עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט RO1DC002756 ואת המחקר Purdue קרן. אנו מודים דוריס וו צ&#39;אנג ויזה לייעוץ עם ניסויים רודני McPhail לעזרה עם דמויות.

מתכונים צ&#39;יק האצבעות <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 7.2 גרם </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0.23 גר &#39; </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0.37 גר &#39; </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0.115 גרם </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 מ&quot;ל </td><td> מים (תרבות כיתה רקמות) </td></tr></tbody></table> הערה: התאמת ה-pH ל -7.4. תביאו נפח סופי 1000 מ&quot;ל עם מים. 10X PBS <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 40 גרם </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1 גרם </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7 גרם </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1.2 גרם </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 מ&quot;ל </td><td> DEPC מים </td></tr></tbody></table> הערה: התאמת ה-pH ל -7.4. תביאו הסופי<html> נפח 500 מ&quot;ל מים. ריכוז עבודה (1X) נעשית על ידי דילול המניות חלק 1 10X עם 9 חלקים של מים רקמות תרבות כיתה, כגון זה שהושג עם מערכת הקרנה Millipore UV כדי לייצר מים עם מוליכות MΩ 18 ס&quot;מ. SAG בינוני explant מחזיק <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMEM/F12 עם L-גלוטמין, 10 Hepes mM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינסולין 10%, העברת, סלניום (1 ​​ITS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% עט סטרפטוקוקוס </li></ul> Explant בינוני תרבות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SAG בינוני explant מחזיק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ng / ml Neurotrophin-3 (NT-3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ng / ml גורם neurotrophic ריסי (CNTF) </li></ul> חוט השדרה לנתיחה ובינוניים מחזיק <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-15 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% עגל בסרום עוברי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% עט סטרפטוקוקוס </li></ul> לדגור על הביצים 37-38 ° C. לעקר לנתח בכלים צלחת Sylgard לנתח באתנול 70%. הביתור צלחות וכלים יכול להיות גם UV לעקר לילה. &gt; 1. הכנה ביד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום חרוזים microtube עם 1 מ&quot;ל סטרילי PBS, לערבב, ולחכות החרוזים להתיישב אל החלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים כמה פעמים על ידי הסרת supernatant לאחר חרוזים יש מיושב resuspend ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את החרוזים מטוהרים חלבון (בדילול מלא PBS) או PBS לבד (Control) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החרוזים PBS ולאחסן בצלחת 24-היטב עם 1ml PBS עד ממוקם קולגן. </li></ol> 2. הגנגליון Statoacoustic לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב E4 להסיר את העובר מן הביצה ומניחים אותו בצלחת חומוס עם פתרון של Ringer להסרת קרומים עובריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העובר בצלחת פטרי Sylgard © מרופדת מלא HBSS קר עמדת העובר על צידו עם שלפוחית ​​otic פונה כלפי מעלה. פין העובר על צלחת באמצעות סיכות לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שתי סיכות לנתח, לעשות חתך אופקי דרך העור הגחון מידשקיות התעלה, כ איפה זה פוגש את צינור שבלול. ביצוע חתך אנכי הקדמי ואת האחורי לשקוע. שימוש במלקחיים או סיכה להרים לנתח ולהסיר את קפל העור גובל שלושה חתכים. הערה: SAG ממוקם בקצה anteroventral של