockdown flies showed more large spikes than small spikes.