이 작품은 리처드 토마스 Leukaemia 기금, 레이디 타타 기념관 신탁, Northwick 공원 병원 Leukaemia 연구 신탁 기금 및 건강 연구의 국립 연구소 (NIHR), 영국에 의해 재정 지원되었다.

1. 공사장 공중 발판의 발판 제조 및 바이오 작용화 <ol><li> 배양 접시 디스크의 형태로 우레탄 공사장 공중 발판 (기공 크기 1백~2백50밀리미터, 다공성 90~95%)를 조작하려면 다음 폴리머 솔루션 (Dioxan에서 5wt %)를 준비하여 열 유도된 상 분리에게 13 프로세스를 사용하여 동결 이후 용매 승화 (그림 1A). </li><li> ECM 단백질 (그림 1B)와 코팅 이전 0.5 X 0.5 X 0.5 mm의 조각으로 발판 디스크를 자르고. </li><li> 다음 1 분 및 인산으로 전송을 위해 에탄올 (70 %)에서 그들을 immersing하여 사전 서부 유럽 표준시 공사장 공중 발판은 20 분 동안 (PBS) 염분 버퍼. 그렇다면 3,630 XG에 10 분 동안 원심 분리기와 단백질 솔루션을 추가합니다. </li><li> 20 분 대한 1,420 XG에서 단백질 용액에 공사장 공중 발판을 원심 분리기. </li><li> 표면 모공 차단을 해제하고, 발판에 깊이 침투하는 놓는 세포를 허용하기 위해서는 10 분 동안 910 XG에 한 번만 더 공사장 공중 발판 원심 분리기PBS 인치 </li><li> 에탄올 2 H (70 %)에 대한 침수와 230 V, 50 Hz에서, 0.14, 자외선 램프,시 8 분 노출의 조합을 사용하여 공사장 공중 발판을 소독. 그 후, 30 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1퍼센트 페니실린과 스트렙토 마이신 (P / S)와 함께 보충 Iscove의 수정일 Dulbecco 중간 (IMDM)를 추가하기 전에 PBS로 두 번 공사장 공중 발판을 씻는다. ° C에서 5 % CO 2는 이전에 사용하기 37 3 일간 humidified 인큐베이터에서 공사장 공중 발판을 놓으십시오. 멸균 공사장 공중 발판은 24 잘 조직 배양 플레이트 (물론 당 하나 비계)에 배치됩니다. </li></ol> 2. Mononuclear 세포 분리 및 비계를 심는 <ol><li> Ficoll-Paque 밀도 기울기 원심 분리 (1500 rpm으로 35 분) (그림 1C)를 사용하여, 코드 혈액 또는 leukemic 골수 샘플로부터 인간 MNC의 압축을 풉니다. </li><li> IMDM의 Resuspend MNC 30 % FBS와 1 % P / S.를 포함하는 </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 공사장 공중 발판쪽으로 MNC 서스펜션의 종자 100μl (2 × 10 6 세포 / 비계). </li><li> 공사장 공중 발판으로 정착하는 세포에 대해 10 분 동안 5 % CO 2 하에서 37 ° C에서 씨앗을 품고 공사장 공중 발판을 품어. </li><li> 37시 인큐베이터 30 % FBS와 1 % P / S와 장소도 접시를 포함 IMDM 1.5 ML 각 잘 더더 이동 ° C와 실험 기간 동안 5퍼센트 CO 2. </li><li> 씨앗을 품고 공사장 공중 발판은 모든 미디어 일일 변경될 받고있다. </li></ol> 3 원위치 세포 증식과 형태론의 경우 :. MTS, SEM 및 Cytospins <ol><li> MTS 분석 : 문화 한 해제 번시드인하고 깨끗한 24 개의 새 항목 잘 플레이트에서 두 씨앗을 품고 공사장 공중 발판과 장소에서 제거합니다. 미디어 1 ML 37에서 MTS 솔루션 및 3 시에위한 품어 200 μl를 추가 ° C에서 5 % CO 2. <ol><li> microplate 판독기를 사용하여 490 nm의시 96 - 웰 플레이트 및 측정 흡광도에서 개최하며 뜨는에서 8 X 100 μl 샘플을 가져가라. </li></ol></li><li> 일 중 다른 시간 시점 : 전자 현미경 (SEM)을 스캔전자 문화, 미디어에서 MNC로 놓는 공사장 공중 발판을 제거하고 4에 40 분 2.5 % PBS 버퍼 글루 타 알데히드 용액 ° C로 고정 후 PBS로 두 번 씻는다. <ol><li> 탈수 4 시간 동안 무균 환경에서 10 분 건조를위한 에탄올의 등급 시리즈 (25, 