. 2007 Greber ark yayınlanan aktivin A ELISA protokolü kurmak için Dr Boris Greber özel teşekkürler. Biz grafik bakış hazırlanması için Bayan Monica Shevack özellikle müteşekkiriz. Biz çekimler öncesi ve sırasında her türlü yardımı ve değerli önerileri için Dr Heiko Fuchs için minnettarız. Biz MEFS ve CM sabit bir kaynağı korumak için Adjaye laboratuvar, özellikle Elisabeth Socha tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz de onların sürekli destek için MPIMG bir hayvan tesis bünyesinde çalışan tüm arkadaşlarımız kabul ediyorsunuz. Bu çalışma kısmen Max Planck Topluluğu ve tarafından finanse edilmiştir [BMBF; hibe sayısı 0315717A], ERASysBio ortakları + AB 7.Çerçeve Programı&#39;na ERA-NET Plus, programı kapsamında desteklenen girişim.

1. Fare Embriyonik Fibroblastlar izolasyonu (MEFS) Aşağıdaki iki adım non-aseptik koşullar altında gerçekleştirilir. <ol><li> Servikal dislokasyon ile 13 veya 14 DPC (Günlük post-coitum) bir gebe fare (CF1, Harlan, ABD) Kurban. </li><li> Uterus boynuzu dışarı dissect, kısa bir süre Ca2 + Mg 2 olmaksızın PBS içeren bir Falcon tüpe 70% (v / v) etanol ve yerinde durulama + (Gibco, Invitrogen). </li></ol> Aşağıdaki adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yürütülen ve steril aletler kullanıyor. <ol start="3"><li> Petri içine laparotomi yerleştirin ve plasenta ve embriyo kesesi her embriyo ayırın. </li><li> Kafası ve kırmızı organları incelemek, PBS içinde yıkayın ve temiz bir petri tüm embriyolar yerleştirin. İnce bu Pipeti mümkün hale gelinceye kadar steril bir jilet kullanarak doku kıyma. </li><li> % 0.05 1 ml ilave edilir tripsin / EDTA (Gibco, Invitrogen), incluembriyo başına DNaz I (USB) ding 100 Kunitz birimleri. </li><li> Bir 50 ml Falcon tüpüne aktarılır ve doku 37 azından 15 dakika süreyle inkübe edilir ° C. Inkübasyon her 5 dakika sonra, iyice yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri ayrışır. </li><li> Taze hazırlanmış MEF besiyeri yaklaşık 1 hacim ekleyerek tripsin inaktive. MEF kültür ortamı (bileşenler, medya, 500 ml oluşturan tüm bileşenler ve filtre karıştırmak için): 450 ml DMEM, FBS ve 50 ml (10% (v / v)), 200 mM L-glutamin (1/100 (v / v)) ve 5 ml penisilin-streptomisin 5 ml (1/100 (v / v)). </li><li> 5 dk, (300 xg) düşük hız ile hücreler santrifüj, dikkatle sıcak MEF orta süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletini kaldırın. </li><li> Levha yaklaşık 2 saat süreyle% 0.2 jelatin (büyükbaş hayvanların derilerinden, Tip B, Sigma jelatin) ile kaplanmış her T150 (TPP) şişeye 3-4 embriyo eşdeğer bir hücre sayısı. Fibroblastlar (P0, pasaj 0) jelatin kaplı matara eklemek için yeteneği var sadece hücrelerdir. </li&gt; <li> İdeal olarak, hücre 24 saat sonra% 80-90 konfluent olup, bu aşamada P0 hücrelerinin büyük bir kısmı gelecekteki kullanım için dondurulur. </li><li> P3 veya P4 kadar P0 hücrelerin kalan T150 balonuna (ler) genişletin, sonra inaktive ve besleyiciler hESC replate veya klimalı ortamda (CM) üretmek için kullanın. </li></ol> 2. Inaktivasyonu ve Kaplama MEFS (Besleyici Hücreler Hazırlık) Tüm adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yapılmaktadır. <ol><li> En az 2 saat oda sıcaklığında% 0.2 jelatin ve inkübe ile kaplamak T150 şişeler. </li><li> Mitomisin C PBS içerisinde (1 mg / ml) ve filtre ile seyreltilir. </li><li> MEFS medya aspire ve Ca 2 + Mg 2 + PBS ile yıkayın. </li><li> 10 mikrogram / MEFS üzerine mitomisin C ml içeren orta yeri 20 ml. </li><li> 37 2 saat boyunca inkübe ° orta içeren mitomisin C ile C PBS, trypsinize, santrifüj (300 xg&#39;de 5 dakika) ve sıcak ortamda Pastör pipetiyle hücreleri ile iki kez yıkayın. </li><li>56,000 hücre / T150 şişeler içerisinde cm 2 arasında bir yoğunlukta hücreleri ve plaka saymak ve aşağıdaki 6 gün boyunca CM üretimi için kullanımı. </li></ol> 3. Koşullu Orta (CM) hazırlanması Tüm adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yapılmaktadır. <ol><li> HESC ortamı (UM, doğuştan orta) (0.5 ml / cm 2) ile MEF orta yerine 56,000 hücre / cm 2 arasında bir yoğunlukta inaktive MEFS kaplama sonrası gün 4 ng / ml arasında FGF2 ile desteklenmiş taze. </li><li> 24 saat inkübasyondan sonra besleyici matara gelen CM toplayın ve 4 ng / fiderlere FGF2 ml içeren taze hESC orta ekleyin. </li><li> Gelecek 6 gün için bu yordamı yineleyin. Her gün mağaza -20 ° C&#39;de CM toplanan </li><li> 6 gün, orta ve filtre (Corning, 0.22 um, PAS) tüm alikotları karıştırın sonra. -80 Az 50 ml hacimde ve mağaza olun ° C </li><li> Matrigel yetişen hESC eklemeden önce ek 4 ng / ml FGF2 CM tamamlayın. