עבודה זו מומנה על ידי קרן ריצ&#39;רד תומס לוקמיה, טאטא ליידי הזיכרון בנאמנות, פארק Northwick החולים קרן נאמנות לוקמיה מחקר במכון הלאומי לבריאות ומחקר (NIHR), בריטניה.

1. פיגום ייצור ביו functionalization של פיגומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמציא פו פיגומים (גודל הנקבוביות 100-250 מ&quot;מ, נקבוביות 90-95%) בצורה של צלחת פטרי דיסקים, השתמש הפרדת פאזות המושרה תרמית 13 תהליך הכנת פתרון פולימר (5wt% ב Dioxan) ואחריו מקפיא לאחר מכן סובלימציה ממס (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הדיסק פיגום לקוביות של 0.5 מ&quot;מ x 0.5 x 0.5 לפני ציפוי עם ECM חלבונים (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להרטיב את הפיגומים על ידי שיקוע שלהם אתנול (70%) עבור 1 דקות ולאחר מכן להעביר את הפוספט בופר סליין (PBS) עבור 20 דקות. אז סרכזת דקות 10 XG ב 3630 ולהוסיף את הפתרון חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה פיגומים בתמיסה חלבון XG 1420 עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לבטל את חסימת הנקבוביות על פני השטח, ולאפשר את התאים שנזרעו לחדור עמוק יותר לתוך הפיגום, צנטריפוגה הפיגומים פעם נוספת על XG 910 דקות 10ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הפיגומים באמצעות שילוב של חשיפה 8 דק &#39;ב 230 וולט, 50 הרץ, 0.14 מנורה, UV, עם טבילה עבור H 2 באתנול (70%). לאחר מכן לשטוף את הפיגומים פעמיים PBS לפני הוספת שינוי Iscove של Dulbecco בינוני (IMDM) השלימו עם סרום 30% שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין (P / S). מניחים את הפיגומים של חממה humidified במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני השימוש. פיגומים סטריליים ממוקמים מספר 24 היטב רקמות צלחות תרבות (1 פיגום בכל טוב). </li></ol> 2. תא בידוד mononuclear ו זריעת הפיגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ אדם MNC מן הדם הטבורי או הנגועים דגימות מח עצם, באמצעות Ficoll-Paque שיפוע צפיפות צנטריפוגה (35 דק &#39;ב 1500 סל&quot;ד) (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend MNC ב IMDM המכיל 30 FBS% ו 1% P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 100μl של השעיה MNC (2 × 10 6 תאים / הפיגום) על גבי פיגומים באמצעות מיקרו פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פיגומים seeded על 37 מעלות צלזיוס מתחת CO 5% 2 במשך 10 דקות עבור התאים ליישב את הפיגומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה את כל טוב עם 1.5 מ&quot;ל של IMDM המכיל 30% FBS וצלחות גם 1% P / S ומקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את הפיגומים זרע לעבור שינוי יומי של כל מדיה. </li></ol> 3 ב התפשטות תאים באתרו ומורפולוגיה. MTS, SEM ו Cytospins <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay MTS: הסר מתרבות אחת בלתי seeded ושני פיגומים זרע ומכניסים 24 החדש נקי היטב את הצלחת. הוסף 1 מ&quot;ל של מדיה 200 μl של פתרון MTS ו דגירה של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 100 x 8 דגימות μl של supernatant: המקום בצלחת 96-היטב ספיגת מידה ב 490 ננומטר באמצעות קורא microplate. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM): בנקודות זמן שונות של התרבות ה &#39;, להסיר את הפיגומים שנזרעו עם MNC מהתקשורת, ולתקן את הפתרון 2.5%-PBS שנאגרו glutaraldehyde 40 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיובש על פיגומים בסדרה מדורג של אתנול (25, 50, 70, 80, 90, 95, ו - 100%), כל אחד 10 דקות ויבש בסביבה מזוהם במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מקטעים ולאחר מכן גמגום, מעיל אתם זהב באווירה ארגון 2 דקות קודם להערכה SEM, השתמש במתח האצה של kV 20. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytospins: איסוף 2.0 x 10 4 תאים / שקופיות ידי aspirating את התאים מן הפיגום בנקודות זמן שונות בתרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה תאים על גבי זכוכית נושאת דקות 3 בסל&quot;ד 1500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם על השקופיות עם רייט Giemsa כתמים השתנה ולבחון באמצעות מיקרוסקופ אופטי. F-להציג מערכת הדמיה רך ניתן להשתמש כדי לצלם תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק לפני תצפית מיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> M<html> ניתוח ultiphoton: פיגומים תקן בנקודות זמן שונות עם אדי אתנול (70%) למשך הלילה, ואז יבש החנות ב -20 ° C עד לניתוח נוסף. לפני להדמיה סעיף מיקרוסקופ multiphoton הפיגום לתוך 30 מיקרומטר בעובי שקופיות ורטוב עם PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום פיגומים seeded ב PBS עם סרום 10% שור עוברית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פיגומים את הלילה על 4 מעלות צלזיוס בחושך עם דילול 1:50 של נוגדן חד שבטי העיקרית: העכבר CD71 אדם אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות שלוש פעמים PBS ואת הכתם עם נוגדנים משני: אנטי העכבר Alexa פלואוריד 488 עבור H 1 בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות שלוש פעמים עם PBS ולבחון באמצעות מיקרוסקופ confocal באמצעות פליטת מים X60 עדשה אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorophore Alexa פלואוריד 488 נרגש על 488 ננומטר על ידי לייזרים pulsatile. 