私はL渡辺、M Gorczycaと有用なコメントや議論のための吉原研究室の他のメンバーに感謝します。私は、ハエの株式の実験を実証するためのS横山、技術的なヘルプのための真也井口、材料情報の信子吉原ためK.スコットとL. Loogerに感謝します。この作品は私に心の健康補助金MH85958の国立研究所、ウースター財団によってサポートされていました

1。ハエを構築<ol><li>側壁を溶融し、適切な角度と厚さ（;図2図1a）を形成するために、それを削って35ミリメートルファルコン皿の蓋からプラットフォームを形成する。口器は自由にチャンバー（ 図1a）の外部に露出されるようなフライのヘッド（ 図1a、b）を 、受け入れるためのプラットフォームに穴を開けます。フライが観察されるようにマッチングサイズは、ピペットマンのチップの先端をカットします。プラットフォームへの接着剤の先端を飛ぶ（ 図2）を完了するには、 図1Aに示すように。 </li></ol> 2。観測のためにフライを準備する<ol><li> 25℃で24時間大人のフライを餓死°C飢餓が必要な場合のみ、濡れたペーパータオルでバイアルに配置することによって、実験の前に。 </li><li>氷の上に立っている15ミリリットルプラスチックチューブ内に配置することにより、ハエを麻酔。 </li><li>鉗子を用いて、のチャンバー内にハエを挿入飛び、それが移動することができなくなるまでそっとでフライを押してください。その後、フライを保持するためにプラグを挿入します。 （ 図1a、b）に。 </li><li>穴の内側の縁に近吻（くちばし）の周辺部をシールし、側面に光硬化接着剤（Tetric EvoFlow）の少量を適用してから演壇の上に外側（ 図3の矢印）。また、ハエの中から頭と穴の内側の縁（ 図1b）の背側部分の間の空間に接着剤を適用します。演壇が自由に移動できるようにするには、注意が接着剤を広げるためにまつげを（または同等のもの）を使用して演壇に触れてから任意の接着を防ぐために注意する必要があります。最後に、過度の熱からフライの損傷を防ぐために、硬化するのに十分な青い光の弱い照明と接着剤を硬化させます。プラグを取り外します。 </li><li>演壇の一部（ 図3の矢印）解除を保持するスレッドがフライを安定させるために用いることができる&quot;SOGに咽頭部のバンプを回避し、特に口吻が完全に収納されて咽頭の一部で覆われているGr5aニューロン8のイメージングシナプス前終末では、SOGの腹の部分を露出させることによってのヘッド。 </li><li> 7.1 10のpHを有するとHEPES-水酸化ナトリウム、5;のKCl、2;のMgCl 2、4.5;のCaCl 2、1.5のNaCl、140：無糖の生理食塩水を含有する（mMで）とプラットフォームの表面を記入してください。このスクロースフリー生理食塩水は、一般的に使用されるスクロース含有などHL3.1 11としてSalinesのと同様の等張性を持っています。 </li><li>カスタムメイドのデバイスであり、もともとはSOG（ 図4）を公開するキューティクルと気管をクリップする博士Kageyuki山岡、日本によって設計されたはさみのような尖った先端とタングステンブレードと鉗子を用いて頭部カプセルを開きます。背側のエッジカットなどの重要ではなかったのに対し、頭のキューティクルの腹縁はできるだけ腹に切断した。最初を通して切開を作る後端は、タングステンブレードを使用します。その後、サイドと尖ったピンセットを使用して前方の縁を切って。カットキューティクル片をピンセットで持ち上げて、削除する必要があります。触角と触角神経が尖ったピンセットで切り取る必要があります。 </li><li>録音中に動きのアーチファクトを避けるために、脳はハエの特定の部分の除去を介して安定化する必要があります。最初に、選択的にSOGとキューティクルの間に空気袋を削除します。咽頭に向かって最後と最後に食道は咽頭と脳の間の接続を削除するには、SOGに入るカット。その後マッスル16 12を引き出し、最後に、脳とキューティクルを接続する任意の気管を切り離します。 </li><li>私たちは、回転するディスク共焦点顕微鏡システム（パーキンエルマーでImprovision）（ 図5）に接続されているオリンパスBX51WI顕微鏡のステージ上で私たちのハエを設定します。水浸レンズ、例えば、40X/0.8 NAは、お風呂（ 図6に浸漬した</strong&gt;）。 </li></ol> 3。 Ca 2 +の脳のイメージング<ol><li> GCaMP3.0 1を使用してのCa 2 +イメージング、9マレラらによって確立されたメソッドを介して行われた。8（ 図6）。スピニングディスク共焦点顕微鏡（Improvision）を使用して、関心領域（運動ニューロンの細胞体、または介在ニューロン、またはシナプス前終末に焦点を当て、491nmの励起レーザーを使用して122msの露光時間と4Hzのに単一の光学部を取る味覚感覚ニューロンの）速度ソフトウェアバージョンである。 4.3（Improvision）。 </li></ol> 4。テングザルを刺激する<ol><li>先端（ 図7）から突出する小さな芯（和紙から作られた、 特定の試薬 ​​の表を参照）で皮下注射針に100mMの水溶液のショ糖溶液を吸引除去する。 </li><li>直ちに血友病、それを吸引し、その後、芯の上にショ糖溶液の小滴を排出する口吻の先端に浸した和紙の芯を適用する電子。和紙の芯は、飽食（ 図8）を避けるために、瞬時に適用する必要があります。テングザル拡張応答（PER）のCa 2 +イメージングと同時に（ 図5）解剖顕微鏡に取り付けられたCCDカメラを用いて動作を監視することができます。 