אני מודה ל ווטנבה, M Gorczyca וחברים אחרים במעבדה Yoshihara להערות שימושיים דיונים. אני מודה סקוט ק &#39;ול&#39; Looger למניות זבובים, S Yokoyama להפגין ניסויים, Shinya Iguchi לעזרה טכנית, נובוקו Yoshihara על מידע מהותי. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי מענקי בריאות הנפש MH85958, וקרן Worcester ל שלי

1. לבנות את הזבובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את הפלטפורמה ממכסה של צלחת 35 מ&quot;מ פלקון ידי המסת דפנות וגילוף זה כדי ליצור זווית בעובי המתאים (איור 1 א &#39;, איור 2). לקדוח חור במצע לקבל את ראש זבוב (איור 1 א, ב), כך את איברי הפה חשופים באופן חופשי לחלק החיצוני של חדר (איור 1 א). חותכים את הקצה של קצה Pipetman, עם גודל התאמת זבוב כדי לצפות. הדבק קצה לפלטפורמה כפי שמוצג באיור 1 א כדי להשלים את הזבובים (איור 2). </li></ol> 2. הכנת טוס לצורך השגחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרעיב את הזבוב הבוגר במשך 24 שעות במהירות של 25 ° C לפני הניסוי, על ידי הצבתו בתוך בקבוקון עם מגבת נייר רטוב בלבד, אם רעב הוא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבוב ידי הצבתו בתוך צינור פלסטיק 15 מ&quot;ל עומד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, הכנס זבוב לתוך תא שלזבובים, בעדינות זבוב עד שהוא לא מסוגל לזוז. לאחר מכן, להוסיף תוסף כדי לשמור על זבוב. (איור 1 א, ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החלקים שמסביב של חוטם הפרוקסימלית (הבמה) עד לקצה הפנימי של החור, למרוח כמות קטנה של דבק אור ריפוי (Tetric EvoFlow) לצדדים ומעל דוכן מבחוץ (חצים באיור 3). כמו כן, החל את הדבק מבפנים הזבובים לחלל בין החלק הגבי של הראש לקצה הפנימי של החור (1B איור). כדי לאפשר במה לנוע בחופשיות, יש להיזהר כדי למנוע כל דבק מגע הבמה באמצעות עפעף (או משהו דומה) כדי להפיץ את הדבק. לבסוף, לרפא את הדבק עם התאורה החלשה של אור כחול מספיק לרפא כדי למנוע נזק זבוב מחום יתר. הסר את תקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוט כדי להחזיק את הבמה מבוטלת חלקית (חץ איור 3) עשוי להיות מועסק על מנת לייצב את זבוב &quot;של ראש על ידי הימנעות בליטה של חלק בלוע כדי SOG ולחשוף את החלק הגחוני של SOG, במיוחד עבור מסופי הדמיה presynaptic של נוירונים Gr5a 8, אשר מכוסים על ידי חלק של הלוע, כאשר חוטם הוא חזר בו באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את פני השטח של פלטפורמה עם המכילים סוכר ללא מלח (מ&quot;מ): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4.5, CaCl 2, 1.5, ו-HEPES NaOH, 5 עם pH של 7.1 10. זה מלוחים סוכרוז ללא יש tonicity דומים לאלה של נפוץ בשימוש סוכרוז המכיל salines כגון HL3.1 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את הראש הקפסולה באמצעות סכין טונגסטן מלקחיים עם עצות כמו מספריים מחודדים, שהוא מכשיר מחוייט ועוצב במקור על ידי ד&quot;ר Kageyuki Yamaoka, יפן, אל הסרטון לציפורן ואת קנה הנשימה לחשוף SOG (איור 4). קצה הגחון של לציפורן הראש נחתך כמו הגחון ככל האפשר ואילו חתך בקצה הגב לא היה קריטי. ראשית, חתך דרךבקצה האחורי באמצעות סכין טונגסטן. לאחר מכן, לחתוך בצד את הקצוות הקדמי באמצעות מלקחיים מחודדים. פיסת העור המת חתך יש הרים עם מלקחיים את הסיר. העצבים אנטנות מחושים יש לגזור על ידי מלקחיים מחודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע חפצים התנועה במהלך ההקלטות, המוח חייב להיות מיוצב באמצעות הסרת חלקים מסוימים של זבוב. ראשית, להסיר באופן סלקטיבי שקי אוויר בין SOG ו לציפורן. חותכים את הוושט בסוף לכיוון הלוע ובסוף נכנס SOG להסיר את הקשר בין הלוע ואת המוח. אחר כך שולף שריר 16 12, ולבסוף, לנתק את כל קנה הנשימה חיבור המוח לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבענו הזבובים שלנו על הבמה של מיקרוסקופ אולימפוס BX51WI מחובר למערכת מסתובב הדיסק confocal מיקרוסקופ (Improvision ב PerkinElmer) (איור 5). טבילה במים העדשה, למשל 40X/0.8 NA, היה שקוע לאמבטיה (איור 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + הדמיה של המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + הדמיה באמצעות GCaMP3.0 1, 9 בוצעה באמצעות שיטת שהוקמה על ידי מרלה et al. 8 (איור 6). באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal (Improvision), לקחת חלק אופטי יחיד 4Hz עם זמן חשיפה של 122ms באמצעות 491nm לייזר עירור, תוך התמקדות על האזור של עניין (גוף התא של הנוירון המוטורי, או interneuron או מסופי presynaptic של עצב סנסורי התעורר אצלם) עם תוכנת מהירות, ver. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. מגרה את חוטם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate 100mm סוכרוז בתמיסה מימית לתוך מחט המזרק עם פתיל קטן (היא עשויה מנייר washi יפנית, ראו טבלה של חומרים כימיים מסוימים) בולט מקצה (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוק טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז על הפתיל, אם כן, לשאוב אותו, מיד beforדואר יישום הפתיל נייר ספוג washi אל קצה חוטם את. הפתיל נייר washi צריך להיות מיושם רק לרגע, כדי למנוע שובע (איור 8). מעקב אחר תגובת הרחבה חוטם (PER) התנהגות באמצעות מצלמת CCD מחובר מיקרוסקופ לנתיחה (איור 5) בו זמנית עם Ca 2 + הדמיה. נתונים יש להביא בתוך שעה לאחר תחילת לנתיחה, כי התגובה PER לא נשמר יותר משעה בתנאים אלה. </li></ol> 5. נציג תוצאות הנוירונים המוטוריים של מד הזווית הבמה, זוג השרירים העיקריים האחראים על הרמת דוכן להארכת חוטם, דווחו להראות התגובות לגירויים חזקים מתוקים 13. איור 9 מראה של CA 2 + אותות דרך GCaMP3.0 1, 9 לידי ביטוי גל 4 הנהג, E49 13, מגוף התא של הנוירון המוטורי. כפי שניתן לראות בסרטון, robuרחוב PER נצפתה בתיאום עם עלייה Ca 2 + האות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של המוח פליי חיים הדמיה Electrophysiology שלב (זבובים). , הזבובים בנוי כך הזווית של הקיר מאפשר ראש זבוב לצאת ישר. שלושה קטעים של חוטם זבובים הם בצבעים, במה הוא מגנטה. זבוב מוכנס לתוך החדר עם מלקחיים, וחתיכת לחתוך מסוף עצה Pipetman הוא פקוק לתוך האחורי של החדר כדי לחסום את זבוב לברוח. ב &#39;חור משועמם כדי להתאים את ראשו של זבוב. הפערים שנותרו סגורים עם דבק אור ריפוי כמצוין כדי להבטיח שאין נזילות. אחרי דבק ריפא, עצה Pipetman כמו תקע מוסר. מלח הוא שפך לתוך את הזבובים האלה כי פני השטח של המוח מכוסה לחלוטין. יש להבטיח כי אין דליפה מלוחיםלאינג אל הקצה הקדמי של הראש זבוב. אזור מוצל מוקף בקו מקווקו בלוח ב &#39;מראה את החלק שיש גזור החוצה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> איור 2. תצלום של הזבובים. הקיר בצורת חצי סהר של דבק (מאקדח דבק) נעשה כדי לשלוט על זרימת תמיסת מלח במהלך זלוף, וכדי להפחית את כמות מלוחים בשימוש. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> איור 3. תצוגה חזיתית של זבוב רכוב הזבובים. תמונה זו מראה כיצד זבוב מוגדר הזבובים, ואיך דבק אור ריפוי מוחל סביב ראשו של זבוב (חיצים) כדי ליצור חותם מלוחים הוכחה. אם כל ההדלפות מלוחים ועד החדק של זבוב, אז הניסוי ייכשל. חוט (ראשי חץ) קשור בשלב זה לקיים את חוטם במצב, כך שזה לא retrac לחלוטין<html> טד. אחרת זה היה לחסום את החלק הגחוני יותר SOG ולגרום חפצים ותנועה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> באיור 4. העליונה לאור את הזבובים זבוב גזור. תמונה זו מראה SOG חשיפה של הסרת העור המת הבאה לטוס. הוושט, שריר 16 ו tracheae מחובר למוח, כמו גם נבחרות אוויר שקי גם הוסר כדי למנוע מהם להפריע את המוח, מה שעלול להוביל את החפצים אותות סידן. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> איור 5. מכשיר ניטור. מנגנון זה מורכב מ מיקרוסקופ אולימפוס BX51WI מחובר למערכת מסתובב הדיסק confocal מיקרוסקופ (Improvision), וצד רכוב Nikon SMZ800 מיקרוסקופ. התקנה זו מאפשרת הדמיה חי של פעילות המוח במהלך PER התנהגות. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; איור 6. תמונות להצגה הצדדית של הזבובים. שכבה דקה של תמיסת מלח דחוקה בין עדשת מים לטבילה 40X ו זבוב. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> איור 7. סכמטי להכנת פתיל נייר washi. יפני דקיק-washi הנייר הוא קלף יפני מסורתי שהוא דק מאוד חלקה (Haibara, יפן). הוא גם חזק מאוד והוא יכול לשמור על כמות גדולה של נוזלים. נייר washi יש לחתוך טרפז עם ממדים ספציפיים מאוד, 0.3 מ&quot;מ ו 0.7 מ&quot;מ רוחב, ו - 4-5 מ&quot;מ באורך (א). זה טרפז מוכנס לתוך קצה מחט המזרק G 23 מהצד 0.7 מ&quot;מ ניתן התייצב דרך הכניסה של סיכה חרק, אשר כפופות לצורה-V (ב). ג, נייר הופך washi החשיפה הבאה שקוףלנוזל, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור ניסוי זה. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> איור 8. גירוי של חוטם על לזבובים בעלי הפתיל-washi. הפתיל נייר washi בקצה של מחט המזרק מוחל לרגע באמצעות מניפולטור ג&#39;ויסטיק ביד אחת. המחט מחוברת דרך צינור גמיש כדי ההזרקה מניפולציות עם זאת, עבור aspirating ופריקה פתרון סוכרוז. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> איור 9. נציג תוצאות. ולדירה, התנהגות רשמה באמצעות מצלמת CCD מותקנת סטראו. צפיות הקדמי של זבוב מורעבת עם כ חוטם ארוך (חיצים) לפני גירוי, על גירוי, ואחרי גירוי עם הפתיל המכילה 100 סוכרוז mM מימית פתרון (ראש חץ). תאורה נעשה על ידי לייזר 491 ננומטר שימושעבור GCaMP פלואורסצנטי. ב, סוכרוז הנגרמת GCaMP 3.0 תגובה הנוירון המוטורי של מד הזווית של שריר דוכן במצב הרעבה. הפאנל העליון, לפני גירוי, הפאנל התחתון, מיד לאחר הגירוי. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. ג, כימות בתגובה סוכרוז הנגרמת 3.0 GCaMP. הנוירון המוטורי מגיב לגירוי סוכרוז על ידי גידול חד של הקרינה ואחריו שלב החזרת מספר שניות עד לקו הבסיס.