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Koşullu ortam bir aktivin ölçümü (ELISA) 15 <ol><li> Tüm örnekler ve reaktifler oda sıcaklığına getirin. </li><li> Mikroplaka eklemek,% 1 BSA ile PBS (İnsan \ Fare \ Rat aktivin A MAb, R &amp; D Systems) antikor yakalamak (100 ul / kuyu) ve RT gece inkübe sulandırınız. </li><li> 24 saat blok (% 1 BSA / PBS, 300 ul / kuyucuk) oda sıcaklığında 1 saat daha sonra PBST (% 0.05 Tween 20 ile PBS) (de 300 ul /) ile üç kez kuyuları yıkayıp sonra. </li><li> Bu süre içinde bir aktivin A 7 dilüsyonları (30 ng / ml konsantrasyonu daha az) ve boş bir örnek de dahil olmak üzere (R &amp; D Systems) standart eğri, hazırlamak. Aktivin doğrusal çalışma aralığı 0.25 ile 32 ng / ml &#39;dir. </li><li> Kuyular (iyi 100 ul /) için standartlar ve örneklerin kopyası ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. </li><li> Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın. </li><li> Ikincil (biyotin) antikoru (İnsan / Fare / Rat aktivin A MAb, R &amp; D Systems biyotinile) (0 ekleyin.25 ug / ml% 1 BSA / PBS) ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilir. </li><li> Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın, Streptavidin-HRP (% 1 BSA / PBS, R &amp; D Systems ile sulandırılmış) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın, substrat çözeltisi 100 ul (Quantikine, R &amp; D Systems) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Her bir kuyuya durak çözüm 100 ul (Quantikine, R &amp; D Systems) ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> De her optik yoğunluğu belirlemek için 540 veya 570 nm dalga boyu düzeltmesi ile 450 nm Set Mikroplaka okuyucu (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Tıbbi Cihazlar A.Ş., Minnesota),. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Izolasyon prosedürü genel şeması Şekil 1&#39;de verilmiştir. HESC ve farklı koşullar altında kültüre hiPSCs tipik morfolojisi Şekil 2&#39;de sunulmuştur. Morfolojisi<html> MEFS ve CM hazırlamak için kullanılan inaktif besleyici hücreler Şekil 3&#39;te sunulmuştur. Genel olarak, hücreler 24 saat sonrası izolasyon konfluant ve dondurulmuş veya genişletilebilir hazır olmalıdır. Ancak, bazen bu birleşik kültürler almadan önce 2-3 gün sürebilir. CM pasaj 4 değil, daha az hücrelerden hazırlanır. Primer hücreler sadece yaşlılık başlangıcı önce 4-5 geçişleri için açılabilir, çünkü bu çok önemlidir. Sitokin, aktivin A, pluripotent hücreler 14 farklılaşmamış büyüme desteği için besleyici hücreler tarafından salgılanan en önemli faktör olarak kabul edilir. CM A aktivin düzeyinin ölçümü (Şekil 4) MEFS kalitesini izlemek için çok uygun bir kantitatif bir testtir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> Şekil 1. MEFS izolasyon prosedürü şematik gösterimi. ontent &quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> Şekil 2,. (A) besleyici hücre, (B) şartlandırılmış orta ve (C) orta tanımlandığı varlığında kültüre andiferansiye hESC tipik morfolojisi. (D, E) besleyici hücre varlığında kültüre hiPSCs tipik morfolojisi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> Şekil 3. Fare embriyonik fibroblast tipik morfolojisi (MEFS). (A) Passage 0 (P0) kaplama / izolasyon iki gün sonra, 56.000 hücre / cm yoğunluğu (B) inaktive besleyici tabaka. 2 <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> Şekil 4. Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) tabanlı klimalı ortamda (CM) pr bir aktivin konsantrasyonu ölçümleriCF1 fare soyundan türetilmiş fare embriyonik fibroblastlar ile epared. CM 6 gün boyunca toplandı ve ardından birleştirilmiş edildi. CM &quot;1&quot; ve CM &quot;2&quot; medya ve şartsız medyaya UM farklı gruplar bakın. Conditioning işleminin fonksiyonu MEFS, aktivin tarafından aracı madde içine bir salgılama aktivin gibi bir UM hemen hemen mümkün değildir.

