ברצוננו להודות לד&quot;ר ג&#39;ולי גורדון וד&quot;ר ננסי מנלי לעצות מועילות שלהם עם טכניקת התרבות. עבודה זו נתמכה על ידי הגלאוקומה הקרן לילדים ושרון-סטיוארט Aniridia אמון מחקר.

תרבות עובר עכבר: כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם קפדן עם המכון הלאומי לבריאות ההנחיות הבאה # פרוטוקול A2010 07-119, שנבדק ואושר על ידי אוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה המוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, השומר על פיקוח רגולטורים המשיך. 1. הכנת תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום תרבות באמצעות תקשורת בתאי גזע זמינה באופן מסחרי ותוספים בסכומים הבאים: נוקאאוט DMEM, החלפה בנוקאאוט סרום (KSR) (10%), N-2 מוסף (1x), אלבומין, משור הסרום (2%), פניצילין ( 50 IU / ml), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וAmphotericin-B (1.25 מיקרוגרם / מיליליטר). מדיום התרבות הכין דומה לזה שתואר קודם לכן 15 עם השינויים הבאים: תוספת של אנטי mycotics ובאמצעות פעמיים הריכוז של אנטיביוטיקה (לפרטים של חומרים כימיים וציוד מסוימים, ראה ליst של חומרים). שים לב: ריכוז אנטיביוטיקה כהשתמש בעבר (. מור-סקוט, et al 15) היה מספיק לתרבויות עובר ביצעו עד 24 תקופת זמן שעה. עם זאת, כאשר התרבות נמשכה מעבר 24 שעות, שחווינו זיהום של התרבות וזה היה בשליטה בהצלחה על ידי הכפלת ריכוז האנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את רכיבי תקשורת על 4 מעלות צלזיוס או ב-20 מעלות צלזיוס בהתאם להמלצות יצרן. יש לאחסן KSR ו-N-2 מוסף בaliquots ב -20 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. נוקאאוט DMEM פתח פעם אחת צריך להיות מנוצל בתוך 30 ימים לפי המלצת יצרן. לפני השימוש, לחמם את המרכיבים באמבט מים עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התקשורת בתנאים סטריליים. לחטא את פני השטח של כל הציוד והבקבוקים המכילים את מרכיבי תקשורת עם 70% ספריי אלכוהול לפני הצבתי במכסת המנוע בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לערבב את רכיבי התקשורת או בכוס סטרילית או ישירות במערכת הסינון (קורנינג). ראשון מוסיף את אבקת אלבומין לDMEM נוקאאוט. מערבבים היטב על ידי בעדינות רועדת עד אלבומין מתמוסס לחלוטין. לאחר מכן להוסיף את תוספת N-2, KSR ואנטיביוטיקה ומערבבים היטב באמצעות pipettor. ואז לסנן לעקר את התקשורת באמצעות מסנן גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר עם שאיבת ואקום. לוותר מדיה לתוך 50 צינורות מ&quot;ל ולאחסן בצורת חרוט על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש להשתמש באמצעי התקשורת מוכן פעם אחת בתוך 4-5 ימים לתרבות. </li></ol> 2. הכנה של תרבות ציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את בקבוקי תרבות זכוכית ופקקי גומי. לעטוף את בקבוקי התרבות ברדיד אלומיניום ומניח את פקקי בקבוק גומי בכוס מים ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את חדר התרבות (Precision חממת יחידה) עם 70% ספריי אלכוהול וחם 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחיל התרבות. חדר התרבות הוא דוארהתלוצץ עם דיסק מתגלגל במרכז שמחזיק את בקבוקי התרבות. זרימת גז לתוך התא מוסדרת על ידי מד לחץ וקצב הזרימה יכול להיות מותאם על ידי התבוננות יצוא של בועות אוויר במים בצינור זכוכית בסוף. מנגנון תרבות זו מתגלגל בקבוק הוא גרסה שונה של המכשיר המקורי שהוצג על ידי בניו וCockroft 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר בלון גז המכיל תערובת גז של 95% O 2/5% CO 2 לחדר התרבות ולהתאים את זרימת הגז ל&quot; בועת אוויר אחת לשנייה &quot;, שנותנת קצב זרימה של 50 סמ&quot;ק / דקה ומבטיחה אספקת חמצן נאותה לעוברי התרבות. </li></ol> 3. עובר אוסף מאוס והכנה לתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל עוברי עכברי סוג בר, אנחנו מנוצלים עכברים של C57BL/6J ו-CD-1 (Charles River Laboratories) זני רקע גנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את נקבות העכברים לתקעים בנרתיק בכל יום בבוקר. בצהריים ביום של מציאת הדואר תקע נרתיק צריך להיחשב כE0.5 DPC (ימים שלאחר משגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עובר עכבר בE10.5 DPC ידי הרדמת חסד העכברים בהריון הבא פרוטוקולים סטנדרטיים. עכברים מורדמים באמצעות מכשיר משאיפת CO 2 כמו שצוין על ידי האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית (AVMA) הנחיות להמתת החסד של בעלי חיים (2013). כדי להבטיח את המוות, נקע בצוואר הרחם בוצע לאחר החשיפה ל-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס 70% אתנול על פני בטן הגחון, כדי למנוע הידבקות של שיער בבטן למכשירים. לאחר מכן פתח את חלל בטן ventrally באמצעות מספריים הפעלה חדים בוטים וזוג 4-3/4 בmicrodissecting מלקחיים כדי לאתר את הרחם. באמצעות 4 במלקחי microdissecting להרים את הרחם כולו ולהפריד אותו מהגוף על ידי חיתוך עם מספריים הפעלה אור בגוף הרחם ובטיפים של קרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר לשטוף את הרחם כולו ב1x PBS חימם ל37 מעלות צלזיוסכדי להסיר כל דבק דם אל הרחם ואת המקום באופן מיידי בDMEM לחמם 37 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי. לעקר את המכשירים על ידי 70% תרסיס אתנול לפני שימוש נוסף. הערה: Preheating הפתרונות כוללים PBS, DMEM ובינוני התרבות ושמירתם על 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, הרחם צריך להיות גזור segmentally עם מספריים הפעלת אור. התוצאה היא פתחים קטנים בכל צד של הרחם המפולח דרכו פינצטה microdissecting שונה (קצוות קהה) יכולה להיות מוכנסת בעדינות כדי להרחיב את הפתח. זה מאפשר החשיפה של decidua השליה, אשר לאחר מכן ניתן להסיר בעדינות על ידי קריעה עם פינצטה microdissecting לחשוף את שק החלמון הקודקודית (פיז) עם הקרום של רייכרט. שימוש בקצה אחד של פינצטה בעדינות לנקב את הקרום של רייכרט יחד עם פיז ונפרד מן הדואר בסיסי שק חלמון קרביים (VYS) שכבה לחשוף את העוברים עם VYS ללא פגע. קונוס ectoplacental ונגזרי trophoectoderm ניתן להסיר גם עם decidua השליה או עם הקרום של רייכרט. יש להקפיד להימנע מקרע של VYS כעוברים קופצים החוצה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר עם VYS שלם אמורים להיות מועבר לצלחת פטרי שמכילה את מדיום תרבות לחמם 37 מעלות צלזיוס באמצעות פיפטה העברה פלסטיק. הערה: העברה למדיום תרבות מייד לאחר פרידה מרחם מסייעת להתפתחות טובה יותר של העובר בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קטן צריכה להתבצע בצק החלמון עם פינצטה microdissecting הימנעות כלי דם גדולים. זוג חד של פינצטה יכול לשמש כדי להפוך את הפתיחה בעדינות על ידי הפירסינג באזור סמוך לאזור הראש. לחלופין שני זוגות של פינצטה הבוטה יכולים לשמש כדי להחזיק את שק החלמון ועדינות לקרוע כדי להפוך את פתח קטן.ואז בעדינות להרחיב את הפתח על ידי הרחבת עם פינצטה לגודל פשוט מספיק כדי להתאים את הראש העוברי. הקרום השפיר העוטף את העובר באופן הדוק צריך להתנהל בעדינות מהגוף וקרוע באמצעות פינצטה. הראש העוברי ולאחר מכן את כל העובר צריך להיות exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על שלמות כלי הדם העוברי עם זה של שק החלמון 15. הערה: כל פגיעה בכלי דם שק החלמון עלול להשפיע על התפתחותו של העובר בתרבות. אין להשתמש בעוברים כזה עם כלי דם שניזוקו לתרבות ויכולים לשמש לאחסון הזמני העוברים אשר מאוחר יותר יכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריטריוני היערכות עובריים: בדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתח וקבוצתי על ידי קריטריונים מורפולוגיים, כולל גוף וגודל הראש, גפיים ומורפולוגיה העין ובמה על ידי ספירת מספר somite (ות) עבור לפחות שני עוברים מכל קבוצה. &lt;strong&gt; הערה: בדרך כלל עוברים המתקבלים מהבדלי מופע ההמלטה זהים בפיתוח ברחם ושונה בגודל הגוף, תכונות מורפולוגיות ומספר somites. עם זאת, מצאנו