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li><li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel.">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hungry Fly. , (1976).</li><li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proboscis+Extension+Response+(PER)+Assay+in+Drosophila.">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li><li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category.">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Miller, A., M, D. e. m. e. r. e. c. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-534 (1950).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth.">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; אין לי מה לחשוף.</p

הזבובים מאפשר הקלטה בו זמנית של Ca 2 + האותות והתנהגות למשק. גם עם המוח נחשף להתנהגות מלוחים PER רגיל נצפתה. באמצעות פתיל יפני דקיק-washi במקום הפתיל Kimwipe שימוש method7 נימי המקורי מאפשר התנהגות PER לשחזור מאוד יציבה מונעת את הצורך להיות מיומנים בקבלת ובחירת הפתיל Kimwipe טוב. העצות הניסוי האמור לעיל אפשר לנו בהצלחה למנוע הפרות סדר על ידי תנועה של חוטם, שמוביל הקלטה יציבה מאוד של Ca 2 + אותות עם רעש נמוך. מדי פעם, הסרת הרקמה לא היה די כדי לחשוף תאים או לדכא את התנועה כראוי, מה שמוביל לתוצאות עניים. עם זאת, ברגע שהיינו מיומן, יותר מ 80% של ההכנות הניב תוצאות טובות. מתודולוגיה זו היא לא רק Ca 2 + הדמיה, אבל יכול גם להיות מותאם הדמיה כל חי תוך שמירה על PER התנהגות. לדוגמה, אנו יכולים לגשת לכל תא באמצעותהשימוש אלקטרודות ישירות להקליט פעילות. בשילוב עם מיקרוסקופ שני הפוטונים עירור, אנו מסוגלים לבצע זמן לשגות הדמיה של מבנה סינפטי, מה שיכול להיות קשור לשינויים התנהגותיים. לכן, שיטה זו של הדמיה מוחית עם תצפית התנהגותית היא לא רק ערך לנתיחה פונקציונלי של הרשת העצבית, אך יכול לשמש ככלי רב עוצמה, כדי לקשר בין 14 הפלסטיות הסינפטית את המנגנונים מאחורי הזיכרון.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ציוד / מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar vivadent </td><td> M04115 </td><td> אור ריפוי דבק </td></tr><tr><td> BX51WI מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> BX51WI </td><td> עם עדשת 40X (NA 0.8) טבילה במים המטרה </td></tr><tr><td> ספינינג מערכת confocal דיסק מיקרוסקופ </td><td> Improvision ב PerkinElmer </td><td></td><td> עם לייזר 491 ננומטר </td></tr><tr><td> סטראו </td><td> ניקון </td><td> SMZ-800 </td><td> מחוברת זרוע הנדנדה. צפה סטריאו עדיין זמינה עם הקלטת וידאו </td></tr><tr><td> יפני דקיק-washi נייר </td><td> Haibara, יפן </td><td></td><td> סוג מיוחד של נייר יפני מסורתי </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> הדמיה מקור </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 פיקסלים SONY CCD </td></tr><tr><td> ג&#39;ויסטיק מניפולטור </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