5.3.2 התוכנה Volocity ניתן להשתמש ניתוח התמונה לאחר מכן. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. ניתוח תזרים Cytometric של האוכלוסייה נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח הסלולר cytometer את זרימת (FC), לתייג את התאים בעלי עניין עם נוגדנים immunofluorescence המתאימים לצורך זיהוי. מספר דגימות ערוכים לפי הנוגדנים שנבחרו לצורך זיהוי. לגילוי MNC השילוב הבא של נוגדנים משמשים: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התאים מן הפיגום בנקודות זמן שונות צנטריפוגות. ממיסים תא גלולה של כ 1x10 6 תאים במאגר FC 100 μl (אזיד הנתרן PBS + 0.1%) ומוסיפים 10 μL של צבע פלואורסצנטי כל נוגדן. דגירה התאים למשך 30 דקות ב 4 ° C, לשטוף פעמיים עם PBS ולבסוף מחדש להשעות במאגר FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם לתוך צבעונית cytometer הזרימה עם שליטה isotype להגדיר &quot;השליליות&quot; של הביטוי נוגדנים ו לכייל את ערוצי גילוי עם בקרת זרימה cytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוא צבעונית מדגם W<html> ith שלושת נוגדנים שונים ובסופו של דבר מייצגים את הנתונים באמצעות תוכנה WinList. </li></ol> 5. נציג תוצאות למשל hematopoietic של קינטיקה הצמיחה הסלולר ללא תוספת של גורמי גדילה חיצוניים מוצגת באיור 2. בשל אופייה הטרוגנית של hematopoiesis, שני תאים שונים: רגילים ותאי היווצרות הדם תקינות באים לידי. איור 2 א, התרבות תאים של CBMNC האנושי בא לידי ביטוי לאחר 28 ימים בתרבית. 2B איור מראה את הקינטיקה הצמיחה באמצעות חיקוי אדם תאים leukemic ראשוניים. התרבות תאים נבחנת באמצעות assay MTS אשר מודד את פעילות חילוף החומרים התאי ביחס ספיגת. בשני המקרים, התאים התרבו והקימו במודל. הבדלים קינטיקה הצמיחה הם נצפו: היווצרות הדם לתאים נורמליים מקימים התרבות מהר יותר מאשר תאים leukemic. &quot;_content&gt; מורפולוגיה של תאים שנקטפו גם לאחר 28 ימים של תרבות בהעדר גורמי צמיחה חיצוניים היה אופייני של היווצרות הדם תאים נורמליים (איור 3 א) ו תאים leukemic (איור 3 ב). חלקים מרכזיים של פיגומים נותחו על ידי SEM לאחר הפיגומים הוסרו מן התרבות והראה התפשטות התאים זרע לאורך הפיגום, לבסס את עצמם בקבוצות וכן &quot;נישה כמו&quot; מבנים (איור 3 א &#39;&amp; ב&#39;). תרשים ג מציג את פיזור גודל הנקבוביות ב unseeded הפיגום משמש כביקורת. מיקרוסקופיה multiphoton לאחר 28 ימים שימש להדגיש את חלוקת התאים בתוך הפיגום 3D באתרו והוא הראה את הנוכחות של erythroid איים בסעיפים המרכזיים של הפיגום (איור 4) על ידי ביטוי של הסמן CD71 שהוא חיובי erythroblasts. זה מוכיח את החשיבות של דו בוגרים ותאי התבגרותטבעת erythropoiesis. לבסוף, cytometry זרימה גרפים של זריעת תאים לפני מראה את ההבדל הפנוטיפ של תאים היווצרות הדם, שבו ציור 5a מייצג היווצרות הדם תאים נורמליים: CBMNCs אדם איור 5 ב &#39;ממחיש את היווצרות הדם תאים לא תקינים: תאים leukemic ראשוניים. רמות CD235a + ו + CD45 המתאים אריתרוציטים ו Leukocytes בהתאמה גבוהות יותר מדגם הרגיל מאשר leukemic המדגיש את הטבע hemoblastic של לוקמיה את. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig1.jpg" /> באיור 1. איור של התהליכים המעורבים PU פיגום ייצור ביו functionalization. א) פו הוא מומס Dioxan (5wt%) ועל ידי תהליך המושרה תרמית שלב ההפרדה סובלימציה ממס לאחר הפיגום מיוצר, כפי שתואר על ידי Safinia ואח&#39; 13. ב) דיסק הפיגום אז הוא חתך intהו קוביות של 0.5 x 0.5 x 0.5 מ&quot;מ ואז מצופה ידי צנטריפוגה עם תוספת הסלולר מטריקס (ECM) חלבונים. ג) MNC המחולצים הטבור CB אדם או השאיפה בע&quot;מ באמצעות שיפוע צפיפות צנטריפוגה ו seeded (2x10 6 תאים / הפיגום) על פיגומים PU עם micropipette. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig2.jpg" /> 2. איור התרבות תאים נמדדת באמצעות assay MTS:) באמצעות אדם דם טבורי MNCs, ב &#39;) באמצעות אדם תאים leukemic ראשוניים. העמודים להראות את הצמיחה של תאים לאורך זמן כאשר זרע של פיגומים PU ללא תוספת של ציטוקינים חיצוניים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig3.jpg" /> איור 3: מורפולוגיה תא והפצה ברחבי פיגומים באמצעות cytospins, scanniנג micrographs אלקטרונים. (AB) נציג רייט Giemsa cytospins צבעונית של מספר תאים) דם טבורי mononuclear שנאספו PU פיגומים לאחר 28 ימים של תרבות, ב) שאיפות עצם תאים leukemic שנאספו PU פיגומים לאחר 14 ימים של תרבות. שני הניסויים בוצעו במצב ציטוקינים חינם. (A&#39;-B &quot;) קטעים מרכזיים נציג של הפיגום micrographs יחידת השיטור של SEM) seeded דם טבורי MNCs ו &#39;ב&#39;) תאים leukemic לאחר בתרבית במשך 28 ימים, ו-C) שליטה פיגום עם תאים לא. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig4.jpg" /> איור 4. מיקרוסקופ multiphoton של פיגום PU seeded עם דם טבורי לאחר MNCs ד 28 בתרבות צבעונית עם סמן erythroid CD71. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig5.jpg" /> איור 5. תזרים cytometry 3D הדוט מגרשים מוכתם עבור CD45, CD71 וביטוי CD235a סמנים פני השטח. השליטה isotype לקבל מוצגת גם השוואה של עוצמת הקרינה היחסית. לוח מראה אדם דם טבורי תאים mononuclear חיוביות עבור סמנים ומעלה: ב &#39;לוח מראה האדם תאים leukemic ראשוניים.