otocyst, בערך באמצע הדרך בין כיס הגבי המופיעה בקלות עם תאורה בסיס brightfield, ואת צינור שבלול הגחון אשר פרויקטים ventromedially והוא מוסתר על ידי הקשתות בלוע. מתארך כל כך דביק שבלול מימד dorsoventral שלה יהיה להגדיל בהדרגה על E4 בין המבורגר, המילטון בשלבים 23-25 ​​ספטמבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את otocyst בכיוון האחורי כדי להפריד אותו SAG. לעקור הרקמה שמסביב SAG עם סיכות לנתיחה ובזהירות להסיר את SAG מן העובר באמצעות מלקחיים # 55. הסר חתיכות גדולות של רקמה mesenchymal וצרורות עצבים מבצבצת SAG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה רחב הפה pipet, העברת explant ל24 גם צלחת עם explant 0.5 מ&quot;ל SAG מחזיק בינוני. שמור explants על הקרח או בטמפרטורת החדר עד 4 שעות. </li></ol> 3. חוט השדרה לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העובר E6 מן הביצה ומניחים בצלחת חומוס המכיל פתרון של Ringer. הסר את הראש ואת הקרומים העובריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הגוף Sylgard © מאכל המכיל לנתח לנתיחה קר חוט השדרה בינוני. מיקום הסיכה העובר &quot;את הגחון&quot; ואת הזנב מול הנסיין. המקום סיכות לנתח דרך כל איבר עד סוף הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים ו / או לנתח סיכות, בזהירות להסיר עור ורקמות, נע לכיוון הגחון, עד פני השטח הגבי של חוט השדרה גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קו האמצע הגבי של חוט השדרה עם סיכה לנתח, ב האחורי לכיוון הקדמי, לאורך כל אורכו של חוט השדרה. זה יוצר &quot;ספר פתוח&quot;, כמו את הצדדים הימני והשמאלי של חוט השדרה נפרדת. </li><li&gt; הסרת הרקמה שמסביב, רוחבית, על מנת לבודד את חוט השדרה ולחשוף את הגרעינים השורש הגבי (DRG). הסר את DRG ואת קרומי המוח על ידי שפשוף סיכה לנתח או מלקחיים בין DRG חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוט השדרה מן הגוף על ידי מחזיק את קצה הזנב ביותר של חוט השדרה עם מלקחיים והרמת למעלה מן הנסיין. הסר DRG הנותרים קרומי המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק קצה אחד של חוט השדרה עם מלקחיים (או להצמיד אותו בצלחת) ולהשתמש מספריים Vannas לחתוך לאורך קו האמצע הגחון, כדי לחצות את חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק קצה אחד של explant עם מלקחיים כדי לשתק את רקמות להשתמש במספריים Vannas לחתוך explants קטנות (100-500 אממ אורך) לאורכו של הרקמה. צלחת בקומה יכול להיות מוכר עיבוי ברורה של רקמות לאורך קצה אחד explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קצה הפה רחב pipet להעביר explants לצלחת גם 24 עם בינוני לנתיחה מ&quot;ל 0.5 קר. שמור explants על קרח כדי לשמור על הכדאיות רקמות, ואו עד 4 שעות. </li></ol> 4. Explant תרבות עם חלבונים מטוהרים לבחון היענות neurite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון קולגן צינור חרוטי 15 מ&quot;ל, על הקרח, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הפתרון קולגן יש pH של 7-7.4 באמצעות נייר אינדיקטור pH. התאם את ה-pH ע&quot;י הוספת NaOH ב 1 כרכים μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת explants לצלחת 24 גם באמצעות פה רחב pipet טיפ לשאוב נוזל עודף. Explants מרובים יכול להיות מתורבת אחד טוב, אבל צריך להיות ממוקם לפחות 500 מיקרומטר אחד מהשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של קולגן אל הבאר המכילה את explant. מקם את explant על פני השטח התחתון של הבאר. הקפידו להגדיר כל תרבות לחלוטין לפני שתמשיך גם כי קולגן הבא יתחיל לפלמר בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת התרבות על 37 ° C שקופיות חם 30-45 דקות עד לפלמר קולגן. כאשר הקולגן יש polymerized זה יהיה דומה ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל תרבות explant חם בינוני בתוספת או חלבונים מטוהרים (בדילול מלא PBS) או PBS (Control) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. השפעות על תוצאה neurite צריך להיות גלוי על ידי 24 שעות. הערה: השתמשנו באותו פרוטוקול כדי explants SAG תרבות עד 42 שעות. </li></ol> 5. Explant שיתוף תרבות עם חלבון מצופים חרוזים לבדוק תוצאה neurite כיוונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין בצעדים תרבות explant 4.1-4.