כדי לחקור רשתות נוירונים מבחינת תפקידם בהתנהגות, עלינו לנתח כיצד נוירונים פועלים כאשר כל דפוס התנהגות נוצרת. לפיכך, הקלטות בו זמנית של הפעילות העצבית התנהגות חיוניים, כדי לקשר בין פעילות המוח להתנהגות. עבור ניתוחים התנהגות כאלה, זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מאפשרת לנו לשלב אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית כגון GCaMP 1, כדי לפקח על הפעילות העצבית, ולהשתמש מניפולציות גנטיות מתוחכמות עבור טכניקות optogenetic או thermogenetic באופן ספציפי הפעל זיהו נוירונים 2-5. השימוש בטכניקה thermogenetic הוביל אותנו למצוא נוירונים קריטיים עבור התנהגות האכלה (המבול et al., תחת גרסה). כחלק העיקרי של התנהגות האכילה, בוגר תסיסנית מרחיב חוטם שלה להזנת 6 (בתגובה חוטם הארכה; PER), מגיב לגירוי מתוק מתאי החישה על חוטם שלה או טרסי. שיתוףmbining פרוטוקול PER 7 עם טכניקה סידן באמצעות הדמיה 8 GCaMP3.0 1, 9, הקמתי מערכת ניסיונית, שבה אנו יכולים לעקוב אחר פעילות של נוירונים במרכז האכלה - גנגליון suboesophageal (SOG), בו זמנית עם תצפית התנהגותית של חוטם את. אני עיצבו מנגנון (&quot;המוח פליי חיים הדמיה שלב Electrophysiology&quot;: &quot;זבובים&quot;) כדי להתאים למבוגרים תסיסנית, המאפשר חוטם שלה כדי לנוע בחופשיות תוך המוח שלה חשוף אמבטיה עבור Ca 2 + הדמיה דרך העדשה טבילה במים . הזבובים מתאים גם סוגים רבים של ניסויים חיים על המוח לעוף כמו הקלטה אלקטרו או זמן לשגות הדמיה של מורפולוגיה הסינפטי. כי את התוצאות של הדמיה חיה יכול להיות מתואמים ישירות עם התנהגות PER בו זמנית, מתודולוגיה זו יכולה לספק מערכת ניסיונית מצוינת ללמוד עיבוד מידע של רשתות נוירונים, ואיך זה גפעילות ellular מצמידים לתהליכים פלסטיק זיכרון.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

זבוב הפירות,<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt;, חוטם שלה משתרע על האכלה, להגיב לגירוי סוכר חוטם שלה או שורש הרגל. אני שילבו תצפיות על התגובה הרחבה חוטם (PER) עם טכניקת הדמיה סידן, מאפשר לנו לפקח על הפעילות של הנוירונים במוח, בעת ובעונה אחת עם תצפית התנהגותית.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K Views.  University of Massachusetts Medical School. זבוב הפירות, תסיסנית melanogaster, חוטם שלה משתרע על האכלה, להגיב לגירוי סוכר חוטם שלה או שורש הרגל. אני שילבו תצפיות על התגובה הרחבה חוטם (PER) עם טכניקת הדמיה סידן, מאפשר לנו לפקח על הפעילות של הנוירונים במוח, בעת ובעונה אחת עם תצפית התנהגותית.

Video: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

תאית הקלטה, חושי שדה מיפוי, ונוירונים שזוהו Culturing בעלוקה, Medicinalis Hirudo</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

מדריך ל<em&gt; בשנת vivo</em&gt; הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...