PER応答が一時間以上を維持されていないため、データはこれらの条件の下で解剖を開始した後一時間以内に撮影しなければなりません。 </li></ol> 5。代表的な結果演壇の分度器、口先拡張のための演壇を持ち上げるの責任の主要な筋肉のペアの運動ニューロンは、甘い刺激13〜堅牢な応答を示すことが報告されています。 図9のCa 2 +シグナルGCaMP3.0 1〜9で表される運動ニューロンの細胞体からギャル4ドライバ、E49 13。ビデオ、robuに示すように、セントPERは、Ca 2 +シグナルの増加と同期して観察された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> 図1。フライ脳ライブイメージングと電気生理学ステージ（ハエ）の概略。 、ハエはハエの頭はまっすぐ出てくるため、壁の角が許可されているように構築されています。ハエの口吻の3つのセグメントは、色分けされたです。演壇はマゼンタです。フライは、鉗子でチャンバー内に挿入され、ピペットマンのチップの端からカット部分がエスケープからフライをブロックするようにチャンバーの背面に差し込まれている。bは 、穴はハエの頭部に適合するように退屈されています。漏れがないことを確認するために示されるように残りのギャップは、光硬化性接着剤で密封されています。接着剤が硬化した後、プラグインとしてピペットマンチップが削除されます。生理食塩水は、脳の表面が完全に覆われているようなハエに注入される。それはない生理食塩水漏れがないことを確保する必要がありますハエの頭の前端に出る。パネルBの破線で囲まれた斜線部分を摘出する部分を示しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> 図2。ハエの写真。接着剤の三日月形の壁が（接着剤銃から）血中の食塩水の流れを制御するために、使用食塩水の量を減らすために行われます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> 図3。ハエの正面には、光硬化接着剤は、生理食塩水防シールを作成するには、フライ（矢印）の頭の周りをどのように適用されるかこの画像はハエがハエに設定されている方法を示しています。ハエにマウントします。ハエの口吻に至るまで、任意の生理食塩水が漏れた場合、その後の実験は失敗します。ステージにつながスレッド（矢頭）は、完全にretracではないので、位置に口吻を保持することです。<html>テッド。それ以外の場合は、SOGのより多くの腹部分を妨げ、動きのアーチファクトの原因となります。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> 図4。解剖フライでハエのトップビュー。このイメージはキューティクル除去後にフライの露出したSOGを示しています。食道、筋肉16、気管、脳に接続されているだけでなく、選択された空気袋は、カルシウムシグナルのアーティファクトにつながる可能性が脳を乱すからそれらを防ぐために削除されました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> 図5。監視装置は、この装置は、回転するディスク共焦点顕微鏡システム（Improvision）、サイドマウントニコンSMZ800顕微鏡に接続されているオリンパスBX51WI顕微鏡から組み立てられます。このセットアップでは、PER動作時の脳活動のライブイメージングを可能にします。 6 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; 図6。ハエのサイドビューを表示する。生理食塩水の薄い層が40X水浸レンズとフライの間に挟まれている写真である 。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> 図7。和紙の芯を作るための模式図。Gampi-和紙は非常に薄く、滑らかである（榛原、日本）日本の伝統的な羊皮紙です。それはまた非常に強力であり、液体を大量に保持することができます。和紙は非常に特定の寸 ​​法を台形にカットしなければなりません。0.3ミリメートルと0.7ミリメートル幅で、長さ4〜5 mmの（）。この台形は、その後23 Gの注射針の先端に0.7ミリメートル側から挿入され、また、V字型（b）に曲がっている虫ピンの挿入を介して安定化させることができる。C、和紙のようになります透明性の暴露液体に、この実験に最適です。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> 図8。皮下注射針の先端に和紙の芯を持つハエ口吻の刺激。和紙の芯は、片手でジョイスティックマニピュレータを使用してインスタントに適用される。針は、ショ糖溶液を吸引して排出するため、もう一方の手で操作するインジェクタにフレキシブルチューブを介して接続されている。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> 図9。代表的な結果。実体顕微鏡に取付けたCCDカメラによって記録され、PER動作。飢えた刺激では刺激前に拡張された口吻（矢印）とハエ、および100 mMスクロース水溶液（矢印）を含む芯で刺激した後の正面ビュー。照明を使用する491 nmのレーザーによって達成されGCaMP蛍光B、飢餓状態にある演壇の筋肉の分度器のための運動ニューロンにおける糖誘発性GCaMP 3.0応答。刺激前にトップパネル;下部パネルは、すぐに刺激した後。スケールバーは、10μmである。C、ショ糖誘発性GCaMP 3.0応答の定量化。運動ニューロンは、ベースラインに数秒の回復相に続いて蛍光の急激な増加によって、ショ糖刺激に応答します。

