Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.

העכברים המשמשים בעבודה זו טופלו ויטופלו בהתאם להנחיות של מועצת האיחוד האירופית (86/609 / איחוד אירופי) לשימוש בחיות מעבדה. .1 הכנת פתרונות הנדרשים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 10x פולי-L-ornithine (אש&quot;ף): לשקול את 10 מ&quot;ג hydrobromide אש&quot;ף (משקל מולקולרי = 30,000-70,000) ולפזר ב70 מ&quot;ל של מים סטריליים. סנן את הפתרון באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן מזרק, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30% פתרון גלוקוז: לשקול את 30 גרם של D (+) - גלוקוז ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ&quot;ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני של 5x השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) / תערובת מזין F-12 חם: לשקול את 6 גרם של אבקת DMEM / F-12 חם ומתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ&quot;ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7.5% סודיום ביקרבונט (NaHCO 3) Solutiב: לשקול את 7.5 גרם של NaHCO 3 ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ&quot;ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M HEPES פתרון: לשקול את 23.8 גרם של HEPES ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ&quot;ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול 70% (v / v): לדלל 70 מ&quot;ל של אתנול מוחלט עם 30 מ&quot;ל של מים סטריליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בופר פוספט עם גלוקוז ואנטיביוטיקה (PBS-GAB): להוסיף 10 מ&quot;ל של 30% פתרון גלוקוז ו5 מ&quot;ל של תמיסת פניצילין, סטרפטומיצין 500 מ&quot;ל של בופר פוספט של Dulbecco. חנות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומת בסרום שור עוברי (iFBS): להפשיר בסרום שור הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס ולהשבית ב56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Aliquot לתוך 50 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בינונית: במים סטריליים, לערבב ברציפות 40 מ&quot;ל של 5x DMEM / F12-שינקין, 1 מ&quot;ל של 1 M HEPES, 2 מ&quot;ל של 200 מ&quot;מ L-גלוטמין, 2 מ&quot;ל של פניצילין, סטרפטומיצין, 4 מ&quot;ל של 30% גלוקוזnd 3 מ&quot;ל של .7.5% NaHCO 3 עד נפח סופי של 180 מ&quot;ל. לסנן ולהשתמש באותו היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההורמון Mix <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 180 מ&quot;ל של מדיום התרבות. לפזר 200 מ&quot;ג של apo-transferrin במדיום זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 50 מ&quot;ג של אינסולין ולהתמוסס ב2 מ&quot;ל של 0.1 M HCl. לאט להוסיף 8 מ&quot;ל של מים סטריליים תוך ערבוב בעדינות. לדלל את הפתרון הזה במדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 19.3 מ&quot;ג של Putrescine dihydrochloride ולהתמוסס ב10 מ&quot;ל של מים סטריליים. מוסיף את הפתרון 10 מ&quot;ל לתערובת ההורמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 3 מ&quot;מ selenite נתרן במים סטריליים ופתרון פרוגסטרון 2 מ&quot;מ באתנול מוחלט. הוסף 20 μl של כל פתרון לתערובת ההורמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את תערובת ההורמון, aliquot לתוך 10 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2 הכנת פלטות תרבות ומכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FBS ציפוי של צלחות התרבות: היום לפני הנתיחה, להכין 180 מ&quot;ל של מדיום התרבות. הוסף 10 מ&quot;ל שלiFBS 90 מ&quot;ל של מדיום התרבות. הוסף 300 μl / גם של מדיום התרבות / 10 iFBS% ל24 גם צלחות Precoated פולי-D-ליזין. דגירה הלילה בשעה 37 C °. אחסן את המדיה שנותרה (עם ובלי iFBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המכשירים וטפטפות פסטר. אסוף את הציוד מפורט בטבלת חומרים, כמו גם זרימה למינרית Class II וCO 2 באינקובטור. </li></ol> .3 Dissection של העכבר mesencephalon <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר בהריון E13.5 (על פי הנחיות מוסדיות). נקה את הבטן של העכבר עם 70% אתנול ולפתוח את קיר הבטן. לאסוף את קרן הרחם, לפתוח אותם באמצעות מספריים עדינים, לנתח כל עובר מקרני הרחם, ולהסיר את הקרומים מי השפיר. מניחים את העוברים בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ המכילה PBS-GAB סטרילי ולשטוף אותם על ידי העברה ב3 אמבטיות זהות רצופות באמצעות מלקחיים. לנתיחה, למקם את העוברים על ידי 3 בצלחת פטרי סטרילית 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Movדואר צלחת פטרי הסופי תחת סטראו. אל לערוף את העוברים. בעזרת המספריים Vannas, תחתוך את המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות ולבטל את האזורים הקדמיים והמוח אחוריים. לצד מקורי, לחתוך קרוב לאזור התלמוס, לצד קיצוץ הזנב באזור המצר, להסיר את colliculus מעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמוח תיכון הגחון מבודד, להסיר בזהירות קרומי המוח באמצעות מלקחיים יפים במיוחד. לאסוף קטעים גזורים, ללא קרומי המוח, בצינור 13 מ&quot;ל סטרילי המלא PBS-GAB. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הצינור המכיל mesencephala ביסודיות עם אתנול 70% ולהביא אותו מתחת למכסת המנוע. </li></ol> דיסוציאציה .4 הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף mesencephala 3x עם PBS-GAB סטרילי. לאפשר שברי המוח ליישב בין כל שטיפה ולהימנע מלשבש את הרקמה. לאחר לשטוף האחרון, להסיר בזהירות רב כפתרון שאפשר לדגור מגזרי מוח ב 3 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA ל15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש פולנית טפטפות פסטר על מנת למקסם את ההישרדות של תאי העצב כמו הסוף של pipet זכוכית שאינה מלוטשת היא חד ויכולה לגרום נזק לתאים במהלך שלבי הניתוק. מעט להפחית את קוטר הגפיים (עד 0.5 מ&quot;מ) של פיפטה פסטר תוך אש וליטוש לזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות כמה שפתרון / EDTA טריפסין ככל האפשר ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. מגזרי המוח לשטוף 3x עם iFBS מדיום התרבות / 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה פסטר האש מלוטשת, מתחיל ניתוק של mesencephala ב6 מ&quot;ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. Triturate 10x (למנוע בועות אוויר), לאפשר לנתחים להתיישב, ואז לאסוף את המדיום בצינור מ&quot;ל 13 סטרילי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 6 מ&quot;ל של מדיום התרבות, חזור על השלב הקודם פעם אחת ולאסוף את המדיום המכיל תאים ניתקו באותו הצינור 13 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב160 גרם במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים במדיום התרבות בתוספת10% תמהיל הורמון. </li></ol> .5 נייד ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים בתרחיף בתא Malassez ולהתאים את עוצמת הקול של מדיום לריכוז של 600,000 תאים / מ&quot;ל. ניתן להשיג בסביבות 1,700,000 תאים מmesencephalon עכבר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר FBS המכיל מדיום ציפוי מ24 גם צלחות ולהוסיף בכל טוב 1 מ&quot;ל של השעיה תא (600,000 תאים / היטב, 2-4% מTH + תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2/95% אוויר. אין שינוי מדיום הוא הכרחי. נוירונים דופאמין בשלים לאחר סביב 5-7 ימים במבחנה (ביטוי עקבי של טרנספורטר דופאמין). שמור את התאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית. </li></ol> פרוטוקול .6 Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי של Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני הנתיחה, להוסיף 10 מ&quot;ל של 1 M HCl לתוך צלחת פטרי. הנח על פני השטח של coverslips הזכוכית הנוזלי 12-15 ולחכות 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקוע הכיסוילהחליק לתוך הנוזל והמתן 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר HCl ולשטוף 3x עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips במהירות עם אתנול טהור פעם אחת, ולאחר מכן להוסיף אתנול טהור למאכל ולחכות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע, להסיר coverslips ניקה מאתנול ולהוסיף coverslip 1 לכל טוב של צלחת תרבית תאי 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips פעמיים עם מים סטריליים (1 מ&quot;ל / טוב). לאחר מכן, לשטוף אותם פעם עם PBS סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 2x אש&quot;ף (בדילול מלא PBS). דגירה של 4 שעות ב 37 ° C בחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון אש&quot;ף ולשטוף 3x עם PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 20 iFBS% / 1 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​Laminin. דגירה הלילה בשעה 37 ° C בחממת CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי התאים לImmunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ציפוי מ12 גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 900,000 תאים / היטב ב2 מ&quot;ל נפח ולגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה. יכולים להיות כל הזמן תאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מ12 גם צלחות ולשטוף עם 500 μl / גם DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl / גם של DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף paraformaldehyde עדינות 160 μl / גם של 8% (PFA, 2% ריכוז סופי) ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PFA ולשטוף 3x עם PBS / 0.1 M גליצין עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS, להוסיף / טוב של PBS / 0.05% טריטון X-100/20% בסרום עיזים 300 μl ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדן הראשוני מדולל PBS / 0.05% ודגירה של 2 שעות בטמפרטורת חדר. נוגדנים עיקריים שיכול לשמש לזיהוי של נוירונים דופאמין ואפיון של התרבות מצוינים בטבלת חומרים. שמור1 גם בלי נוגדן ראשוני על מנת להעריך לרקע של הנוגדנים משני השונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג&#39;לטין עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדנים משני בדילול המלא PBS / 0.05% ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, בחושך. נוגדנים משני המשמשים מצוינים בטבלת חומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג&#39;לטין עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips בצד תא שקופיות זכוכית למטה בירידה של Vectashield. שמור את השקופיות בלילה טמפרטורת חדר כדי לתת לי בינונית יבש ההרכבה, לאחר מכן לאחסן אותם ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ שלב בניגוד מצויד לepifluorescence. נציג תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SP2 UV. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+transmission+in+the+striatum.">Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum.</a> Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).</li><li>Iversen, S. D., Iversen, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+50+years+in+perspective.">Dopamine: 50 years in perspective.</a> Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).</li><li>Dahlstroem, A., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Existence+of+Monoamine-Containing+Neurons+in+the+Central+Nervous+System+I.+Demonstration+of+Monoamines+in+the+Cell+Bodies+of+Brain+Stem+Neurons.">Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons.</a> Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).</li><li>Chinta, S. J., Andersen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons.">Dopaminergic neurons.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).</li><li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+systems+in+the+brain:+an+update.">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li><li>Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons:+a+review+of+the+molecular+circuitry+that+regulates+their+development.">Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development.</a> Dev Biol. 379, 123-138 (2013).</li><li>Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 363, 1783-1793 (2004).</li><li>Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mTOR+signaling+in+Parkinson's+disease+prevents+L-DOPA-induced+dyskinesia.">Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia.</a> Sci Signal. 2, (2009).</li><li>Ohlin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+upregulated+by+L-dopa+in+the+parkinsonian+brain:+implications+for+the+development+of+dyskinesia.">Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia.</a> Brain. 134, 2339-2357 (2011).</li><li>Obeso, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+Parkinson's+disease+puzzle.">Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle.</a> Nat Med. 16, 653-661 (2010).</li><li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson's+disease.">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li><li>Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+needs+of+dopamine+neurons+for+stimulation+in+order+to+survive:+implication+for+Parkinson+disease.">Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease.</a> FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).</li><li>Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NURR1+in+Parkinson+disease-from+pathogenesis+to+therapeutic+potential.">NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. , (2013).</li><li>Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+of+the+center+median-parafascicular+complex+of+the+thalamus+has+efficient+anti-parkinsonian+action+associated+with+widespread+cellular+responses+in+the+basal+ganglia+network+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).</li><li>Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">Pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28, 24-30 (2013).</li><li>di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+striatal+cells+on+in+vitro+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurones+grown+in+serum-free+conditions.">Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions.</a> Nature. 288, 370-373 (1980).</li><li>Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+heterogeneity+may+define+the+three-dimensional+shape+of+mouse+mesencephalic+dopaminergic+neurones.">Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones.</a> Nature. 307, 641-643 (1984).</li><li>Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+on+the+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons.">In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).</li><li>Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+toxicity+toward+cultured+mesencephalic+dopaminergic+neurons+is+induced+by+the+synergistic+effects+of+energetic+metabolism+impairment+and+NMDA+receptor+activation.">A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation.</a> J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).</li><li>Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+in+culture+by+low-level+stimulation+of+voltage-gated+sodium+channels.">Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels.</a> J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).</li><li>Toulorge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+of+midbrain+dopamine+neurons+by+nicotine+is+gated+by+cytoplasmic+Ca2.">Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2.</a> FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).</li><li>Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Iron-Binding+Protein+Lactoferrin+Protects+Vulnerable+Dopamine+Neurons+from+Degeneration+by+Preserving+Mitochondrial+Calcium+Homeostasis.">The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis.</a> Mol Pharmacol. 84, (2013).</li><li>Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitriol+imparts+neuroprotection+in+vitro+to+midbrain+dopaminergic+neurons+by+upregulating+GDNF+expression.">Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression.</a> PLoS One. 8 (e62040), (2013).</li><li>Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+I+inhibition+is+not+required+for+dopaminergic+neuron+death+induced+by+rotenone,+MPP+,+or+paraquat.">Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).</li><li>Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mouse+models+of+neurodegenerative+diseases.">Genetic mouse models of neurodegenerative diseases.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).</li><li>Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+microglial+NADPH+oxidase-derived+free+radicals+in+the+in+vitro+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease.</a> FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Parkinson's+disease-related+mutant+alpha-synuclein+in+the+midbrain+dopaminergic+neurons+causes+progressive+neurodegeneration+and+degradation+of+transcription+factor+nuclear+receptor+related+1.">Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1.</a> J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).</li><li>Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+dating+of+midbrain+dopamine+neurons+identifies+A9+enriched+tissue+for+transplantation+into+parkinsonian+mice.">Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice.</a> Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).</li><li>Ramonet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neuronal+loss,+reduced+neurite+complexity+and+autophagic+abnormalities+in+transgenic+mice+expressing+G2019S+mutant+LRRK2.">Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2.</a> PLoS One. 6 (e18568), (2011).</li><li>Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+axon+guidance:+which+makes+what.">Dopaminergic axon guidance: which makes what.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li><li>Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitx3+is+required+for+development+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).</li><li>Ferri, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxa1+and+Foxa2+regulate+multiple+phases+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development+in+a+dosage-dependent+manner.">Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner.</a> Development. 134, 2761-2769 (2007).</li><li>Rayport, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+postnatal+mesolimbic+dopamine+neurons+in+culture:+morphology+and+electrophysiology.">Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology.</a> J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).</li><li>Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+GABA+receptors+in+cultured+substantia+nigra+neurons:+correlation+of+electrophysiology+and+immunocytochemistry.">Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 78, 759-769 (1997).</li><li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lmx1a+allows+context-specific+isolation+of+progenitors+of+GABAergic+or+dopaminergic+neurons+during+neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+expression+of+Cdh2+is+essential+for+efficient+neural+differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מציג את הנהלים וחומרים כימיים הדרושים כדי להכין את התרבות העיקרית של נוירונים mesencephalic מהעכבר העוברי והליך immunofluorescence לזהות נוירונים דופאמין. שלבים קריטיים של ההליך הם לנתיחה של העוברים והניתוק המכני של שברי המוח שנאספו. מכשירים לנתיחה באיכות גבוהים מסיי?...