כי עוברי מקובצים לפי הקריטריונים מורפולוגיים שלנו בדרך כלל הציגו מספר דומה somite (± 1). מסיבה זו, היא אינה נדרשת לספור somites לכל עובר כמו זה יעכב את הזמן להתחלת התרבות. שים לב: אין להשתמש בעוברים ששמשו לספור somites לתרבות. ספירת somites לאחר תחילת התרבות לעוברים אחרים על מנת למנוע את השהיית הזמן במתחיל התרבות. העוברים שעוכבו לתרבות אחרי פרידה מהרחם בדרך כלל תערוכת פיתוח עני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים מייד לצלחת פטרי עם תרבות טרי בינוני לחמם 37 מעלות צלזיוס ולקחת אותו למכסת מנוע התרבות שבה עובר שוב צריך להיות מועבר לצלחת פטרי עם cultur סטריליתקשורת דואר לפני שמכניסה אותם לבקבוקי התרבות עם מדיום כדי להתחיל את התרבות. הערה: העברות תקשורת מרובות עבור העוברים לפני התרבות מסייעת במניעת זיהום כצעדים השונים של אוסף עובר ונתיחה בוצעו תחת מיקרוסקופ לנתח שלא הותקן במכסת המנוע בתרבית. הערה: כאשר גודל ההמלטה הוא גדול (&gt; 12 עוברים), חצי מעוברי התהליך ולהתחיל את התרבות או לשים אותם בצלחת עם מדיום התרבות ולמקם אותו בCO 2 באינקובטור ב 37 ° C. כאשר עוברים הושארו מחוץ לתקופות ארוכות יותר (&gt; דקות 35-40) שנצפינו קצב הלב להאט את קצב וזה ישפיע על ההתפתחות המאוחרת יותר בתרבות. </li></ol> 4. Culturing עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בקבוקי תרבות autoclaved בשכונה התרבות ולתייג אותם כמו שצריך. העברת 3 מיליליטר של מדיום תרבות לחמם 37 ° C לכל אחד tהוא בקבוקים ולאחר מכן את עוברי העכבר צריכים להיות מועברים בעדינות לתוך בקבוקי התרבות באמצעות טפטפות העברת פלסטיק סטרילית. בקבוקי התרבות אמורים להיות כתרים עם פקקי בקבוק גומי המסייעים להחזיק את בקבוקי התרבות לדיסק מתגלגל במנגנון התרבות. הערה: אפשר להכין בקבוקי התרבות עם התקשורת והניחו על הדיסק מתגלגל של מנגנון התרבות לפני והרדמת חסד העכברים. זה מקצר את הזמן להעברת עוברים לתוך בקבוקי התרבות. שימו לב: יכול להיות מתורבת עוברי עכבר בנפרד או כcocultures עם שניים או שלושה עוברים באותו בקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקי התרבות צריכים להתבצע סביבה נקיה מחיידקים למנגנון התרבות על 37 מעלות צלזיוס והדוקות חבר אותם לחורים שבדיסק מתגלגל עם פקקי הגומי. הפעל את הדיסק מתגלגל כדי לסובב במהירות קבועה של 35 סיבובים לדקה (סל&quot;ד), המאפשרת ציפה החופשית של embryos בתקשורת וגם מסייע בחילוף גזים בחינם על ידי הרקמה העוברית. הגז מהצילינדר המחובר לחדר התרבות זורם דרך הדיסק מתגלגל ופקקי גומי לבקבוקי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות עובר ל16-40 שעה ובאופן קבוע לבדוק את יצוא הגז וטמפרטורת חדר התרבות. הערה: מניפולציה עובר מאוס בתרבות: בואו לקבל העוברים מותאמים לתנאי התרבות לפחות 30 דקות. לאחר מכן עובר עם ביצועים נמוכים ומראה דופק חלש יכול להיות מושלך ואת העוברים שנותרו יכולים להיות מנוצל עבור מחקרי מניפולציה נוספים. ניתן לבצע מניפולציות עובר כגון 5,9,16 electroporation, microinjections 18, השתלת חרוז 16, טיפול תרופתי והליכים אחרים בשלב זה. אנחנו ביצענו בהצלחה השתלה של חרוזים agarose Affi ג&#39;ל שטופלו במולקולות איתות מסוימות כדי ללמוד את תפקידם בפיתוח העין מוקדם. העוברים לאחרניתן להחזיר מניפולציות בחזרה במדיום חדש והמשיכו בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת והתרבות לגמרי עם מדיה חדשה במרווחי זמן מסוימים לאחר שעות 9-10 ו18-19 שעות של התרבות שבה התרבות הייתה נמשכה 40 שעה. הערה: החלפת מדיה תרבות לא ייתכן שתידרש אם התרבות הוא נעצרה על ידי 16-18 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדי הצלחה בתרבות של: הישרדות עוברי בתרבות צריכה להיקבע על ידי קצב לב גלוי וזרימת דם בגוף, תוך צמיחה עוברית בתרבות צריכה להיות מוערכת על ידי עלייה בגודל גוף, מספר somite ופיתוח הצורני של ראש, גפיים, לב ועיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוברים ברחם שפותח בE11.0 DPC (~ 