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li><li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel.">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hungry Fly. , (1976).</li><li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proboscis+Extension+Response+(PER)+Assay+in+Drosophila.">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li><li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category.">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Miller, A., M, D. e. m. e. r. e. c. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-534 (1950).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth.">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt;私は開示することは何もありません。</p

ハエは、Ca 2 +シグナルとPERの動作の同時録画が可能になります。でも、生理食塩水、通常のPER行動にさらされる脳が観察された。オリジナルのキャピ​​ラリーmethod7で使用されているキムワイプの芯の代わりにGampi-和紙の芯を使用して動作PER高い再現性と安定を促進し、優れたキムワイプ芯を作り、選択に熟練したようになる必要がなくなります。実験的なヒントは、私たちが成功したCa 2 +の非常に安定した記録につながる、口吻の動きによって障害を回避するために、+の信号を低ノイズで許可されて上記の。時折、組織の除去は悪い結果につながる、細胞を公開したり、十分に運動を抑制するために十分ではなかった。しかし、一度我々は熟練した、準備の80％以上が良い結果を生んだ。この方法は、Ca 2 +イメージングのためであるだけでなく、行動のPER観察しながら、また、任意のライブイメージングに適応することができます。たとえば、我々は、を介して任意のセルにアクセスできます。直接活動を記録するために電極の​​使用しています。二光子励起顕微鏡と組み合わせることで、我々は行動の変化に関連することができシナプスの構造の時間経過のイメージングを実行することができます。したがって、行動観察と脳イメージングのこの方法は、神経回路網の機能解剖のために貴重であるだけでなく、メモリの背後にあるメカニズムにシナプス可塑性14を相関させる強力なツールとして使用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器/試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar vivadent </td><td> M04115 </td><td>光硬化性接着剤</td></tr><tr><td> BX51WI顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX51WI </td><td> 40X（NA 0.8）水浸対物レンズと</td></tr><tr><td>ディスク共焦点顕微鏡システムを紡績</td><td>パーキンエルマーでImprovision </td><td></td><td> 491 nmのレーザーを用いた</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> SMZ-800 </td><td>スイングアームに接続されている。ステレオビューは、まだビデオ録画で使用可能です</td></tr><tr><td> Gampi·和紙</td><td>榛原、日本</td><td></td><td>伝統的な和紙の特別な種類の</td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>イメージングソース</td><td> DFK41AU02 </td><td> 1月2日の &quot;1080×960画素SONY CCD </td></tr><tr><td>ジョイスティックのマニピュレータ</td><td>ナリシゲ</td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td>インジェクター</td><td>ナリシゲ</td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