<ol>
	<li>Orkin, S., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li><li>Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+find+their+niche.">Stem cells find their niche.</a> Nature. 414, 98-104 (2001).</li><li>Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+mimicry+of+bone+marrow+tissue+ex+vivo.">Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo.</a> J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).</li><li>Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+osteoclasts+in+a+three-dimensional+bone+marrow+culture+system.">Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system.</a> Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+bioprocessing:+fundamentals+and+principles.">Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles.</a> J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).</li><li>Dexter, T., Testa, N., Prescott, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 14, 387-405 (1976).</li><li>Piacibello, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+growth+factor+requirement+of+primitive+cord+blood+hematopoietic+stem+cell+for+self-renewal+and+amplification+vs+proliferation+and+differentiation.">Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation.</a> Leukemia. 12, 718-727 (1998).</li><li>Yoshida, T., Takagi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+processing+engineering+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+cells:+a+review.">Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review.</a> Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).</li><li>Lim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intelligent+bioprocessing+for+haemotopoietic+cell+cultures+using+monitoring+and+design+of+experiments.">Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments.</a> Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).</li><li>Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+three-dimensional+scaffold+for+ex+vivo+biomimicry+of+human+acute+myeloid+leukaemia.">The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia.</a> Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).</li><li>Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cytokine-free+expansion+of+cord+blood+mononuclear+cells+in+three-dimensional+scaffolds.">Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds.</a> Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).</li><li>Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+methodology+for+the+effective+surface+modification+of+porous+polymer+scaffolds.">Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