40-41 ים) וE12.0 DPC (~ 49-50 ים) אמורים לשמש כבקרה להשוואה בין עוברים בתרבית למשך 16-18 שעות ו38-40 שעות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפתחות עוברי בנקודות זמן שונות במהלך תרבות ובשלבי רחם יכולה להיות קפטןured תחת מיקרוסקופ לנתח. תוכנת ההדמיה ספוט נוצלה כדי ללכוד את התמונות ולאחר מכן תעובד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+BMP4+signaling+is+critical+for+the+regulation+of+distinct+T-box+gene+expression+domains+and+growth+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+optic+cup.">The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup.</a> BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).</li><li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture.">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).</li><li>Miura, S., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+of+E5.5+mouse+embryos:+development+to+the+gastrulation+stage.">Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage.</a> Genesis. 37, 38-43 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Yokoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+in+rodent+whole-embryo+culture+are+reprogrammed+to+contribute+to+kidney+tissues.">Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).</li><li>Sadler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+early+somite+mouse+embryos+during+organogenesis.">Culture of early somite mouse embryos during organogenesis.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).</li><li>Kitchin, K. T., Ebron, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+development+of+rodent+whole+embryo+culture:+solvent+toxicity+and+water+insoluble+compound+delivery+system.">Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system.</a> Toxicology. 30, 45-57 (1984).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).</li><li>Cuthbertson, R. A., Beck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+whole+embryo+culture:+a+new+method+for+studying+ocular+development.">Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).</li><li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+explanted+rat+embryos+in+circulating+medium.">Development of explanted rat embryos in circulating medium.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).</li><li>Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+and+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentially+modulate+cytotoxic+effect+of+nitric+oxide+generated+by+serum+deprivation+in+neuronal+PC12+cells.">Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells.</a> J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).</li><li>Sasaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+Shc+proteins+in+mitogenic+signaling+induced+by+insulin,+insulin-like+growth+factor-1,+and+epidermal+growth+factor.">Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor.</a> J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).</li><li>Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cAMP+signaling+pathways+differentially+regulate+alpha2C-adrenoceptor+expression:+role+in+serum+induction+in+human+arteriolar+smooth+muscle+cells.">Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).</li><li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos.">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li><li>Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-Free+Culture+of+Mid-gestation+Mouse+Embryos:+A+Tool+for+the+Study+of+Endoderm-Derived+Organs.">Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs.</a> Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+in+culture+of+rat+foetuses+explanted+at+12.5+and+13.5+days+of+gestation.">Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).</li><li>Zeeb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+manipulation+of+blood+and+lymphatic+vascularization+in+ex+vivo-cultured+mouse+embryos.">Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos.</a> Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).</li><li>Wawersik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+acts+in+murine+lens+placode+development.">BMP7 acts in murine lens placode development.</a> Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Greenfield, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+lowers+Alzheimer+beta-amyloid+generation+by+stimulating+trans-Golgi+network+vesicle+biogenesis.">Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis.</a> J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4.">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, 649-643 (2009).</li><li>Totonchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-+and+serum-free+establishment+and+expansion+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).</li></ol>

אין לנו שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית בתקשורת ותרבות בסרום ללא באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C. הרחם לשעבר התפתחות עובר היה תלוי באופן קריטי במספר גורמים: בכל שלב במהלך ההליך מרגע שהרחם בודד מהעכברים מורדמים ועד לסיומה של התר...

במבחנה שיטות תרבות ניצול כל העוברים מתאימות גם ללמוד איתות מנגנונים המעורבים בorganogenesis העוברי שקשים אחרת לגישה ברחם. עוברים שלמים לספק את שלמות הרקמות ותמיכה מתאימה לאינטראקציות רקמות, כי הם חיוניים להתרחשות בזמן של איתות מנגנונים חיוניים לתהליכים תאיים שונים במהלך organogenesis. בעוד תרבויות עובר כולו לתת במה לשפע של יישומים, כגון לימודי השתלה, מניפולציות גנטיות ורקמות, מחקרי השתלת חרוז, מחקרי טוקסיקולוגי, וכו &#39;., מערכות תרבות עובר מנוצלים כיום הן בעיקר תלויות בסרום לצמיחה ולתחזוקה נאותות של העוברים בתרבות 1-9. הסרום נוצל כאחד המרכיבים העיקריים הנעים 10-100% מהתקשורת והתרבות 6-8, 10, 11.; עם זאת, ההרכב של סרום אינו מוגדר היטב והוא יכול להיות שונה מבעלי החיים לבעלי חיים ובכל פעם הסרום נאסף. בזמן הכנת מעבדה של סרום היא זמן רב וכרוכה בנהלים מחמירים, סרום רכש מסחרי מציג שונות רבות בקרב הרבה שונים ומעלה את עלויות ניסוי. נוסף על אלה, בסרום עשוי להכיל גורמים בלתי ידועים כגון גורמי גדילה, הורמונים, או חלבונים אחרים, אשר יכול להשפיע על התוצאה של ניסויים מסוימים, בעיקר אלה הכרוכות במחקר של מולקולות איתות חשובות באינטראקציות רקמות. מחקרים הראו כי תוספת של סרום לתרבות עלולה לשנות את הרמות תאית של מולקולות איתות מסוימות, כגון monophosphate המחזורי אדנוזין (cAMP) וחלבונים מעורבים איתות וphosphoinositide 3 mitogenic (PI 3)-kinase איתות מסלולים 12-14. בניגוד לאלה, מערכת תרבות סרום ללא מספקת את היתרונות של סביבת אנטיגן חופשי,התנזרות מאנזימים פעילים ביולוגי, שיכול לשנות את התהליכים התאיים ומאפשרת עקביות בין ניסויים. במחקר הנוכחי, אנו מנוצלים מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי לעוברי כל שלב אמצע הריון התרבות באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C 15,16. עוברי עכבר בתרבית למשך 16-40 שעות בתנאים המוגדרים אלה הציגו התקדמות בפיתוח צורני של גוף ושונה מבנים עובריים הכלליים כגון לב, גפיים, מוח ועיניים המצביעים על הרמות המתאימות של התרבות תאים, נדידה, התמיינות ואינטראקציות רקמות. ניתוח מולקולרי של ההתפתחות העוברית בתרבות לאחת ממערכות האיברים מורכבות כמו העין חשף את הפיתוח העיני להיות עקבי עם זה שנצפה ברקמת העין בembryos מתפתח ברחם (Kalaskar ולודרדייל, בהכנה). כך אנו מראים כי עוברי עכבר בתרבית בשלב אמצע הריון, מפגינים צמיחה מתקדמת ופיתוח מורפולוגיים דומה לזה שנצפה בעוברים מתפתחים ברחם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td>Stock: 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td>Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 &#181;g/ml; Amphotericin (250&#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Incubator Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td>
			<td>Id.No. 840-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottles for Rotating Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Rubber Cork</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td>
			<td>AirGas Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td>
			<td>Model: Nu-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IsoTemp205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Balance</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>AG285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube &#8211; 50ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Sharp-Blunt Scissors&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps &#8211; 4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) &#8211; 4-3/4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5/45)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5060</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (55)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5063</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray Lid</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087571Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid Pipetter</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>D57849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette-10ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipette-25ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette - 7.7ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית ניצול מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי במערכת תרבות בקבוק מתגלגל מחומצן. עוברי עכברים בE10.5 בודדו בקפידה מתוך הרחם עם שק חלמון בשלמות ובתהליך כרוך תמרון כירורגית מדויק עוברי exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על ההמשכיות וכלי הדם של העובר עם שק החלמון. בהשוואה לעוברים מוכנים עם שק חלמון ללא פגע או עם שק החלמון הוסר, עובר אלה הוצגו שיעור הישרדות מעולה והתקדמות התפתחותית כאשר בתרבית בתנאים דומים. אנו מראים כי עוברי עכברים אלה, כאשר בתרבית במדיום מוגדר באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל ב37 מעלות צלזיוס במשך שעה 16-40, מפגינים צמיחה והתפתחות מורפולוגית להשוות העוברים מתפתחים ברחם. אנו מאמינים ההשיטה תהיה שימושית עבור חוקרי צורך לנצל תרבות עובר שלמה כדי לחקור אינטראקציות איתות חשובות בorganogenesis העוברי.

פיתוח של עוברי עכברים תלויים לשעבר רחם בגורמים רבים החל מרגע שהרחם הוא מבודד מהגוף לזמן את העוברים בתרבית. כמתואר באיור 1, ההליך כרוך בשורה של צעדים ביניהם, הפרדה של הרחם הרה להולדת מהגוף (איור 1 א), בידודו של עובר עם שק חלמון בשלמותה (איור 1),</s...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System at JoVE.com

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K Views.  University of Georgia.  סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולו...

Video: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

עכבר עובריים תרבות ריאות, מערכת הערכת המנגנונים המולקולריים של מסעף

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.