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet, העברת 1-5 חרוזים מן PBS אל היטב המכיל את פתרון קולגן explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים למצב חרוזים 5-50 מיקרומטר מקצה explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על 37 ° C שקופיות חם 30-45 דקות עד לפלמר קולגן. הרקמה או חרוז עשוי להפוך העקורים כפי הקולגן polymerizes. בדוק את תרבויות מחדש לתפקיד רקמות וחרוזים במשך 5 דקות הראשונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ &#39;אני SAG מדיה זה טוב דגירה למשך 24 שעות. </li></ol> 6. ויזואליזציה של תוצאה neurite ידי אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף תרבויות PBS ולתקן שעה 1 בטמפרטורת החדר paraformaldehyde 4% ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את הג&#39;לים מחומות בארות על ידי התחקות מסביב לקצה של הג&#39;לים עם סיום מעוגל של מרית טפלון מיקרו. בצע את immunostain עם ג&#39;לים של בארות. יש לשטוף מספר פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בפתרון 0.5 מ&quot;ל חסימה (10% נסיוב עגל, 0.1% טריטון X-100, אזיד הנתרן 0.1% ב PBS) לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של נוגדנים 0.5 העיקרי מ&quot;ל (אנטי-β טובולין נוגדן מדולל 1:500 בחסימת פתרון) לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף מספר פעמים PBS. דגירה של נוגדנים 0.5 מ&quot;ל משני (אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר נוגדנים IgG 2b מדולל 1:500) לילה ב 4 ° C. מתוך שלב זה קדימה, לשמור על צלחות בחושך או לעטוף בנייר כסף, בשל הרגישות של אורמשני נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף מספר פעמים PBS ולאחסן ב 4 ° C ב PBS עד שבוע אחד. </li></ol> 7. נציג תוצאות <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> באיור 1. תוצאות נציג neurite קידום השפעות מטוהרים NT-3 ו NT-3-מצופה חרוזים על explants E4 חומוס SAG. SAG תא עצב גופים neurites היו immunostained עם טובולין β-הדמיה עם מטרה 10x על מיקרוסקופ confocal. לאחר 24 שעות במבחנה, explants SAG מוצג תולדה neurite יותר בנוכחות של 100 ng / ml מטוהרים אדם NT-3 הוסיף המדיום הסלולרי תרבות (1B), בהשוואה לקבוצת הביקורת (1A). נוירונים SAG היו שיתוף תרבותי עם חרוזים ספוג in100 ng / ml NT-3 להוכיח כי מקור הצבע של NT-3 יכול מקומי לקדם תוצאה neurite. Explants מוצג ארוכים תולדה neurite צפופה בצד שלexplant מול חרוז לעומת הצד הנגדי (1D) ו לעומת שליטה תרבויות עם חרוזים ספוגה PBS (1C). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> באיור 2. תוצאות נציג neurite קידום השפעות מטוהרים Wnt5a ו Wnt5a מצופים חרוזים על חוט השדרה E6 חומוס. Explants חוט השדרה היו immunostained עם טובולין β-הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal. לאחר 24 שעות של גידול בנוכחות מטוהרים עכבר Wnt5a (400ng/ml), תולדה neurite מ explants חומוס חוט השדרה הוגדל (2B) בהשוואה לקבוצת הביקורת תרבותי ללא Wnt5a (2A). חרוזים ספוגה 500 ng / ml Wnt5a, הניח 300-500 מיקרומטר מקצה explants חוט השדרה, קידם גם תולדה neurite (2D) לעומת שליטה תרבויות (2C). בדומה שיתוף תרבות התוצאות פורסמו בעבר עם Wnt5a-להביע תאים 8. סרגל קנה מידה = 200מיקרומטר.