המערכת לשעבר vivo 3D התרבות המוצגת כאן מאפשרת לנו להקים ביומימטיקה 3D של hematopoiesis זה מסכם את הארכיטקטורה BM המקורי פנוטיפ הסלולר העצמאי של ציטוקינים חיצוניים. מודל 3D מספק את המבנה microenvironment המאפשרת היווצרות הדם לתאים נורמליים נורמלי להתרבות בתנאים דומים לאלה נתקל viv...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioxan</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D20,186-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12440-053</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>49624</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WG32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10108-165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD71</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>74895</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD71-PE</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>555537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235a-PE-Cy5</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>555570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo mimicry of normal and abnormal human hematopoiesis

בתאי גזע hematopoietic דורשים microenvironment ייחודי כדי לקיים תא דם היווצרות 1, מח עצם (בע&quot;מ) הינו קומפלקס תלת ממדי (3D) hematopoiesis שבו רקמת מוסדר על ידי microenvironments הסלולר מאורגנים במרחב כינה נישות 2-4. הארגון של נישות בע&quot;מ היא קריטית לתפקוד או חוסר תפקוד של BM רגיל או ממאיר 5. לכן הבנה טובה יותר של ב microenvironment vivo באמצעות חיקוי vivo לשעבר יעזור לנו להבהיר את הגורמים המולקולריים, תאית microenvironmental של leukemogenesis 6. נכון לעכשיו, תאים היווצרות הדם מתורבתים במבחנה ב דו מימדי (2D) תרבות צלוחיות רקמות / גם שלטי 7 הדורשים או שיתוף עם התרבות allogenic או תאים סטרומה xenogenic או תוספת של ציטוקינים אקסוגניים 8. תנאים אלה הם מלאכותיים שונים in vivo </eמ &#39;&gt; microenvironment בכך שהם חסרים את נישות הסלולר 3D ולחשוף את התאים לריכוזים ציטוקינים גבוהות באופן חריג אשר עלולה לגרום בידול ואובדן 9,10 pluripotency. כאן, אנו מציגים מח עצם רומן 3D התרבות מערכת המדמה בסביבת הגידול 3D vivo ותומך hematopoiesis multilineage בהעדר גורמי צמיחה חיצוניים. פיגום נקבובי ביותר בשימוש במערכת זו עשוי פוליאוריטן (PU), מאפשר צפיפות גבוהה צמיחת תאים על פני שטח גבוהה יותר משטח ספציפי מאשר התרבות monolayer קונבנציונאלי ב 2 ד 11. העבודה שלנו ציינה כי מודל זה נתמך על צמיחה של דם טבורי האנושי (CB) תאים mononuclear (MNC) 12 תאים leukemic העיקריים בהיעדר ציטוקינים חיצוניים. זה חיקוי הרומן 3D מספק פלטפורמה מעשית עבור פיתוח של מודל ניסיוני האדם ללמוד hematopoiesis ולבחון טיפולים חדשניים בסרטן הדם.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis at JoVE.com

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

מערכת התרבות 3D עבור hematopoiesis מתואר באמצעות דם טבורי האדם הנגועים מוח העצם. השיטה מבוססת על שימוש פוליאוריטן נקבובי הפיגום הסינתטי מצופה חלבונים תאי מטריקס. פיגום זה ניתנת להתאמה להכיל מגוון רחב של תאים.

