Dissection ובידוד מוקדם של בתאי גזע hematopoietic מ Murine שק החלמון ואת אבי העורקים באזור, בלוטת המין, כלית בינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, חשוב לקבל את כל ריאגנטים הכלים הדרושים ההליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים, בגודל 4 ו כירורגית כיתה כפוף שקצהו מלקחיים, גודל 5 / 45 (אופציונלי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 מד מחטים עם מזרק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי 35mm ו 100mm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS עם 10% ו 20% בסרום שור העובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולבסוף, collagenase </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הנתיחה, אנחנו צריכים לקצור את קרני הרחם מתוך נקבה בהריון תפיסה ימים 10.5 פוסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים מומתים על פי הנהלים שאושרו. אנו משתמשים פחמן דו חמצני מחנק, ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן של הנקבה רטוב עם אתנול את העור נפתח עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את העור עם מלקחיים, חתכים נוספים מבוצעים כדי לפתוח את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן היא פתחה את צופרי הרחם ניתן דמיינו. בעזרת מלקחיים להחזיק בקרנות הרחם, לחתוך כל סוף דיסטלי למרכז כדי הבלו הן קרניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרניים הרחם ממוקמות אז בצלחת פטרי המכילות קר PBS עם 10% FBS להסיר רקמות הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים 4 גודל ועבודה תחת מיקרוסקופ, בעדינות להסיר את רקמת רירית הרחם מרחבי conceptus כל העובר, נזהרים שלא לנקב את השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסר לאחר, עוברים ממוקמים צלחת מתוקים עם קר PBS ו -10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את רקמת השליה לחשוף העובר עטוף שק החלמון באמצעות מלקחיים לחתוך את העובר, עטוף שק החלמון מן השליה בצומת שלהם. שק חלמון המכיל העורקים vitelline, וחלק של חבל הטבור, ניתן התגרו בעדינות מן העובר ומניחים בצד על קרח דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר הוא עבר צלחת פטרי קטנה עם רמות מינימלי של PBS עם FBS 10% - בדיוק מספיק כדי להרטיב את העובר אבל לא יותר מדי. רמות אופטימליות לשמור על העובר נייח בעוד צלחת הוא נסער לאט, תוך שמירה על העובר בבטחה במקום במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ל 30 מחטים מד, אשר משמשים כדי להסיר את החלק העליון והתחתון של העובר על ידי חיתוך forelimbs מעל ומתחת hindlimbs. היכרות עם שימוש במחטים ככלי חיתוך עשוי לקחת חלק באימון. שיטת באמצעות חתכים קטנים חוזרות ונשנות של המעבר מחטים יהיה לנתח את הרקמה, עם המחט מוחזק ביד הדומיננטית לפעול כמדריך חיתוך המחט אשר מוחזק ביד הלא דומיננטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק הגבי של העובר. זוהי רקמה המכילה את somites. בעדינות לחתוך את הרקמה הגבי ביותר תוך שמירה על מרחק מספיק מן האאורטה (קו אדום) כדי למנוע כל ניקס. חיתוך אבי העורקים היה לגרום לאובדן דם וחוסר היכולת לחזות בקלות את מיקומו. שוב, ביצוע חתכים קטנים עם המחטים היא חיונית לשמירה על מיקום חיתוך מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את הרקמה הנוספת הרחק מחוץ לתצוגה ולהפוך את העובר סביב לחתוך את רקמת הגחון, שוב קיצוץ קרוב האאורטה ככל האפשר מבלי knicking זה. הקיצוץ עשוי רחוק מדי מהמיקום האופטימלי תביא רקמות הבטן להיות נוכח, אשר ניתן להסירו לאחר AGM מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר עם הצד הגבי שלה למטה או גבו נגד הצלחת. בעדינות ללכסן את העובר לפתוח על ידי לחיצה על הצדדים למטה לדמיין את מיקומו של רכסי האשכים. אלה ממוקמים מעט מחוץ למרכז כמו צינור מבנים דמויי צידיו של האאורטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את לנתיחה על ידי הסרת רקמות בצד עודף שימוש בטכניקות חיתוך כמו קודם. לאחר רקמה בצד של העובר מוסר, אז העובר מתהפך כדי להסיר את הרקמה בצד הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, AGM הוא נבדק על רקמות עודף כי ניתן להסיר בקלות עם מחטים ללא פגיעה באבי העורקים או בלוטות המין. כמו הסרת עודפי כמה תוצאות אפשריות בידוד טוב יותר של האוכלוסייה בתאי גזע מאז אנחנו סומכים רק על פני השטח כמה סמנים תא לטיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש כפוף שקצהו מלקחיים, בעדינות לגרוף את כל AGM ומקום בקור PBS עם FBS 10% עד מוכן דיסוציאציה. </li></ol> דיסוציאציה ו FACS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את רקמות, מלכתחילה שקי חלמון ו AGMs צינורות נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בקצרה לרקמות גלולה ולסלק PBS עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמות collagenase 0.25% ב-PBS עם FBS 20%, עם נפח מספיק כדי לכסות כראוי ברקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות ב 37 מעלות. 25-30mins עבור AGMs ו 35-40mins עבור שקי חלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, בעדינות פיפטה הרקמות מעלה ומטה כדי ניתוק השעיות לתוך תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הרקמות עם עודף PBS wi10% ה FBS, גלולה את התאים resuspend ב PBS סטרילי טרי עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח FACS, התאים הם מוכתמים על פי המלצות היצרן. אנו משתמשים FACSAria מ BD Biosciences לבצע cytometry הזרימה. בשל גודלו ואת שבריריותם של תאים עובריים, הצמצם מיון מותאם עבור בקוטר גדול יותר של תאים hematopoietic מבוגרים, אשר אנו גם מחקר במעבדה. כמו כן, הלחץ הוא מותאם להיות פחות מאשר את התנאים הנדרשים על ידי תאים hematopoietic מבוגר. לדוגמה, מיון על FACSAria, גודל נחיר יהיה 100 מיקרון והלחץ סוג יהיה 30 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוחים בתאי גזע, תאים חיובי משולש המבטא את cKit סמנים, CD34, CD41 ו מבודדות מיון של שק החלמון ושקופיות כפול (cKit, CD34) מבודדים מן AGM באמצעות FACS. עלילה טיפוסית תיראה כך: תאים חיובי cKit מנותחים עבור CD34 ו CD41 בו זמנית או בנפרד. בדרך כלל תאים להציג הדרגתיות של חיוביות עבור הסמן כל עם האוכלוסייה בתאי גזע כפי שנמצאו משנה של האוכלוסיות חיובית. חלקות אלו מראים לנו כי השגנו תשואה טובה עם תא 100-300 תאים לכל שק החלמון ואת לכל AGM. </li></ol>

isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and agm

בעובר העכבר, hematopoiesis מוקדם מתרחש בו זמנית באיברים רבים, הכוללת את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור. אזורים אלה הם מכריעים בהקמת מערכת הדם העוברים מוביל התנועה בסופו של דבר לתאי גזע לתוך הכבד העוברי ולאחר מכן פיתוח בתאי גזע בוגרים ב bonemarrow. מוקדם בתאי גזע hematopoietic יכול להיות מבודד איברים אלה באמצעות microdissection העובר ואחריו מיון תזרים cytometric להשיג האוכלוסייה טהור יותר. עדיין לא ברור כיצד אוכלוסיות אלה תא גזע לתרום הבריכה עוברית בתאי גזע בוגרים. כמו כן, חוקר במעבדה שלנו איך בתאי גזע מוקדם תפקודית שונה העובר מבוגר בתאי גזע hematopoietic. יתר על כן, מיני במעבדה שלנו אוכלוסיות שונות של בתאי גזע hematopoietic ולבדוק תפקיד פונקציונלי שלהם בהקשר של מגוון רחב של מודלים גנטיים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליך מיקרו לנתיחה שאנחנו בדרך כלל להשתמש גם מראים את התוצאות של plotfter FACS טיפוסי בידוד אוכלוסיות אלה נדירים, ניתן לבצע מגוון של מבחני תפקודי כולל: מבחני המושבה השתלת מח עצם.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM at JoVE.com

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

isolation-early-hematopoietic-stem-cells-from-murine-yolk-sac

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

Video: Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Developmental Biology

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

מיטוב בידוד תאי סטרומה מבלוטת התימוס וממח העצם

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

מחבר זרקור: קידום מחקר המטופויטי באמצעות בידוד תאי סטרומה לריצוף תא בודד

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Immunology and Infection

בידוד והפרדה מגנטית של תאי גזע מסוג +Murine CD34 מדופן כלי הדם

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

מחבר זרקור: בידוד ואפיון משופרים של תאי גזע מסוג Murine CD34+ תושב דופן כלי הדם באמצעות ציטומטריית זרימה מצומדת להקרנת חרוזים מגנטיים

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34+ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34⁺ תושבי דופן כלי הדם מעכברים