<ol>
	<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inner+ear+afferent+connections:+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia.">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li><li>Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+conveys+semaphorin+and+VEGF+signaling+during+neural+and+cardiovascular+development.">Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development.</a> Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).</li><li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea.">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li><li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons.">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li><li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons:+comparison+with+an+otocyst-derived+factor.">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li><li>Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture.">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li><li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons.">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li><li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord.">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li><li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li><li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling.">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מציגים שיטה לנתח ותרבות SAG E4 ו E6 explants חוט השדרה, מן חומוס, תחת בסרום ללא תנאים. הליך זה משמש כיום במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של ligands שונים המופרשים על ההישרדות SAG נוירון ו תולדה neurite. היבטים רומן של פרוטוקול זה כולל את השימוש במערכת בסרום חופשי עבור explants culturing וש?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> ציוד </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection מיקרוסקופ </td><td></td><td></td><td> אנו משתמשים stereomicroscope M80 לייקה עם brightfield בסיס תאורה </td></tr><tr><td> Slide חם </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> קולגן פילמור </td></tr><tr><td> עוף ביצה החממה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 humidified תא תרבות חממה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חומרים Dissection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;העתק: מצופה צלחת פטרי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24 גם תרבית תאים בצלחת </td><td> קורנינג </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 דומון מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 דומון מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> נירוסטה סיכות פלדה לנתח </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 26002-10 </td><td> העובר מצמיד, דיסקציה בסדר </td></tr><tr><td> מוריה כף מחוררת </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 10370-17 </td><td> העובר הקציר / העברה </td></tr><tr><td> 200 μl רחב pipet הפה טיפים </td><td> דוט מדעי Inc </td><td> 118-96R </td><td> Explant להעביר </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 עוף וביצים E6 </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> צ&#39;יק Ringer של פתרון </td><td></td><td></td><td> העובר קציר </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> סיגמא </td><td> H8264 </td><td> SAG לנתיחה </td></tr><tr><td> L15 בינוני </td><td> סיגמא </td><td> L5520 </td><td> חוט השדרה לנתיחה בינוני </td></tr><tr><td> עגל עוברית בסרום </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S11150 </td><td> חוט השדרה לנתיחה בינוני </td></tr><tr><td> Vannas מספריים </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> 501778 </td><td> חוט השדרה לנתיחה </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> קולגן הכנה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail סוג קולגן אני </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Explant תרבות </td></tr><tr><td> 10X PBS (סטרילי) </td><td></td><td></td><td> כדי Neutralize קולגן </td></tr><tr><td> 1N NaOH (סטרילי) </td><td></td><td></td><td> כדי לנטרל קולגן </td></tr><tr><td> מים מזוקקים (סטרילי) </td><td></td><td></td><td> כדי לנטרל קולגן </td></tr><tr><td> אינדיקטור pH ניירות (6.0-8.1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> כדי לבדוק את רמת החומציות קולגן </td></tr><tr><td> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> דוט מדעי Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 