行動でその機能の面で神経回路網を研究するために、我々は、それぞれの行動パターンが生成されたときにニューロンがどのように動作するかを分析する必要があります。したがって、神経活動と行動の同時録音が動作に脳の活動を関連付けるために不可欠である。そのような行動の分析のために、ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエは 、私たちは 、そのようなGCaMP 1として遺伝的にエンコードされたカルシウムインディケーターを組み込むために神経活動を監視するために、具体的にはニューロン2-5を識別有効にするoptogeneticまたは熱発生を起こす技術のための洗練された遺伝子操作を使用することができます。熱発生を起こす技術を使用するには、摂食行動に重要なニューロン（フラッドら 、改訂の下で）を見つけるために私たちをリードしてきました。その長い鼻や足根上の感覚細胞からの甘い刺激に応答して、、摂食行動の主要な一部として、 ショウジョウバエの成体は6（PER口先拡張応答）を供給するため、その長い鼻を拡張します。共同行動観察と同時に、suboesophageal神経節（SOG） - GCaMP3.0 1を使用して、カルシウムイメージング法8、9と7％のプロトコルをmbining、私たちは摂食中枢のニューロンの活動を監視することができ、実験システムを確立しています口先の。その脳は水浸レンズを介して+イメージングのCa 2お風呂にさらされながら、口先が自由に移動できるように、 ショウジョウバエの成体を収容するために：私は装置（ &quot;蝿&quot; &quot;フライ脳ライブイメージングと電気生理学的ステージ&quot;）設計した。ハエはまた、電気生理学的記録やシナプス形態のタイムラプスイメージングなどハエの脳のライブ実験の多くの種類に適しています。ライブイメージングからの結果を直接同時PER挙動と相関させることができるので、この方法論は、神経回路網の情報処理を研究するための優れた実験系を提供し、どのようにこのCすることができますellular活動は、プラスチックのプロセスおよびメモリに接続されている。

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

ミバエ、<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;は、その口吻または足根から糖刺激に応答して供給するために、その長い鼻を拡張します。私は、私たちは行動観察と同時に、脳内のニューロンの活動を監視することができ、カルシウムイメージング法を用いた口先拡張応答（PER）の観測を組み合わせている。

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.6K ビュー.  University of Massachusetts Medical School. ミバエ、キイロショウジョウバエは、その口吻または足根から糖刺激に応答して供給するために、その長い鼻を拡張します。私は、私たちは行動観察と同時に、脳内のニューロンの活動を監視することができ、カルシウムイメージング法を用いた口先拡張応答（PER）の観測を組み合わせている。

ビデオ: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

グルコース感知を勉強する成体マウス由来の膜視床下部腹内側部のニューロンの電位色素イメージング

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

へのガイド<em&gt;インビボ</emOptogenetically同定された皮質抑制性介在から&gt;シングル単位記録

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

臭気誘導挙動の高分解能定量<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;使用<em&gt; Flywalk</em&gt;パラダイム

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...