דופמין, אחד מהמוליכים העצביים במוח החיוני 1,2, בעיקר שפורסם על ידי דופאמין המוח התיכון הנוירונים (DA). רוב הנוירונים DA מתגוררים בחלק הגחוני של mesencephalon 2-6. סכמטי, ניתן לחלק את תאי עצב DA המוח התיכון בשלוש מבחינה אנטומית ותפקודי של מערכות שונות הקרנה: mesostriatal, mesolimbic, ומסלולי mesocortical 2,5. מסלול nigrostriatal מעורב במנוע התנהגות, מסלולי mesolimbic לשחק תפקיד חשוב בחיזוק, מוטיבציה, ולמידה, ואילו מסלולי דופאמין מקרינים לקליפת מוח הקדם חזיתית הם מעורבים בקוגניציה 2. נוירונים DA מעורבים בכמה הפרעות נוירולוגיות אדם כמו סכיזופרניה, קשב וריכוז, הפרעת פעילות יתר, והמחלה (PD) פרקינסון 2,4. PD מתאפיין בניוון מתקדם וסלקטיבי של תאי עצב DA חיבור nigra substantiacompacta Pars (SNC) לסטריאטום. הפסד של תוצאות נוירונים DA Nigro-striatal בדלדול הדופמין החמור בסטריאטום, כי הוא אחראי לתסמינים המוטוריים של מחלת הפרקינסון (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות) 7. הגורם הראשוני לPD אידיופטית לא הוקם והטיפולים הנוכחיים הם רק סימפטום, במטרה להחזיר את רמת הדופמין בסטריאטום. התרופה המומלצת ביותר היא L-דופא (Levodopa), המבשר הטבעי של דופמין. למרות שהממשל של Levodopa מפצה על האובדן של דופאמין למשך פרק זמן מסוים, סיבוכים מוטוריים להתרחש לאחר טיפולים ארוכי טווח (dyskinesia והפעלה / כיבוי מדינות) 8,9. מחקר על נוירונים דופאמין ופ&quot;ד הוא בהתקדמות מתמדת ומאמצים אינטנסיביים נעשים כדי לפתח טיפולים הבוסס על השתלת תאים, ריפוי גנטי, או סוכני הגנה עצביים 10,11. עם זאת, נושא מרכזי נשאר לא הובהר: מה הוא הגורם של vulnerab הקיצוניility של נוירונים DA? ניתן למצוא חלק מהתשובה בפעילות של תאי עצב DA. נראית ירידה בפעילות החשמלית ושל הרגישות של תאי עצב DA כדי להגדיל את נטייתם להידרדר 12. אף על פי כן, את המורכבות של הפתוגנזה פ&quot;ד דורשים מחקרים נוספים על מנת לזהות את המנגנונים מעורבים בDA נוירונים ניוון 13-15. תרבויות עיקריות רלוונטיות במיוחד ללמוד תכונות תא עצב DA 16-19 ולקרוא תיגר על הנוירונים האלה ללחצים שונים להערכה של סוכני הגנה עצביים 20-24. מודלים תרבות עכברוש משמשים בתדירות הגבוהה ביותר, כפי שהנתיחה של mesencephalon עובר עכברוש היא קלה יותר, בהשוואה לעכבר, וניתן לקבל כמויות גדולות יותר של תאי עצב בחולדות. עם זאת, דור של דגמי עכבר מהונדסים של המחלה 25 יש מידה ניכרת הגדיל את האינטרס של קהילת מדען המוח לתרבויות עיקריות מהעכבר 26-29. למרות שתרבויות יחסי ציבורepared מבעלי חיים שזה עתה נולדו יכול לשמש, עדיף להכין אותם מעוברים בשלב שלאחר mitotic (E13.5 לנוירונים mesencephalon), כאשר נוירונים שמרו היכולת שלהם להבחין. הפרוטוקול הבא מציג נוירונים mesencephalon מבודדים בתרבות העיקרית מעוברי עכברים (E13.5), שהם קשים ביותר להכנה. יש לציין, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות מדיום סרום ללא תרבות לשחזור טוב יותר. שני השלבים הקריטיים ביותר בהכנת התרבות (לנתיחה וניתוק מכאני) שיפורטו בזהירות בווידאו קשור.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1291">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D0547</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Laminin - 1 mg/mL in Tris buffered NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-Ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">I5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">H4034&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">G7126</td>
			<td>Stock solution 1M in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">G9391</td>
			<td>Stock solution 2% (w/v) in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% in water</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:139px;">RT 15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:139px;">106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D(+)-Glucose, Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>4074-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:139px;">109057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Sterile water - Aqua B. Braun</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:139px;">20821.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Sterile Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Counting chamber Malassez</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:139px;">631-0975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 &#181;m, 37 mm</td>