μl רחב pipet הפה טיפים </td><td> דוט מדעי Inc </td><td> 119-R100 </td><td> כדי קולגן pipet </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explant תרבות </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 בינוני </td><td> סיגמא </td><td> D8437 </td><td> Explant בינוני תרבות </td></tr><tr><td> ITS 1 </td><td> סיגמא </td><td> I2521 </td><td> בינוני תוספת </tד&gt; </tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> בינוני תוספת </td></tr><tr><td> CNTF (חולדה) </td><td> סיגמא </td><td> C3835 </td><td> בינוני תוספת </td></tr><tr><td> NT-3 (אדם) </td><td> סיגמא </td><td> N1905 </td><td> בינוני תוספת </td></tr><tr><td> מטוהרים עכבר Wnt5a </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> WN-645-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi ג&#39;ל כחול חרוזי ג&#39;ל </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אימונוהיסטוכימיה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td> קיבוע </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> שטיפות </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> T9284 </td><td> חסימת פתרון </td></tr><tr><td> נתרןאזיד </td><td> סיגמא </td><td> S8032 </td><td> חסימת פתרון </td></tr><tr><td> עגל בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> חסימת פתרון </td></tr><tr><td> עכבר IgG2b חד שבטיים אנטי β טובולין 1 + II נוגדן </td><td> סיגמא </td><td> T8535 </td><td> תוויות תא גופים neurites </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר עז נוגדן IgG2 ב </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> זיהוי הנוגדן טובולין β </td></tr><tr><td> טפלון מרית מיקרו </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> שחרור ג&#39;ל קולגן מ היטב </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

איברי חושים של האוזן הפנימית עוף מעוצבבים על ידי תהליכים של הפריפריה הגנגליון (SAG) נוירונים statoacoustic. עצבוב איבר חושי תלוי בשילוב רמזים של האקסון הדרכה 1 וגורמים הישרדות 2 הממוקמים לאורך מסלול של האקסונים לגדול ו / או מטרות בתוך החושית שלהם איברים. לדוגמה, הפרעה תפקודית עם מסלול הדרכה קלאסי האקסון איתות, semaphorin-neuropilin, שנוצר misrouting של אקסונים otic 3. כמו כן, גורמי גדילה אחדים לידי ביטוי את יעדי חושית של האוזן הפנימית, לרבות Neurotrophin-3 (NT-3) ו neurotrophic נגזר המוח פקטור (BDNF), הופעלו חיות טרנסגניות, שוב מובילה misrouting של אקסונים SAG 4. אלו מולקולות לקדם אותו בשתי הישרדות neurite תולדה של נוירונים SAG חומוס במבחנה 5,6. כאן, אנו לתאר ולהדגים את שיטת במבחנה אנחנו כרגע uלשיר על מנת לבחון את ההיענות של neurites חומוס SAG חלבונים מסיסים, כולל morphogens ידוע כגון Wnts, כמו גם גורמי גדילה חשובים לקידום neurite SAG תולדה והישרדות נוירון. באמצעות מערכת זו המודל, אנו מקווים להסיק מסקנות לגבי ההשפעות כי ligands המופרש יכול להפעיל על ההישרדות SAG נוירון ו תולדה neurite. Explants SAG הם גזור ביום עובריים 4 (E4) תרבותי תלת ממדי ג&#39;ל סרום קולגן תחת ללא תנאי למשך 24 שעות. ראשית, ההיענות neurite הוא נבדק על ידי explants culturing עם בינוני בתוספת חלבון. לאחר מכן, כדי לשאול אם מקורות נקודת ligands מופרש יכולה להיות השפעה על כיווני תולדה neurite, explants הם שיתוף תרבותי עם חלבון מצופים חרוזים assayed על היכולת של חרוז כדי לקדם או לעכב מקומית תוצאה. אנו כוללים גם הפגנה של דיסקציה (שינה פרוטוקול 7) והתרבות של E6 explants חוט השדרה. אנומשתמשים באופן שגרתי explants חוט השדרה על מנת לאשר bioactivity של חלבונים חלבון ספוג חרוזים, ולוודא מינים תגובתיות צולבת עם רקמה חומוס, בתנאים תרבות כמו explants SAG. אלה מבחני חוץ גופית הם נוח במהירות ההקרנה של מולקולות מפעילים trophic (הישרדות) או טרופי (כיווני) ההשפעות על נוירונים SAG, במיוחד לפני ביצוע מחקרי in vivo. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת בדיקה של מולקולות בודדות תחת בסרום ללא תנאים, עם הישרדות נוירון גבוהה 8.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays at JoVE.com

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג&#39;ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

dissection-culture-chick-statoacoustic-ganglion-spinal-cord-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Views.  Purdue University. אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג'ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.

Video: Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

אינדוקציה של פגיעה מלאה בחוט השדרה מסוג טרנס-פעולה בעכברים

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...