בידוד אבות מקרוציטים עכבר

הבידוד של אוכלוסיות מפתח Megakaryocyte פרוגניטור, מאפשר ניתוח עדין של היררכיית השושלת בתרבית התאים על התקפות מולקולריות, עד לרמת התא הבודד. פרוטוקול זה משלב פרקטיקה אתית יותר על ידי מזעור מספר בעלי החיים הנדרשים, בתהליך יעיל למיון תאים של אוכלוסיות MEP ו- MKP. עבור עצם, הגבייה לרסס את הגוף של שמונה עד 12 שבועות C57 שחור שישה עכבר, עם 70% אתנול.

השתמש במספריים כדי להפוך נקודה חמישה עד סנטימטר אחד חתירה של העור, בניצב לעמוד השדרה. ולקרוע את העור סביב כל הגוף, על ידי משיכת אותו למטה. הנח את פני העכבר כלפי מטה על משטח הניתוח, ולאחר מכן אתר את עצמות האגן על ידי הזזת אצבעות או מספריים, לאורך עמוד השדרה החשוף, מלמעלה למטה.

כדי לאתר את סמל הכסל, זהה את הבליטה הקטנה באזור המותני ליד הגפיים האחוריות. לאחר הנחת המספריים במקביל לעמוד השדרה, כנגד החוליות, וקרוב לבליטת פסגת הכסל, המשיכו לחתוך את השרירים לאורך צד עמוד השדרה מעל עצם האגן, על ידי הזזת המספריים לאורך החוליות, עד לזנב. ואז לחתוך בין החוליות ואת פסגת הכסל, להישאר קרוב ככל האפשר לחוליות.

ולחתוך את השרירים הנותרים כדי לנתק את האיבר מהגוף. מעבירים את הגפיים המנותקות למשטח נקי. לאחר השלכת שאר הגוף בהתאם להנחיות המוסדיות, יש להשתמש במלקחיים ואזמלים כדי לחשוף את עצמות האגן, הירך והטיבי, על ידי הסרת הרקמה שמסביב.

השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הקצה הדיסטלי של עצם הירך, ולפרק בזהירות את ראש הירך מעצם האגן, על ידי חיתוך עדין של השרירים סביב הניסוח עם אזמל. לגרד את השריר הנותר מעצם האגן, לחתוך באמצע החלל שהחזיק את ראש הירך. שמור את האיליום והשלך את הצד הדק המשולש של העצם.

באמצעות אזמל, להסיר את שאריות הרקמות סביב ilium, ומניחים את העצם ניקה PBS סטרילי בתוספת 2%סרום עגל שזה עתה נולד. ואז להשתמש במספריים כדי לחתוך את הרגל מהרגל בקרסול. מחזיק את החלק התחתון של השוקה עם המלקחיים, לגרד את השריר כלפי מעלה לכיוון הברך.

זרוק את הבורסה. לאחר מכן לעשות לחתוך על פני הרמה tibial עם האזמל, ומניחים את השוקה PBS סטרילי 2%NBCS. לאחר הסרת שאריות הרקמות סביב עצם הירך, להחזיק את הצד העליון של עצם הירך עם מלקחיים, ומניחים את להב האזמל בבסיס פיקת הברך.

החל כוח לכיוון פיקת הברך, במקביל עצם הירך לנתק את פיקת הברך. ואז למקם את עצם הירך, PBS סטרילי 2% NBCS. בארון זרימה למינאר, להעביר את העצמות לצלחת פטרי סטרילית מלא PBS סטרילי 2% NBCS.

השתמש באזמל כדי לחתוך את הראש של עצם הירך. מלא מזרק מיליליטר אחד עם PBS סטרילי 2%NBCS, ולחבר מחט 21 מד, לשקע. ואז למלא צינור פוליפרופילן חמישה מיליליטר עם שני מיליליטר של PBS סטרילי 2% NBCS.

מחזיק את עצם הירך עם מלקחיים, להכניס את המחט בחריץ שמאלה, לאחר הסרת פיקת הברך על ידי החלת סיבוב, להבטיח כי המחט מוכנסת לחלוטין לתוך העצם, עד שיפוע. לאחר החדרת המחט, להעביר את העצם עם המחט לתוך הצינור המכיל שני מיליליטר של PBS 2%NBCS. לאחר מכן לוותר ולשאוף PBS 2% NBCS, מהמזרק עד העצם ברורה.

הסר את המחט מ עצם הירך, ולהכניס אותו לתוך החור בצד הנגדי, שבו ראש עצם הירך היה. לאחר חלוקה ושאיפה של המאגר, להשליך את העצם. עבור סמל הכסל והשוקה, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את העצם ולהכניס בעדינות את המחט בצד הפתוח, על ידי החלת סיבוב.

מוודא כי המחט מוכנסת לחלוטין לתוך העצם, עד שיפוע. ואז להעביר את העצם עם המחט לתוך הצינור המכיל שני מיליליטר של PBS 2%NBCS. לוותר ולשאוף PBS 2%NBCS מהמזרק עד העצם ברורה.

