תודה מיוחדת לד&quot;ר בוריס גרבר להגדרת Activin פרוטוקול ELISA כפי שפורסם גרבר et al. 2007. אנו מודים במיוחד לגב &#39;מוניקה Shevack להכנת סקירה גרפית. אנו מודים מאוד ד&quot;ר פוקס הייקו על כל העזרה והצעות ערך לפני ובמהלך הצילומים. ברצוננו להודות לכל אנשי המעבדה Adjaye, במיוחד אליזבת סוצ&#39;ה לשמירה על אספקה ​​קבועה של MEFs ו CM. כמו כן, אנו מכירים עמיתינו במתקן בעלי החיים של MPIMG לתמיכה הקבע שלהם. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מקס פלאנק, חברה [BMBF, מספר מענק 0315717A], השותפים של ERASysBio + היוזמה נתמכת במסגרת האיחוד האירופי ERA-NET פלוס תוכנית ב FP7.

1. הבידוד של Fibroblasts עכבר עובריים (MEFs) לאחר שני השלבים מבוצעים תחת ללא תנאים אספטיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר בהריון (CF1, הארלן, ארה&quot;ב) בשעה 13 או 14 DPC (היום שלאחר coitum) על ידי פריקה צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את קרני הרחם, בקצרה לשטוף ב 70% (V / V) אתנול במקום לתוך צינור פלקון המכיל PBS ללא Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen). </li></ol> השלבים הבאים מתבצעים בשכונה בתרבית רקמה בתנאים אספטיים ושימוש בכלים סטריליים. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קרניים הרחם לתוך צלחת פטרי והפרד העובר מן השליה שלה שק עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הראש ואיברים אדומים, להתרחץ PBS ולמקם את כל העוברים בצלחת פטרי נקי. דק לרכך את הרקמה באמצעות סכין גילוח סטרילי עד שהוא הופך ניתן פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין / EDTA (Gibco, Invitrogen), incluדינג 100 קוניץ יחידות DNase אני (USB), לכל העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמה לתוך צינור 50 מ&quot;ל ו בז דגירה של 15 דקות בשעה 37 ° C. אחרי 5 דקות כל אחד הדגירה, לנתק את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין על ידי הוספת נפח של 1 בינוני MEF שהוכן זה עתה. MEF בינוני התרבות (רכיבים לעשות 500 מ&quot;ל של התקשורת, מערבבים את כל המרכיבים ולסנן): 450 מ&quot;ל של DMEM, 50 מ&quot;ל של FBS (10% (V / V)), 5 מ&quot;ל של 200 מ&quot;מ L-גלוטמין (1/100 (V / V)), 5 מ&quot;ל של סטרפטומיצין, פניצילין (1/100 (V / V)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה תאים עם למהירות נמוכה (300 XG), 5 דקות, להסיר בזהירות את התא גלולה supernatant ו resuspend במדיום MEF חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ הצלחת מספר תאים שהוא שווה ערך עוברים 3-4 בקבוק אחד T150 (TPP) מצופה ג&#39;לטין 0.2% (ג&#39;לטין מעור שור, סוג ב &#39;, Sigma) עבור שעות 2. את fibroblasts (P0, המעבר 0) הם התאים היחידים שיש להם את היכולת לצרף את ג&#39;לטין מצופים צלוחיות. </lאני&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אידיאלי, התאים הם 80-90% confluent לאחר 24 שעות ובשלב זה עיקר P0 תאים קפוא לשימוש בעתיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב את הבקבוק הנותר T150 (ים) של תאים P0 עד P3 או P4, אז להשבית ולהשתמש כמו מתקני האכלה כדי replate hESCs או לייצר בינוני אוויר (ס&quot;מ). </li></ol> 2. איון ו ציפוי MEFs (תאים הכנה מזין) כל הפעולות נעשות על מכסה המנוע בתרבית רקמה בתנאים אספטיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל T150 צלוחיות עם ג&#39;לטין 0.2% ו דגירה ב RT עבור שעות לפחות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל mitomycin C ב PBS (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ולסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate מדיה MEFs ולשטוף עם PBS ללא Ca 2 + Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 20 מ&quot;ל של מדיום המכיל 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של mitomycin C על MEFs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של HR 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם mitomycin C המכיל בינוני מכן לשטוף פעמיים עם PBS, trypsinize, צנטריפוגה (דקות 5 ב XG 300) ותאי resuspend במצע חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ספירת תאים ו צלחת בצפיפות של 56.000 תאים / ס&quot;מ 2 ב T150 צלוחיות ולהשתמש לייצור ס&quot;מ במשך 6 ימים הבאים. </li></ol> 3. בינוני אילף (CM) הכנה כל הפעולות נעשות על מכסה המנוע בתרבית רקמה בתנאים אספטיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לאחר ציפוי MEFs מומת בצפיפות של 56.000 תאים / ס&quot;מ 2 להחליף את המדיום MEF עם המדיום hESC (UM, בינוני מותנית) (0.5 מ&quot;ל / ס&quot;מ 2) השלים טרי עם 4 ng / ml של FGF2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ס&quot;מ צלוחיות מזין לאחר דגירה 24 שעות ולהוסיף בינוני hESC טרי המכיל 4 ng / mL של FGF2 על מתקני האכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך זה במשך 6 ימים. בכל חנות היום אסף סי ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 ימים מערבבים את כל aliquots של בינוניות מסנן (קורנינג, 0.22 מיקרומטר, PAS). לעשות 50 aliquots מ&quot;ל ו חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים ס&quot;מ עם ng 4 נוסף / מ&quot;ל ​​של FGF2 לפני הוספת hESCs גדל על Matrigel. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. מדידת Activin בתקשורת המותנות (ELISA) 15 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את כל דגימות ריאגנטים לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ללכוד נוגדנים (אדם \ עכבר \ עכברוש Activin א &#39;, מב מחקר ופיתוח מערכות) ב PBS עם BSA 1%, מוסיפים microplate (100 μl / טוב) ו דגירה לילה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות לשטוף את פי שלוש בארות עם PBST (PBS עם 0.05% Tween 20) (300 μl / טוב) אז בלוק (1% BSA / PBS, 300 μl / טוב) עבור שעות 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הזה מכינים Activin (R &amp; D מערכות) עקומת סטנדרטי, כולל 7 דילולים (ריכוז פחות מ 30 ng / ml) ו מדגם ריק. טווח עבודה ליניארי של Activin הוא בין 0.25 ו - 32 ng / mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כפילויות של סטנדרטים דגימות כדי בארות (100 μl / טוב) ו דגירה של שעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות שלוש פעמים (300 μl של PBST). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נוגדנים משני (biotinylated) (עכבר אנוש / / עכברוש Biotinylated Activin, MAB מו&quot;פ מערכות) (0.25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב 1% BSA / PBS) ו דגירה של HR 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות שלוש פעמים (300 μl של PBST), להוסיף streptavidin-HRP (מדולל% 1 BSA / PBS, מחקר ופיתוח מערכות) ו דגירה של 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות שלוש פעמים (300 μl של PBST), להוסיף 100 μl של פתרון המצע (Quantikine, מחקר ופיתוח מערכות) ו דגירה למשך 30 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של פתרון להפסיק (Quantikine, מחקר ופיתוח מערכות) זה גם ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט Microplate הקורא (Molecular Devices ספקטרה מקס 250, מכשור רפואי גלובלית, Inc, מינסוטה) ל 450 ננומטר, עם תיקון גל ב 540 או 570 ננומטר, כדי לקבוע את צפיפות אופטית של כל טוב. </li></ol> 5. נציג תוצאות התוכנית הכוללת של הליך הבידוד מוצג באיור 1. מורפולוגיה אופיינית hESCs ו hiPSCs בתרבית בתנאים שונים מוצג באיור 2. המורפולוגיה של<html> MEFs ותאי מזין מומת המשמשים להכנת CM מוצגת באיור 3. באופן כללי, התאים צריכים להיות confluent 24 שעות לאחר בידוד ומוכן להיות קפוא או מורחבת. עם זאת, לפעמים זה עלול לקחת 2-3 ימים לפני קבלת תרבויות confluent. סי יש להכין מתאי במעבר 4 ולא מאוחר יותר. זה חיוני כי תאים ראשוניים ניתן להרחיב על 4-5 קטעים לפני תחילת ההזדקנות. ציטוקינים, Activin, נחשב כגורם הקריטי ביותר מופרש על ידי תאים מזין על התמיכה של צמיחה מובחן של תאים גזע pluripotent 14. מדידה של רמת Activin ב ס&quot;מ (איור 4) הוא assay כמותי מאוד נוח לעקוב אחר איכות MEFs. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> באיור 1. ייצוג סכמטי של הליך הבידוד MEFs. ontent &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> איור 2. מורפולוגיה אופיינית hESCs שלא עברו התמיינות בתרבית בנוכחות של (A) תאים מזין, (ב) בינוני אוויר ובינוניים (C) מוגדר. מורפולוגיה אופיינית hiPSCs בתרבית בנוכחות (D, E) מזין תאים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> איור 3. מורפולוגיה אופיינית fibroblasts העכבר עובריים (MEFs). (א) המעבר 0 (P0) יומיים לאחר ציפוי / בידוד, (ב) שכבת מזין מומת בצפיפות של 56.000 תאים / ס&quot;מ 2. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> איור 4. אנזימים המקושר immunosorbent assay (ELISA) מבוסס מדידות של ריכוז של Activin במדיום אוויר (CM) יחסי ציבורepared עם fibroblasts העכבר עובריים שמקורם במתח העכבר CF1. סי נאסף במשך 6 ימים ונקווה אז. סי &quot;1&quot; ו סי &quot;2&quot; מתייחסים קבוצות שונות של מדיה ואום אל התקשורת הבלתי מותנה. כפי פונקציה של תהליך מיזוג הוא Activin הפרשת לתוך המדיום ידי MEFs, Activin הוא כמעט בלתי ניתן לגילוי באום.