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+derived+human+embryonic+stem+cell+lines+maintain+pluripotency+and+proliferative+potential+for+prolonged+periods+of+culture.">Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture.</a> Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).</li><li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Ludwig, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li><li>Yao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+and+directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).</li><li>Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+culture+conditions+of+human+embryonic+stem+cells.">Defined culture conditions of human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).</li><li>Skottman, H., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells.">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132, 691-698 (2006).</li><li>Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Richards, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+various+human+feeders+for+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+embryonic+stem+cells.">Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 21, 546-556 (2003).</li><li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeder+layers+for+human+embryonic+stem+cells.">Human feeder layers for human embryonic stem cells.</a> Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).</li><li>Inzunza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells.">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li><li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+Human+Amniotic+Mesenchymal+Cells+as+Feeder+Layers+to+Sustain+Propagation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+the+Undifferentiated+State.">Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State.</a> Cell Reprogram. , (2011).</li><li>Eiselleova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells.">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).</li><li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+2+modulates+transforming+growth+factor+beta+signaling+in+mouse+embryonic+fibroblasts+and+human+ESCs+(hESCs)+to+support+hESC+self-renewal.">Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal.</a> Stem Cells. 25, 455-464 (2007).</li><li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin/Nodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells.">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan MEFS izolasyon prosedürü hESC ve hiPSCs için standart bir kültür durumun kurulmasını sağlar. Bundan başka besleyici hücreler tarafından sitokin üretimini değerlendirmek için kullanılmıştır ELISA bazlı sistemi MEF-türevi şartlandırılmış ortam kalitesi yararlı bir göstergesidir. Destekleyen fibroblastlar sağlayan fare suşu (CF1) rutin bakımı kültür ortamı toplu-seri varyasyonu önlemek için gereklidir. Dahası, aynı zamanda hücre tutarlıdır kalitesi elde etmek için çok sayıda farelerin embriyo izole edilmesi tavsiye edilir. Kesinlikle yeni ayrılmış MEFS P0 ve P1 dondurularak saklanabilir. Ayrıca inaktive MEFS hücre kültürü için gereksinimlerine bağlı olarak uygun miktarda hacimde donmuş muhafaza edilebilir. Genellikle yaklaşık 250.000 hücre kültürü hESC ve iPS hücreleri için 6-iyi plaka tek bir iyi kaplanmış olmalıdır. Kurulan ve optimize yöntemi rutin yönün arasındaki değişkenliği en aza indirmek için kullanılabilirdeneyler kira.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM (Yüksek Glukoz) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Vakum filtre sistemi </td><td> Corning </td><td> 431097 </td><td> 500 ml, 0.22 mikron, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout Serum Değiştirme </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> Non-Essential Amino Asitler </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> beta-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomisin C </td><td> Roche </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> Bazik Fibroblast Büyüme Faktörü </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Tinile Anti-human/mouse/rat aktivin A Antikor </td><td> R &amp; D Systems </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> Jelatin </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> / İnsan / FareSıçan aktivin A MAb </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin-EDTA </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra İnce Iris Makas </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra Güzel Graefe Forseps </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pierse Fiksasyon Forseps </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells

Genel olarak, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) 1 değişken koşullarda yetiştirilebilir. Bununla birlikte, bu kültüre için etkili bir sistem oluşturmak için bu hücreler kolay değildir. Kültür koşullarında hESC ve hiPSCs yılında pluripotency bahşeder gen ekspresyonunu etkileyebilir yana, optimizasyon ve kültür yöntemi standardizasyon çok önemlidir. HESC hatlarının kurulması ilk besleyici hücreler ve fetal sığır serumu (FBS) içeren kültür ortamı 2 olarak MEFS kullanılarak tanımlanmıştır. Sonra, FBS hESC 3 çoğalmasını artıran nakavt serum replasmanı (KSR) ve FGF2, ile değiştirildi. Son olarak, besleyici içermeyen kültür sistemlerinde Matrigel kaplı plakalar üzerinde hücreleri kültür etkinleştirmek KSR içeren klimalı orta (orta MEFS koşullanmış) 4. Daha sonra, hESC kültür koşullarında kimyasal defin içinde besleyici-özgür kültür doğru ilerledik5-7 ed koşulları. Dahası, xeno içermeyen bileşenler kullanılarak patojenler ve hayvansal proteinler kültürü yöntemlerle potansiyeli kirlenmesini önlemek için 8 oluşturulmuştur. Iyileştirilmiş koşullar elde etmek için fare besleyici hücreler insan hücre hatları (örneğin fetal kas ve deri hücrelerinin 9, yetişkin deri hücrelerine 10, sünnet derisi fibroblast 11-12, amniyotik mezenkimal hücreler 13) ile değiştirildi. Ancak, insan sünnet derisi fibroblast kaynaklı besleyici katmanlar kullanarak farklılaşmamış hESC korumanın verimliliği A 14 aktivin salgısı alt düzeyde olması nedeniyle fare besleyici hücreler o kadar yüksek değildir. Açıkçası, fare ve insan besleyici hücreler tarafından büyüme faktörü üretimde belirgin bir fark vardır. Fare ve insan besleyici hücrelerin transcriptomes Analizleri ve destekleyici olmayan destekleyici hücreler arasında önemli farklılıklar saptandı. Eksojen FGF2 maintai için çok önemlidirhESC ve hiPSCs kendini yenileme ning ve Tgfβ1, aktivin A ve besleyici hücreler içinde Gremlin (BMP antagonisti) ifadesi düzenleyen önemli bir faktör olarak tespit edilmiştir. Aktivin A OCT4, SOX2 ve hESC 15-16 in NANOG ifadesi neden olduğu gösterilmiştir. Uzun süreli kültür için hESC ve hiPSCs kendi ayrışmamış durumunu korumak için mitotik inaktif MEFS veya Matrigel kaplı plakalar üzerinde MEF-CM (MEF-Şartlı Orta) olarak besleyici içermeyen koşullarda yetiştirilebilir. Doğrudan hESC büyümesini etkiler yana hem kültürü koşullarının başarısını tamamen besleyici hücre kalitesine bağlı olarak değişir. Burada, fare embriyonik fibroblast izolasyonu ve kültürü (MEFS) için optimize edilmiş bir yöntem, klimalı ortamda (CM) ve medyanın içindeki bir aktivin seviyelerini değerlendirmek için enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) hazırlanması sunuyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

preparation-mouse-embryonic-fibroblast-cells-suitable-for-culturing

Research

JoVE Journal

Biology

90.4K Görüntüleme.  Max Planck Institute for Molecular Genetics. Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Video: Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Biyoloji

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...