הפרוטוקול המתואר מאפשר ניתוח פנוטיפי של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם ותאי סטרומה של מח עצם. ניתן להשתמש בו כדי לחקור הפרעות לאוכלוסיות אלה בסביבות שונות. בהשוואה לשיטות אחרות שתוארו בעבר, טכניקה זו מאפשרת ניתוח פנוטיפי של תאים hematopoietic, במיוחד בשני אזורי מוח פונקציונליים, endosteal ומח עצם מרכזי, כמו גם תאי סטרומה מוח עצם.
כדי להתחיל, הניחו את בעל החיים שעבר המתת חסד עם הבטן על צלחת פטרי ורססו באתנול 70%. לעשות חתך מעל הבטן באמצעות מספריים ולמשוך את העור משם כל הדרך עד הקרסוליים. תפוס את אחת הרגליים וחתך בתחתיתה כדי להפריד אותה מהחיה באמצעות מספריים.
לאחר מכן הסר את כף הרגל מהרגל על ידי חיתוך בקרסול והנח את הרגל ב- PBS קר כקרח 2% FBS. לאחר מכן, לתפוס את עצם הירך באמצעות פינצטה לחתוך מאחור כדי להפריד אותו מן החיה באמצעות מספריים. הניחו את עצם הירך ב-PBS קר כקרח 2% FBS.
לאחר הנחת עצם הרגל והירך בצלחת פטרי, נקו את העצמות באמצעות אזמל סטרילי. לאחר מכן להפריד את השוקה ואת עצם הירך על ידי חיתוך בברך עם אזמל ומניחים את העצמות נקיות קר קרח PBS 2% FBS. מניחים את עצם הירך או השוקה במכתש עם PBS קר כקרח 2% FBS ומועכים את העצם על ידי הצמדתה בעדינות לדופן המליטה באמצעות המזיק.
לאחר מכן, פיפטה את תרחיף התא שנוצר למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר כדי הומוגניזציה ולהעביר אותו לתוך צינור 50 מיליליטר דרך מסננת תא 40 מיקרומטר ממוקם על גבי הצינור. שטפו את המכתש עם עוד קצת PBS 2% FBS והעבירו את התמיסה לאותו צינור 50 מיליליטר דרך אותה מסננת תאים של 40 מיקרומטר. צנטריפוגה את צינור 50 מיליליטר ב 500 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את כדורית התא בחמישה מיליליטר של חיץ ליזה RBC בטמפרטורת החדר על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר דגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר, מוסיפים 15 מיליליטר של PBS 2% FBS וצנטריפוגה את צינור ה-50 מיליליטר. אם גלולת התא אינה נראית אדמדמה, השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS 2% FBS והעבירו את תרחיף התא לבאר של צלחת תחתונה V 96 באר להכתמה.
לאחר ריסוק העצם כפי שהודגם קודם לכן, לחתוך את קצה פיפטה P1000 באמצעות מספריים ולהשתמש בו כדי להעביר את כל התוכן של טיט לתוך צינור 50 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגו את צינור ה-50 מיליליטר ב-500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של collagenase IV ותמיסת dispase-II זו.
לדגור את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. ממלאים את הצינור ל-25 מיליליטר עם PBS 2% FBS ומערבולת לערבוב. לאחר מכן, להעביר את התוכן לצינור 50 מיליליטר חדש דרך מסננת תא 100 מיקרומטר.
לאחר מכן הוסף 15 מיליליטר של PBS 2% FBS לצינור הישן של 50 מיליליטר והעבר את התמיסה לצינור החדש של 50 מיליליטר דרך מסננת התאים של 100 מיקרומטר. לאחר צנטריפוגה והשלכת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את כדורית התא בחמישה מיליליטרים של חיץ ליזה RBC על ידי פיפטציה מעלה ומטה מספר פעמים עם פיפטה. לאחר הדגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 15 מיליליטר של PBS 2% FBS.
שוב, צנטריפוגה את הצינור ואם גלולת התא אינה נראית אדמדמה לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של PBS 2% FBS והעבר את תרחיף התא לבאר של צלחת תחתונה V 96 באר להכתמה. לאחר מכן צנטריפוגו את הצלחת ב 500 גרם במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מניחים את עצם הירך על צלחת פטרי וחותכים את קצות העצם באמצעות אזמל סטרילי.
לאחר מכן שטפו את החלק המרכזי של העצם על ידי העברת 100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS דרך החלק הפנימי של העצם פעם אחת מכל צד באמצעות מזרק אינסולין 0.5 מיליליטר ללא נפח מת ואיסוף התמיסה בצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מיליליטר אחד של PBS 2% FBS. לאחר מכן העבירו את תרחיף התא לצינור של 50 מיליליטר המסומן כמח עצם סמוק המכיל ארבעה מיליליטר של PBS 2% FBS. מרסקים את קצות העצם במכתש עם PBS קר כקרח 2% FBS על ידי הצמדתם בעדינות לדופן הטיט באמצעות המזיק.
לאחר שתרחיף התא הומוגני, העבר אותו לצינור 50 מיליליטר המסומן כמח עצם כתוש דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. לבסוף, לשטוף את המליטה עם עוד קצת PBS 2% FBS ולהעביר את התמיסה לתוך אותו צינור. ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע המטופויטיים ואבות רב-פוטנטיים בוצע במח עצם כולל בעכבר C57BL6J צעיר ובריא.
בניתוח תאי סטרומה, תאי אנדותל ותאי גזע מזנכימליים במח עצם כולל, ניתן לזהות בקלות תאי גזע מזנכימליים על סמך ביטוי קולטני לפטין וניתן לזהות תאי אנדותל על סמך ביטוי CD31 ו- SCA-1. ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי אנדותל במח עצם כולל מראה את ההבחנה בין תאי אנדותל עורקיים וסינוסואידים בהתבסס על ICAM1. הכימות של תאי אנדותל של מח עצם עורקי וסינוסואידלי ברקמת מח עצם מרכזית ואנדוסטלית מראה כי תאי אנדותל של מח עצם עורקי נפוצים יותר באזורים אנדוסטלים, בעוד שסינוסיואידים שכיחים יותר באזורי מח עצם מרכזיים.
בעת קבלת מח עצם סמוק, אין לחרוג מהנפח או מספר הפעמים המצוינות כדי לעבור PBS 2% FBS דרך החלק הפנימי של החלק המרכזי של העצם. שילוב השיטה המתוארת עם בדיקות פונקציונליות של אוכלוסיות התאים שנותחו פנוטיפית יספק מידע רב ערך נוסף על ההפרעות הפוטנציאליות לאוכלוסיות אלה המתרחשות בתנאים הנחקרים. הפרוטוקול המתואר מאפשר ניתוח פנוטיפי של תאים המטופויטיים באופן דיפרנציאלי באנדוסטל ובמח עצם מרכזי, ומאפשר לחוקרים לחקור הפרעות להמטופיזה שעלולות להתרחש במיוחד במקומות מח עצם אלה.