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+derived+human+embryonic+stem+cell+lines+maintain+pluripotency+and+proliferative+potential+for+prolonged+periods+of+culture.">Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture.</a> Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).</li><li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Ludwig, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li><li>Yao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+and+directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).</li><li>Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+culture+conditions+of+human+embryonic+stem+cells.">Defined culture conditions of human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).</li><li>Skottman, H., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells.">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132, 691-698 (2006).</li><li>Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Richards, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+various+human+feeders+for+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+embryonic+stem+cells.">Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 21, 546-556 (2003).</li><li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeder+layers+for+human+embryonic+stem+cells.">Human feeder layers for human embryonic stem cells.</a> Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).</li><li>Inzunza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells.">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li><li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+Human+Amniotic+Mesenchymal+Cells+as+Feeder+Layers+to+Sustain+Propagation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+the+Undifferentiated+State.">Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State.</a> Cell Reprogram. , (2011).</li><li>Eiselleova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells.">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).</li><li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+2+modulates+transforming+growth+factor+beta+signaling+in+mouse+embryonic+fibroblasts+and+human+ESCs+(hESCs)+to+support+hESC+self-renewal.">Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal.</a> Stem Cells. 25, 455-464 (2007).</li><li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin/Nodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells.">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

הליך הבידוד MEFs המוצגת כאן מאפשרת את הקמתה של מצב התרבות סטנדרטית hESCs ו hiPSCs. יתר על כן מערכת ELISA המבוסס משמש להערכת ייצור ציטוקינים על ידי התאים מזין הוא אינדיקטור שימושי לאיכות של MEF הנגזרות התקשורת ממוזגים. תחזוקה שוטפת של זן העכבר (CF1) מתן תמיכה fibroblasts יש להימנע אצווה אל אצווה וריאציה של התקשורת והתרבות. יתר על כן, מומלץ לבודד את העוברים מעכברים בו זמנית כדי להשיג איכות עקבית של תאים. אין ספק MEFs מבודד טרי אפשר לשמור קפוא ב P0 ו P1. MEFs מובטל כמו כן אפשר לשמור קפוא aliquots של כמויות מתאימות בהתאם לדרישות תרבית תאים. בדרך כלל כ 250.000 תאים יש מצופה היטב אחד של הצלחת 6 גם כדי hESCs התרבות תאים שב&quot;ס. השיטה הוקמה אופטימיזציה ניתן להשתמש באופן שגרתי כדי לצמצם את השונות בין diffeלשכור ניסויים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM (גלוקוז גבוהות) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת סינון אבק </td><td> קורנינג </td><td> 431097 </td><td> 500 מ&quot;ל, 0.22 מיקרומטר, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> נוק אאוט DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> נוק אאוט סראממ החלפה </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> לא חיוניות חומצות אמינו </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> בטא Mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> רוש </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> פיברובלסטים בסיסי Growth Factor </td><td> PeproTech </td><td> 100-18 ב &#39; </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin נוגדן </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;לטין </td><td> סיגמא </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנוש / /עכברוש Activin MAB </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05% טריפסין-EDTA </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> דקות נוספות איריס מספריים </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> נוספות גרפה מלקחיים יפות </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> קיבוע מלקחיים Pierse </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells

בדרך כלל, בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) 1 יכול להיות מתורבת בתנאים משתנים. עם זאת, זה לא קל להקים מערכת יעילה culturing תאים אלה. מאז התנאים תרבות יכולה להשפיע על ביטוי גנים אשר מקנה pluripotency ב hESCs ו hiPSCs, אופטימיזציה וסטנדרטיזציה של השיטה תרבות הוא חיוני. הקמת קווי hESC תוארה לראשונה על ידי שימוש MEFs כמו תאים מזין בסרום שור עוברית (FBS) המכיל בינוני התרבות 2. לאחר מכן, FBS הוחלף החלפת בנוקאאוט בסרום (KSR) ו FGF2, אשר משפר את הפצת hESCs 3. לבסוף, מזין ללא מערכות תרבות לאפשר תאים culturing על Matrigel מצופים צלחות ב-KSR המכיל אוויר בינוני (מדיום מותנה MEFs) 4. כתוצאה מכך, תנאי hESCs תרבות עברו לקראת תרבות מזין חופשית defin כימיתאד תנאים 5-7. יתר על כן, כדי למנוע אפשרות של זיהום על ידי פתוגנים וחלבונים מן החי באמצעות שיטות תרבות קסנו ללא רכיבים הוקמו 8. כדי להשיג תנאים משופרים מזין תאים עכבר הוחלפו שורות תאים אנושיים (למשל שריר העובר ותאי עור 9, לתאי עור בוגרים 10, fibroblasts העורלה 11-12, תאים mesenchymal מי השפיר 13). עם זאת, היעילות של שמירה על hESCs שלא עברו התמיינות באמצעות העורלה האדם פיברובלסטים שמקורם שכבות מזין אינו גבוה כמו זה של מזין תאים העכבר בשל במפלס התחתון של הפרשת Activin 14. כמובן, יש הבדל ניכר ייצור גורם הגדילה של עכבר לתאי אדם מזין. ניתוח של transcriptomes של עכבר לתאי מזין האדם גילה הבדלים משמעותיים בין תאים תומכים ולא תומכת. אקסוגני FGF2 חיונית maintaiנינג עצמית חידוש hESCs ו hiPSCs, ו זוהה כגורם מרכזי בוויסות ביטוי Tgfβ1, Activin ו שד (אנטגוניסט BMP) בתאים מזין. Activin הוכח לגרום ביטוי OCT4, Sox2, ו Nanog ב hESCs 15-16. לתרבות לטווח ארוך, hESCs ו hiPSCs ניתן לגדל על MEFs מומת mitotically או מתחת מזין ללא תנאי MEF-CM (MEF אילף בינוני) על Matrigel מצופים צלחות כדי לשמור על מצב מובחן שלהם. ההצלחה של שני התנאים תרבות לחלוטין תלוי באיכות של תאים מזין, שכן הם משפיעים ישירות על הצמיחה של hESCs. כאן, אנו מציגים שיטת אופטימיזציה עבור בידוד והתרבות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs), הכנת בינוני אוויר (ס&quot;מ) האנזים צמוד immunosorbent assay (ELISA) כדי להעריך את רמות Activin בתוך התקשורת.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס&quot;מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

preparation-mouse-embryonic-fibroblast-cells-suitable-for-culturing

Research

JoVE Journal

Biology

90.5K Views.  Max Planck Institute for Molecular Genetics. איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.

Video: Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...