Ex vivo החקיינות של hematopoiesis אנושיים בריאים חריגה

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

ex-vivo-mimicry-of-normal-and-abnormal-human-hematopoiesis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

15.4K Views.  Imperial College London. מערכת התרבות 3D עבור hematopoiesis מתואר באמצעות דם טבורי האדם הנגועים מוח העצם. השיטה מבוססת על שימוש פוליאוריטן נקבובי הפיגום הסינתטי מצופה חלבונים תאי מטריקס. פיגום זה ניתנת להתאמה להכיל מגוון רחב של תאים.

Video: Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, each offering its own advantages and shortcomings5,6. Most prominently, due to the microscale device dimensions, a high modulus is required to facilitate implantation into living tissue. Conversely, the stiffness of the device should match the surrounding tissue to minimize induced local strain7-9. Therefore, we recently developed a new class of bio-inspired materials to meet these requirements by responding to environmental stimuli with a change in mechanical properties10-14. Specifically, our poly(vinyl acetate)-based nanocomposite (PVAc-NC) displays a reduction in stiffness when exposed to water and elevated temperatures (e.g. body temperature). Unfortunately, few methods exist to quantify the stiffness of materials in vivo15, and mechanical testing outside of the physiological environment often requires large samples inappropriate for implantation. Further, stimuli-responsive materials may quickly recover their initial stiffness after explantation. Therefore, we have developed a method by which the mechanical properties of implanted microsamples can be measured ex vivo, with simulated physiological conditions maintained using moisture and temperature control13,16,17. 
To this end, a custom microtensile tester was designed to accommodate microscale samples13,17 with widely-varying Young's moduli (range of 10 MPa to 5 GPa). As our interests are in the application of PVAc-NC as a biologically-adaptable neural probe substrate, a tool capable of mechanical characterization of samples at the microscale was necessary. This tool was adapted to provide humidity and temperature control, which minimized sample drying and cooling17. As a result, the mechanical characteristics of the explanted sample closely reflect those of the sample just prior to explantation.
The overall goal of this method is to quantitatively assess the in vivo mechanical properties, specifically the Young's modulus, of stimuli-responsive, mechanically-adaptive polymer-based materials. This is accomplished by first establishing the environmental conditions that will minimize a change in sample mechanical properties after explantation without contributing to a reduction in stiffness independent of that resulting from implantation. Samples are then prepared for implantation, handling, and testing (Figure 1A). Each sample is implanted into the cerebral cortex of rats, which is represented here as an explanted rat brain, for a specified duration (Figure 1B). At this point, the sample is explanted and immediately loaded into the microtensile tester, and then subjected to tensile testing (Figure 1C). Subsequent data analysis provides insight into the mechanical behavior of these innovative materials in the environment of the cerebral cortex.

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

A method is discussed by which the in vivo mechanical behavior of stimuli-responsive materials is monitored as a function of time. Samples are tested ex vivo using a microtensile tester with environmental controls to simulate the physiological environment. This work further promotes understanding the in vivo behavior of our material.

בדיקת Microtensile לסביבה מבוקרת של nanocomposites הפולימר מכאני-מסתגל ל<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; אפיון

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

הדמיה גידים קולגן המפוגל<em&gt; בvivo</em&gt; ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; באמצעות הכלאה-מופעל על תמונה של Caged קולגן כוזב פפטידים

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a key hemodynamic parameter related to cerebral oxygen supply. Resting state low frequency fluctuations based on oxygenation contrast have been shown to provide correlations between functionally connected regions. The presented protocol uses optical diffuse correlation spectroscopy (DCS) to assess blood flow-based resting state functional connectivity (RSFC) in the human brain. Results of CBF-based RSFC in human frontal cortex indicate that intra-regional RSFC is significantly higher in the left and right cortices compared to inter-regional RSFC in both cortices. This protocol should be of interest to researchers who employ multi-modal imaging techniques to study human brain function, especially in the pediatric population.