50, 70, 80, 90, 95 및 100 %), 각각의 공사장 공중 발판. </li><li> 섹션 표본 후 사전 SEM 평가 2 분 아르곤 분위기 속에서 금을 스퍼터 코팅 그들은 20 kV의 가속 전압을 사용합니다. </li></ol></li><li> Cytospins : 문화에서 다른 시간 시점에서 발판에서 세포를 aspirating하여 2.0 X 10 4 세포 / 슬라이드를 수집합니다. <ol><li> 1,500 RPM에서 3 분 유리 슬라이드에 세포를 원심 분리기. </li><li> 라이트-Giemsa 수정된 청바지와 광학 현미경을 사용하여 관찰과 함께 슬라이드를 청바지. 소프트 이미징 시스템은 사진을 찍는하는 데 사용할 수있는 F-봅니다. </li><li> 현미경 관찰 이전 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol></li><li> M<html> ultiphoton 분석 : 자세한 분석 시까지 -20시 에탄올 증기 (70 %) 숙박 후 건조하고 매장 ° C와 다른 시간 지점에서 픽스 공사장 공중 발판. 이전 multiphoton 현미경의 30 μm의 두께의 슬라이드로 섹션 비계 및 PBS와 젖은와 시각화합니다. <ol><li> 상온에서 30 분 10 % 태아 소 혈청으로 PBS에 씨앗을 품고 공사장 공중 발판을 차단합니다. </li><li> 마우스 안티 인간 CD71를 : ° C ~ 어둠 속에서 기본 단클론 항체의 1시 50분 희석과 4에서 공사장 공중 발판이 하룻밤 사이에 알을 품다. </li><li> PBS에서 샘플을 세 번 씻고 이차 항체에 얼룩 : 어둠의 실온에서 1 H를위한 안티 마우스 알렉사 형석 488. </li><li> PBS로 샘플을 세 번 씻고 물 방출 x60 목표 렌즈를 사용 공촛점 현미경으로 관찰합니다. </li><li> 형광단 알렉사 형석 488은 타악기 레이저로 488 nm의에서 흥분한다. Volocity 5.3.2 소프트웨어는 이후의 이미지 분석에 사용될 수 있습니다. </li></ol></li></ol>세포 인구 &quot;&gt; 4 jove_title. 흐름 Cytometric 분석 <ol><li> 흐름 cytometer (FC)의 세포 분석하기 전에 검출에 해당 immunofluorescence 항체와 관심 세포에 라벨을 달고. 샘플의 수를 검출을위한 선택된 항체에 따라 준비가되어 있습니다. MNC 검출 항체의 경우 다음과 같은 조합이 사용됩니다 : CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5. </li><li> 다른 시간 지점과 원심에 있던 발판에서 세포를 기음. 100 μl FC 완충액 (PBS + 0.1 % 나트륨 azide)에서 6 1x10 주변 세포의 세포 펠렛를 해산하고 각 항체 형광 색소의 10 μL를 추가합니다. 4에 30 분 ° C에 대해 세포를 품어, PBS로 두 번 씻어 마침내 FC 버퍼에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 항체 표현의 &quot;부정적&quot;를 설정하고 흐름 cytometer 컨트롤과 함께 검출 채널을 교정 isotype 제어 흐름 cytometer의 스테인드로 샘플을로드합니다. </li><li> 샘플 스테인드 w 읽기<html> 세 가지 다른 항체 ith 그리고 마지막 WinList 소프트웨어를 사용하는 데이터를 나타냅니다. </li></ol> 5. 대표 결과 외인성 성장 요인 이외없이 조혈 세포 성장 속도론의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 조혈의 이질적인 성격, 서로 다른 두 가지 세포로 인해 : 정상과 비정상 조혈 세포는 그림하고 있습니다. 그림 2A에서 인간 CBMNC의 세포 증식은 문화가 28 일 후에 분명하다. 그림 2B는 인간의 기본 leukemic 세포를 사용하여 흉내의 성장 속도론을 보여줍니다. 세포의 증식은 흡광도와 관련하여 세포 신진 대사 활동을 측정하는 MTS 분석을 사용하여 평가된다. 두 경우 모두, 세포가 확산하고 모델에서 설립. 성장 속도론의 차이가 관찰되며, 문화를 구축 정상 조혈 세포를 빠르게 leukemic 세포보다. 공사장 공중 발판의 _content &quot;&gt; 외인성 성장 요인 부재의 문화의 28 일 정상 조혈 세포 (그림 3A)와 leukemic 세포 (그림 3B)의 전형이었다 후에도 수확 세포의 형태. 중앙 부분은 후 SEM으로 분석되었다 공사장 공중 발판은 문화에서 제거하고 클러스터에와 &quot;틈새 같은&quot;구조 (그림 3A &#39;&amp; B&#39;)에서 자신을 설립, 발판에 걸쳐 씨앗을 품고 세포의 확산을 보여주되었다. 그림 C는 보여준다 unseeded의 기공 크기와 분포 비계는 컨트롤로 사용됩니다. 28일 후 Multiphoton 현미경은 원래의 장소에 3D 발판 내에서 세포의 분포를 강조하기 위해 사용하고 마커의 표현에 의해 (그림 4) 비계의 중앙 섹션에 erythroid 섬의 존재를 보여주되었다 erythroblasts에 긍정적이다. CD71 이것은 성숙하고 성숙 세포 뒤의 중요성을 증명링 적혈구 조혈. 인간 CBMNCs 및 그림 5B 비정상 조혈 세포 설명 : 기본 leukemic 세포를 마지막으로, 세포 사전 시딩의 유동세포계측법 그래프는 그림 5A가 정상 조혈 세포를 대표하는 조혈 세포의 표현형의 차이를 보여줍니다. CD235a의 수준 + 및 CD45 + 각각 leukemias의 hemoblastic 성격을 강조 leukemic보다 일반적인 샘플에 높은 있습니다 적혈구 및 leukocytes에 대응. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig1.jpg" /> 그림 1. 우레탄 발판 제조 및 바이오 작용화에 관련된 프로세스의 삽화. ) 우레탄은 Dioxan (5wt %)에 녹아 있으며, 열 유도된 상 분리 공정 및 후속 용매 승화하여 발판 Safinia 외 13에서 설명한 바와 같이, 생산하고 있습니다. B) 비계 디스크는 다음 INT 절단되어O 장치의 큐브 0.5 X 0.5 엑스트라 셀룰러 매트릭스 (ECM) 단백질과 원심 분리에 의해 코팅 X 0.5 mm 후. C) MNC는 인간의 탯줄 CB이나 micropipette으로 밀도 구배 원심 분리 및 우레탄 공사장 공중 발판에 씨앗을 (2x10 6 셀 / 비계)를 사용 BM 흡출됨으로써 압축이 풀립니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig2.jpg" /> . 그림 2 세포 증식은 MTS 분석을 사용하여 측정 :) 인간의 탯줄 혈액 MNCs 사용하는 인간의 기본 leukemic 세포를 사용하여) B를. 외인성 크린 시토킨의 추가없이 우레탄 공사장 공중 발판에 놓는 때 열은 시간에 따른 세포의 성장을 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig3.jpg" /> 그림 3 : 공사장 공중 발판 주위 세포 형태학 및 유통이 scanni를 cytospins를 사용하여NG 전자 micrographs. (AB) 문화의 28 일 후에 우레탄 공사장 공중 발판에서 수집한) 코드 혈액 mononuclear 세포의 대표 라이트-Giemsa 스테인드 cytospins 및 B) 뼈 aspirated leukemic 세포 문화 날로부터 14 일 후 우레탄 공사장 공중 발판에서 수집했습니다. 두 실험 시토킨 자유로운 상태로 진행​​되었다. (A&#39;-B &#39;)) 씨앗을 품고 코드 혈액 MNCs와 B&#39;) 28 일 동안 배양해 거쳐 leukemic 세포없이 세포와 C) 제어 비계의 우레탄 발판 SEM의 micrographs 대표 중앙 섹션 &#39;. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig4.jpg" /> 그림 4. erythroid 마커 CD71과 문화와 스테인드 28 D 후 탯줄 혈액 MNCs와 우레탄 발판 씨앗의 Multiphoton의 현미경. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig5.jpg" /> 그림 5. 유동세포계측법 3D 도트 플롯은 CD45, CD71 및 CD235a 표면 발현 마커에 대해 묻다. 얻은 isotype 컨트롤도 상대 형광 강도의 비교를 위해 제공됩니다. 패널은 위의 마커에 대한 긍정적인 인간 코드 혈액 mononuclear 세포를 보여줍니다, 패널 B는 인간의 기본 leukemic 세포를 보여줍니다.

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우리는 공개 할게 없다.

여기서 제시 전직 생체내 3D 문화 시스템은 우리가 조혈의 3D biomimicry를 확립 수 있도록 그 recapitulates 원래 BM 건축과 외인성 크린 시토킨의 독립 세포 표현형. 3D 모델은 구조와 정상 및 비정상 조혈 세포가 생체내에 발생한 것과 유사한 조건에서 분아 따위에 의해 중식 수 microenvironment를 제공합니다. 고분자 비계 재료의 선택 biomimicry 디자인에 중요한 단계를 나타...

<table><tbody><tr><td>Dioxan</td><td>Invitrogen</td><td>D20,186-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Invitrogen</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>MTS</td><td>Promega Corp.</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Fluka</td><td>49624</td><td></td></tr><tr><td>Wright-Giemsa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WG32</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>CD71</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-32272</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>74895</td><td></td></tr><tr><td>CD71-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>CD235a-PE-Cy5</td><td>BD Biosciences</td><td>555570</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo mimicry of normal and abnormal human hematopoiesis

골수 (BM)은 spatially 조직 세포 microenvironments에 의해 규제되는 복잡한 입체 (3D) 조직이 어떤 점에서의 조혈입니다 틈새에게 2-4 되나, 조혈 줄기 세포는 혈액 세포 형성 1을 유지하기 위해 독특한 microenvironment를 필요로합니다. BM 틈새의 조직은 정상 또는 악성 BM 5의 기능 또는 기능 장애에 중요합니다. 따라서 전직 생체내의 흉내를 사용하여 생체내 microenvironment에의 이해 우리 leukemogenesis 6, 분자 세포 및 microenvironmental determinants을 명료하게하다 도움이 될 것이다. 현재 조혈 세포 중 allogenic 또는 이종 개체의 stromal 세포와 공동의 문화 또는 외인성 크린 시토킨 8의 추가 요구 (2D) 2 차원의 조직 문화 flasks / 잘 접시 7에서 체외에서 배양해 있습니다. 이러한 조건 인공 있으며 생체내에 따라 다를 </eM&gt;은 3D 휴대폰 틈새 시장이 부족하고 pluripotency 9,10의 분화 및 손실을 초래할 수있는 비정상적으로 높은 시토킨 농도로 세포를 노출 점에서 microenvironment. 여기, 우리는 생체내 3D 성장 환경에서을 시뮬레이션 및 외인성 성장 요인 부재에 multilineage의 조혈을 지원하는 새로운 3D 골수 배양 시스템을 제시한다. 폴리 우레탄 (PU)으로 만들어진이 시스템에 사용되는 높은 다공성 발판은 2D 11에서 기존의 단일층 문화보다 높은 특정 표면 영역에 걸쳐 고밀도 세포 성장을 용이하게합니다. 우리의 연구는이 모델은 인간의 탯줄 혈액 (CB) mononuclear 세포 (MNC) 외인성 크린 시토킨의 부재에서 12 일차 leukemic 세포의 성장을 지원하는 것을 시사하고있다. 이 소설 차원 흉내는 조혈을 연구하고 백혈병에 대한 새로운 치료법을 탐구하는 인간의 실험적인 모델의 개발을위한 실행 가능한 플랫폼을 제공합니다.