			<td>PALL Life science</td>
			<td style="width:139px;">4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>To open the abdominal wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long</td>
			<td style="width:176px;">MORIA</td>
			<td>4877A</td>
			<td>To open the uterine wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm</td>
			<td style="width:176px;">MORIA</td>
			<td>2183</td>
			<td>To manipulate embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades</td>
			<td style="width:176px;">MORIA</td>
			<td>MC50</td>
			<td>To take out the mesencephalon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long</td>
			<td style="width:176px;">MORIA</td>
			<td>9987</td>
			<td>To remove meninges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td style="width:139px;">356414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td style="width:139px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90&#186;</td>
			<td>MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td style="width:139px;">AG00008032E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm &#216;</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody</td>
			<td>Chemicon Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2</td>
			<td>Chemicon Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt&#160;</td>
			<td>Chemicon Millipore</td>
			<td>MAB369</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum, New Zealand Origin</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">A-31556</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td>A-11007</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy</td>
			<td>Stemi-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Bunsen Burner FIREBOY</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">451-0136</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of mouse dopaminergic neurons

נוירונים דופאמין מהווים פחות מ -1% מהמספר הכולל של תאי עצב במוח. סכום זה נמוך של תאי עצב מווסת את תפקודי מוח חשובים כגון שליטה מוטורית, מוטיבציה, וזיכרון עבודה. נוירונים דופאמין Nigrostriatal להידרדר באופן סלקטיבי במחלת פרקינסון (PD). איבוד עצבי מתקדם זה קשור באופן חד משמעי עם הסימפטומים מנועים של פתולוגיה (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות שרירים ו). הסוכן העיקרי האחראי לניוון תא עצב דופאמין הוא עדיין לא ידוע. עם זאת, נוירונים אלה מופיעים להיות מאוד פגיעים בתנאים מגוונים. תרבויות עיקריות מהוות אחד המודלים הרלוונטיים ביותר לחקור תכונות ומאפיינים של נוירונים דופאמין. ניתן להגיש תרבויות אלה לסוכני מתח שונים המחקים פתולוגיה PD ותרכובות הגנה עצביות על מנת לעצור או להאט את הניוון עצבי. מודלים רבים מהונדסים העכבר של PD כי כבר generated בעשור האחרון גדל עוד יותר את האינטרס של חוקרים לתרבויות נוירון דופאמין. הנה, פרוטוקול הווידאו מתמקד בנתיחה העדינה של מוח עכבר העוברי. כריתה מדויקת של mesencephalon הגחון היא חיונית כדי להשיג תרבויות עצביות מספיק עשירות בתאי דופאמין כדי לאפשר מחקרים עוקבים. פרוטוקול זה יכול להתממש עם עכברים הטרנסגניים עובריים ומתאים לצביעת immunofluorescence, PCR כמותי, כימות שליח שני, או הערכת מוות / הישרדות עצבית.

תרשים זרימה מאוירת של צעדי תרבות mesencephalon מוצג באיור 1. בקצרה, לאחר איסוף עוברי E13.5 מעכבר שוויצרי בהריון, mesencephalon הגחון הוא גזור מכל העובר. שברי המוח המבודדים הם ברציפות שהוגשו לעיכול אנזימטי וניתוק מכאני. תאים ניתקים הם pelleted על ידי צנטריפוגה, resuspended במדיום התרב...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons at JoVE.com

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

primary-culture-of-mouse-dopaminergic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

37.3K Views.  Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier. Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Video: Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.