להעביר את כל ההשעיה התא דרך מכסה מסננת תאים 40 מיקרון, להציב על צינור פוליסטירן 5 מיליליטר סטריליטר סטריליטר, ולהוסיף 500 microliters של PBS 2%NBCS. מניחים בצד 100 מיקרוליטרים של השעיית התא כמח עצם כולל. ואז לאחסן אותו על קרח להליך הכתמים.

גלולה ההשעיה המסוננת על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת supernatant, resuspend הכדור בקוקטייל נוגדנים ראשוני מוכן טרי, עם הדגירה על קרח, במשך 30 עד 45 דקות. מניחים בצד 10 מיקרוליטרים של השעיית התא לתוך צינור פוליסטירן סטריליטר חמישה מיליליטר, שכותרתו שבר לין נקבוביות, ולהוסיף 90 microliters של PBS 2% NBCS.

בינתיים, להכין חרוזים עבור דלדול מגנטי, על ידי שימוש חוזר אותם בחקירה, עם מערבולת יסודית במשך 30 שניות. העבר נפח של חרוזים המתאימים לשני חרוזים לכל תא יעד, לתוך צינור פוליפרופילן חמישה מיליליטר, ולשטוף את החרוזים פעמיים, עם PBS 2%NBCS, על ידי הצבת צינור על המגנט. לאחר הסרת חיץ הכביסה עם פיפטה פסטר זכוכית סטרילית, resuspend החרוזים ב 500 microliters של PBS סטרילי 2%NBCS.

בשלב הראשון של דלדול מגנטי, להוסיף 250 microliters של חרוזים על גלולה של תאים שטופים, ודגרה עם ערבוב עדין במשך חמש דקות על קרח. לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של PBS סטרילי 2%NBCS, עם ערבוב עדין, ומניחים את הצינור במגנט במשך שתי דקות. ממשיכים לאסוף את השבר הלא מגנטי עם פיפטה פסטר זכוכית סטרילית.

ובצעד השני של דלדול מגנטי, הוסיפו אותו ל-250 המיקרו-לייטרים הנותרים של חרוזים מגנטיים. מניחים את הצינור אטום עם פרפין על רולר צינור, במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של PBS סטרילי 2%NBCS עם ערבוב עדין.

ומניחים את הצינור עם המגנט לשתי דקות. לאסוף את השבר הלא מגנטי לתוך צינור פוליפרופילן סטרילי חמישה מיליליטר, שכותרתו, לא מגנטי לין Neg Fraction, עם פיפטה מאפה זכוכית סטרילית, ולהמשיך עם תאים מיון מגהקריוציטים אבות, כמתואר בכתב היד הטקסט. עבור אסטרטגיית הגינג למיון תאים, באוכלוסיית Lin Neg, התאים המבטאים C-kit, וביטוי נמוך עד ללא ביטוי של אנטיגן Sca-1 או CD16/32 נבחרים.

באוכלוסייה זו, MEP מזוהים כתאים חיוביים CD150 ו- CD9 עמום. ה- MKP כתקליטור 150 חיובי, ותאי CD9 בהירים. בניתוח הציטומטריה של הזרימה הייצוגית, תאים שזוהו כ- MEP ו- Mkp, תויגו בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים עבור CD41a, וסמנים קלאסיים CD42c, של שושלות המגקריוציטיות והטסיות.

שני הסמנים התבטאו בתאי אוכלוסיית הח"כים, ולא זוהו על פני השטח של תאי אוכלוסיית MEP. תוכן הדנ"א של המגקריוציטים ממוינים, הראה כי התאים הם בעיקר 2n עבור אוכלוסיית MEP. וחלק קטן מתאי הח"כים הם זרים.

תאים פלוואידיים גבוהים יותר לא זוהו באופן משמעותי באוכלוסיות אלה. בהתקפות קלונוגניות חצי מוצקות, CFU-MK זוהה הן באוכלוסיות MEP והן באוכלוסיות MKP. BFU-E לא זוהה באוכלוסיית MKp, אך זוהה ב- MEP ובאוכלוסיית תאי אב עמום CD150 שלילי CD9.

תצפית מיקרוסקופית ביום השלישי של הבידול, מראה כי MEP ו- MKP יצרו בעיקר מגהקריוציטים, שזוהו כתאים גדולים. Megakaryocytes שהושגו לאחר שלושה ימים של תרבות, זוהו באמצעות ביטוי CD41 ו- CD42c, ומייצגים 54, ו -82% מהתאים המיוצרים מאוכלוסיות תאי MEP ו- MKP, בהתאמה. השפע של המגקריוציטים המיוצרים, היה גדול יותר מהמגהקריוציטים הנגזרת מאוכלוסיית הח"כים, בהשוואה לאוכלוסיית MEP.

רק התאים הנגזרים מאוכלוסיית הח"כים, היו מסוגלים להניע פליטה, דבר המצביע על שלב התבגרות מתקדם יותר לאוכלוסיית הח"כים. השימוש בעצם האגן, מגדיל באופן דרסטי את מספר התא, בעוד דלדול מגנטי דו-שלבי משפר את היעילות של דלדול השושלת. פרוטוקול זה מאפשר את התרבות הבאה של MEP ואוכלוסיית MKP של תאים בודדים, אשר, יחד עם ניתוח תמלולי ופרוטאומי, בהחלט יצטרך לפענח את המנגנונים המעורבים, מיושם biogenesis.