This protocol demonstrates how to measure resting state functional connectivity in the human prefrontal cortex using a custom-made diffuse correlation spectroscopy instrument. The report also discuss practical aspects of the experiment as well as detailed steps for analyzing the data.

מוחין זרימת דם מבוסס על המצב מנוחה קישוריות תפקודית של המוח האנושי באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם אופטי לפזר

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. However, manual control of various equipment produced by different manufacturers is labor-intensive and time-consuming, potentially decreasing the accuracy, reproducibility, and quality of acquired data. Therefore, an all-in-one and user-programmable system that enables automatic, multi-functional, and long-term image acquisition and is compatible with most fluorescent microscopy platforms can benefit the scientific community. This paper introduces the complete operating protocols of utilizing a novel integrated software system that consists of (1) a home-built software program, titled "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)," which enables automatic multi-channel imaging acquisition, and (2) a suite of quantitative imaging analysis and cell traction computation packages. 
This integrated system is applied to reveal the previously unknown relationship between the spatial-temporal distribution of mechano-sensitive Yes-associated protein (YAP) and the cell mechanics, including cell spreading and traction, in CRISPR/Cas9-engineered human normal cells (B2B) and lung cancer cells (PC9). Leveraging this system's capability of multi-channel control and readout, the result shows: (1) B2B normal cells and PC9 cancer cells show a distinct relationship between YAP expression, traction, and cell dynamics during cell spreading and migration processes; and (2) PC9 cancer cells apply noticeable peri-nuclear forces on substrates. In summary, this paper presents a detailed stepwise protocol on how to utilize an integrated user-programmable system that enables automatic multi-functional imaging and analysis to elucidate YAP mechano-sensitivity. These tools open the possibility for detailed explorations of multifaceted signaling dynamics in the context of cell physiology and pathology.

This paper presents a detailed stepwise protocol on how to utilize an integrated multi-functional and user-programmable system that enables automatic multi-channel imaging and mechanobiological analysis to elucidate the mechano-sensitivity of Yes-associated protein (YAP).

חקירה מכנוביולוגית כל אופטית של חלבון הקשורים כן בסרטן אנושי ותאים רגילים באמצעות מערכת רב תפקודית

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. ...

ביוריאקטור חדשני מודפס בתלת-ממד לתרבית Ex Vivo של כלי דם בזילוח

Ex Vivo Perfusion Culture of Large Blood Vessels in a 3D Printed Bioreactor

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious surgical and pharmacological interventions to prevent and treat vascular disease are urgently needed. In part, the shortage of translational models limits the understanding of the cellular and molecular processes involved in vascular disease. Ex vivo perfusion culture bioreactors provide an ideal platform for the study of large animal vessels (including humans) in a controlled dynamic environment, combining the ease of in vitro culture and the complexity of the live tissue. Most bioreactors are, however, custom manufactured and therefore difficult to adopt, limiting the reproducibility of the results. This paper presents a 3D printed system that can be easily produced and applied in any biological lab, and provides a detailed protocol for its setup, enabling users&#39; operation. This innovative and reproducible ex vivo perfusion culture system enables the culture of blood vessels for up to 7 days in physiological conditions. We expect that adopting a standardized perfusion bioreactor will support a better understanding of physiological and pathological processes in large animal blood vessels and accelerate the discovery of new therapeutics.

מחבר זרקור: EasyFlow - ביוריאקטור זילוח חסכוני וניתן להתאמה לתרבית כלי דם גדולים 

This protocol presents the setup and operation of a newly developed, 3D printed bioreactor for the ex vivo culture of blood vessels in perfusion. The system is designed to be easily adopted by other users, practical, affordable, and adaptable to different experimental applications, such as basic biology and pharmacological studies.

אקס ויוו תרבית זילוח של כלי דם גדולים בביוריאקטור מודפס בתלת-ממד

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious ...