Dissection ובידוד מוקדם של בתאי גזע hematopoietic מ Murine שק החלמון ואת אבי העורקים באזור, בלוטת המין, כלית בינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, חשוב לקבל את כל ריאגנטים הכלים הדרושים ההליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים, בגודל 4 ו כירורגית כיתה כפוף שקצהו מלקחיים, גודל 5 / 45 (אופציונלי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 מד מחטים עם מזרק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי 35mm ו 100mm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS עם 10% ו 20% בסרום שור העובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולבסוף, collagenase </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הנתיחה, אנחנו צריכים לקצור את קרני הרחם מתוך נקבה בהריון תפיסה ימים 10.5 פוסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים מומתים על פי הנהלים שאושרו. אנו משתמשים פחמן דו חמצני מחנק, ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן של הנקבה רטוב עם אתנול את העור נפתח עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את העור עם מלקחיים, חתכים נוספים מבוצעים כדי לפתוח את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן היא פתחה את צופרי הרחם ניתן דמיינו. בעזרת מלקחיים להחזיק בקרנות הרחם, לחתוך כל סוף דיסטלי למרכז כדי הבלו הן קרניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרניים הרחם ממוקמות אז בצלחת פטרי המכילות קר PBS עם 10% FBS להסיר רקמות הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים 4 גודל ועבודה תחת מיקרוסקופ, בעדינות להסיר את רקמת רירית הרחם מרחבי conceptus כל העובר, נזהרים שלא לנקב את השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסר לאחר, עוברים ממוקמים צלחת מתוקים עם קר PBS ו -10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את רקמת השליה לחשוף העובר עטוף שק החלמון באמצעות מלקחיים לחתוך את העובר, עטוף שק החלמון מן השליה בצומת שלהם. שק חלמון המכיל העורקים vitelline, וחלק של חבל הטבור, ניתן התגרו בעדינות מן העובר ומניחים בצד על קרח דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר הוא עבר צלחת פטרי קטנה עם רמות מינימלי של PBS עם FBS 10% - בדיוק מספיק כדי להרטיב את העובר אבל לא יותר מדי. רמות אופטימליות לשמור על העובר נייח בעוד צלחת הוא נסער לאט, תוך שמירה על העובר בבטחה במקום במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ל 30 מחטים מד, אשר משמשים כדי להסיר את החלק העליון והתחתון של העובר על ידי חיתוך forelimbs מעל ומתחת hindlimbs. היכרות עם שימוש במחטים ככלי חיתוך עשוי לקחת חלק באימון. שיטת באמצעות חתכים קטנים חוזרות ונשנות של המעבר מחטים יהיה לנתח את הרקמה, עם המחט מוחזק ביד הדומיננטית לפעול כמדריך חיתוך המחט אשר מוחזק ביד הלא דומיננטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק הגבי של העובר. זוהי רקמה המכילה את somites. בעדינות לחתוך את הרקמה הגבי ביותר תוך שמירה על מרחק מספיק מן האאורטה (קו אדום) כדי למנוע כל ניקס. חיתוך אבי העורקים היה לגרום לאובדן דם וחוסר היכולת לחזות בקלות את מיקומו. שוב, ביצוע חתכים קטנים עם המחטים היא חיונית לשמירה על מיקום חיתוך מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את הרקמה הנוספת הרחק מחוץ לתצוגה ולהפוך את העובר סביב לחתוך את רקמת הגחון, שוב קיצוץ קרוב האאורטה ככל האפשר מבלי knicking זה. הקיצוץ עשוי רחוק מדי מהמיקום האופטימלי תביא רקמות הבטן להיות נוכח, אשר ניתן להסירו לאחר AGM מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר עם הצד הגבי שלה למטה או גבו נגד הצלחת. בעדינות ללכסן את העובר לפתוח על ידי לחיצה על הצדדים למטה לדמיין את מיקומו של רכסי האשכים. אלה ממוקמים מעט מחוץ למרכז כמו צינור מבנים דמויי צידיו של האאורטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את לנתיחה על ידי הסרת רקמות בצד עודף שימוש בטכניקות חיתוך כמו קודם. לאחר רקמה בצד של העובר מוסר, אז העובר מתהפך כדי להסיר את הרקמה בצד הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, AGM הוא נבדק על רקמות עודף כי ניתן להסיר בקלות עם מחטים ללא פגיעה באבי העורקים או בלוטות המין. כמו הסרת עודפי כמה תוצאות אפשריות בידוד טוב יותר של האוכלוסייה בתאי גזע מאז אנחנו סומכים רק על פני השטח כמה סמנים תא לטיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש כפוף שקצהו מלקחיים, בעדינות לגרוף את כל AGM ומקום בקור PBS עם FBS 10% עד מוכן דיסוציאציה. </li></ol> דיסוציאציה ו FACS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את רקמות, מלכתחילה שקי חלמון ו AGMs צינורות נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בקצרה לרקמות גלולה ולסלק PBS עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמות collagenase 0.25% ב-PBS עם FBS 20%, עם נפח מספיק כדי לכסות כראוי ברקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות ב 37 מעלות. 25-30mins עבור AGMs ו 35-40mins עבור שקי חלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, בעדינות פיפטה הרקמות מעלה ומטה כדי ניתוק השעיות לתוך תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הרקמות עם עודף PBS wi10% ה FBS, גלולה את התאים resuspend ב PBS סטרילי טרי עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח FACS, התאים הם מוכתמים על פי המלצות היצרן. אנו משתמשים FACSAria מ BD Biosciences לבצע cytometry הזרימה. בשל גודלו ואת שבריריותם של תאים עובריים, הצמצם מיון מותאם עבור בקוטר גדול יותר של תאים hematopoietic מבוגרים, אשר אנו גם מחקר במעבדה. כמו כן, הלחץ הוא מותאם להיות פחות מאשר את התנאים הנדרשים על ידי תאים hematopoietic מבוגר. לדוגמה, מיון על FACSAria, גודל נחיר יהיה 100 מיקרון והלחץ סוג יהיה 30 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוחים בתאי גזע, תאים חיובי משולש המבטא את cKit סמנים, CD34, CD41 ו מבודדות מיון של שק החלמון ושקופיות כפול (cKit, CD34) מבודדים מן AGM באמצעות FACS. עלילה טיפוסית תיראה כך: תאים חיובי cKit מנותחים עבור CD34 ו CD41 בו זמנית או בנפרד. בדרך כלל תאים להציג הדרגתיות של חיוביות עבור הסמן כל עם האוכלוסייה בתאי גזע כפי שנמצאו משנה של האוכלוסיות חיובית. חלקות אלו מראים לנו כי השגנו תשואה טובה עם תא 100-300 תאים לכל שק החלמון ואת לכל AGM. </li></ol>

isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and agm

בעובר העכבר, hematopoiesis מוקדם מתרחש בו זמנית באיברים רבים, הכוללת את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור. אזורים אלה הם מכריעים בהקמת מערכת הדם העוברים מוביל התנועה בסופו של דבר לתאי גזע לתוך הכבד העוברי ולאחר מכן פיתוח בתאי גזע בוגרים ב bonemarrow. מוקדם בתאי גזע hematopoietic יכול להיות מבודד איברים אלה באמצעות microdissection העובר ואחריו מיון תזרים cytometric להשיג האוכלוסייה טהור יותר. עדיין לא ברור כיצד אוכלוסיות אלה תא גזע לתרום הבריכה עוברית בתאי גזע בוגרים. כמו כן, חוקר במעבדה שלנו איך בתאי גזע מוקדם תפקודית שונה העובר מבוגר בתאי גזע hematopoietic. יתר על כן, מיני במעבדה שלנו אוכלוסיות שונות של בתאי גזע hematopoietic ולבדוק תפקיד פונקציונלי שלהם בהקשר של מגוון רחב של מודלים גנטיים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליך מיקרו לנתיחה שאנחנו בדרך כלל להשתמש גם מראים את התוצאות של plotfter FACS טיפוסי בידוד אוכלוסיות אלה נדירים, ניתן לבצע מגוון של מבחני תפקודי כולל: מבחני המושבה השתלת מח עצם.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM at JoVE.com

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

isolation-early-hematopoietic-stem-cells-from-murine-yolk-sac

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

Video: Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As such, it contains hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), as well as supporting stromal cells that contribute to the maintenance and regulation of HSPCs. Hematological and other BM disorders disrupt hematopoiesis by affecting hematopoietic cells directly and/or through the alteration of the BM niche. Here, we describe a method to study hematopoiesis in health and malignancy through the phenotypic analysis of murine BM HSPCs and stromal niche populations by flow cytometry. Our method details the required steps to enrich BM cells in endosteal and central BM fractions, as well as the appropriate gating strategies to identify the two key niche cell types involved in HSPC regulation, endothelial cells and mesenchymal stem cells. The phenotypic analysis proposed here may be combined with mouse mutants, disease models, and functional assays to characterize the HSPC compartment and its niche.

Here, we describe a simple protocol for the isolation and staining of murine bone marrow cells to phenotype hemopoietic stem and progenitor cells along with the supporting niche endothelial and mesenchymal stem cells. A method to enrich cells located in endosteal and central bone marrow areas is also included.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells (HSCs). However, numerous studies have suggested that functional heterogeneity exists in the HSC compartment. Recent single-cell analyses have reported HSC clones with different cell fates within the HSC compartment, which are referred to as biased HSC clones. The mechanisms underlying heterogeneous or poorly reproducible results are little understood, especially regarding the length of self-renewal when purified HSC fractions are transplanted by conventional immunostaining. Therefore, establishing a reproducible isolation method for long-term HSCs (LT-HSCs) and short-term HSCs (ST-HSCs),&#160;defined by the length of their self-renewal, is crucial for overcoming this issue. Using unbiased multi-step screening, we identified a transcription factor, Hoxb5, which may be an exclusive marker of LT-HSCs in the mouse hematopoietic system. Based on this finding, we established a Hoxb5 reporter mouse line and successfully isolated LT-HSCs and ST-HSCs. Here we describe a detailed protocol for the isolation of LT-HSCs and ST-HSCs using the Hoxb5 reporter system. This isolation method will help researchers better understand the mechanisms of self-renewal and the biological basis for such heterogeneity in the HSC compartment.

We present a step-by-step protocol for the isolation of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs) and short-term HSCs (ST-HSCs) using the Hoxb5 reporter system.

שיטת בידוד לתאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך וקצר

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...