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Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

조혈을위한 3D 문화 시스템은 인간 코드 혈액과 leukemic 골수 세포를 사용하여 설명합니다. 방법은 세포외 기질 단백질로 코팅 다공성 합성 폴리 우레탄 발판의​​ 사용을 기반으로합니다. 이 발판은 세포의 광범위한 수용하는 적응이다.

정상과 비정상적인 인간 조혈의 전직 생체내 흉내

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

15.4K 조회수.  Imperial College London. 조혈을위한 3D 문화 시스템은 인간 코드 혈액과 leukemic 골수 세포를 사용하여 설명합니다. 방법은 세포외 기질 단백질로 코팅 다공성 합성 폴리 우레탄 발판의​​ 사용을 기반으로합니다. 이 발판은 세포의 광범위한 수용하는 적응이다.

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular niches modulating critical hematopoietic stem cell (HSC) functions1,2. Indeed, a more detailed picture of the hematopoietic microenvironment is now emerging, in which the endosteal and the endothelial niches form functional units for the regulation of normal HSC and their progeny3,4,5. New studies have revealed the importance of perivascular cells, adipocytes and neuronal cells in maintaining and regulating HSC function6,7,8. Furthermore, there is evidence that cells from different lineages, i.e. myeloid and lymphoid cells, home and reside in specific niches within the BM microenvironment. However, a complete mapping of the BM microenvironment and its occupants is still in progress.
Transgenic mouse strains expressing lineage specific fluorescent markers or mice genetically engineered to lack selected molecules in specific cells of the BM niche are now available. Knock-out and lineage tracking models, in combination with transplantation approaches, provide the opportunity to refine the knowledge on the role of specific &#34;niche&#34; cells for defined hematopoietic populations, such as HSC, B-cells, T-cells, myeloid cells and erythroid cells. This strategy can be further potentiated by merging the use of two-photon microscopy of the calvarium. By providing in vivo high resolution imaging and 3-D rendering of the BM calvarium, we can now determine precisely the location where specific hematopoietic subsets home in the BM and evaluate the kinetics of their expansion over time. Here, Lys-GFP transgenic mice (marking myeloid cells)9 and RBPJ knock-out mice (lacking canonical Notch signaling)10 are used in combination with IVFM to determine the engraftment of myeloid cells to a Notch defective BM microenvironment.

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital fluorescence microscopy (IVFM) of the calvarium is applied in combination with genetic animal models to study the homing and engraftment of hematopoietic cells into bone marrow (BM) niches.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

연구

발생학

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>방사선 조사된 마우스에서 효과적인 HSCT를 위한 골오가노이드 유래 세포

In Vivo Osteo-organoid Approach for Harvesting Therapeutic Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an adequate source of HSPCs, we developed an in vivo osteo-organoid by implanting scaffolds loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into an internal muscle pouch near the femur in mice. After 12 weeks of implantation, we retrieved the in vivo osteo-organoids and conducted flow cytometry analysis on HPSCs, revealing a significant presence of HSPC subsets within the in vivo osteo-organoids.
We then established a sublethal model of hematopoietic/immune system injury in mice through radiation and performed hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) by injecting the extracted osteo-organoid-derived cells into the peripheral blood of radiated mice. The effect of hematopoietic recovery was evaluated through hematological, peripheral blood chimerism, and solid organ chimerism analyses. The results confirmed that in vivo osteo-organoid-derived cells can rapidly and efficiently reconstruct damaged peripheral and solid immune organs in irradiated mice. This approach holds potential as an alternative source of HSPCs for HSCT, offering benefits to a larger number of patients.

<meta charset="utf8"></head><body>치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

Here, we established in vivo osteo-organoids triggered by bone morphogenetic protein-2-loaded gelatin scaffolds to harvest therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells for the reconstruction of a damaged hematopoietic and immune system. Overall, this approach can provide a promising cell source for cell therapies.

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an ...

정상과 비정상적인 인간 조혈의 전직 생체내 흉내

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Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO 적혈구 조혈

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법