עבודה זו נתמכה על ידי המוסד האמריקני הלאומי לבריאות [מענק R01AI-39108 ל ASB] ו איגוד הלב האמריקני [מענקים SDG 0630219N וסיוע 09GRNT2180065 כדי YQX].

1. הכנת זני MRSA לזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן loopful התרבות MRSA מהצינור המניה ב -80 ° C עד דם כבשים Trypticase בצלחת אגר (TSA) סויה (ראו טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד), ו - דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק את טוהר התרבות על צלחת אגר דם (פנוטיפים המושבה דומים) כדי לוודא שאין זיהום לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אחד מן המושבה צלחת דם כבשים TSA ולחסן את המושבה לתוך 5 מ&quot;ל Trypticase סויה מרק (TSB) בצינור הצמד הכתיר 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה עם רועד בסל&quot;ד 200. </li></ol> 2. הכנת צנתרים כירורגיה חותכים צינורות פוליאתילן (PE10:. בקטון דיקינסון, כדי לא 427,401) ל -10 ס&quot;מ אורך, וממיסים קצה אחד על ידי לחיצה על עצה עם מלקחיים סטריליות. מטרת איטום קצה אחד של הקטטר היא למנוע דימום במהלך הצנתור. 3. מראש שלurgery הכנה הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sprague-Dawley במקום חולדה (הרלן, אינדיאנפוליס, אינדיאנה נקבה, 250-300 גרם) בתא המכיל isofluorane בחמצן תערובת גז (50%: 50%) עד הרדמה נכנס לתוקף (כגון השרירים רגועים רפלקסים פדלים נעדרים ), ולשמור על בעלי החיים במדינה מורדם במהלך הניתוח בתערובת הדלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את אזור הצוואר מהסנטר ממש מתחת לעצם החזה בבטאדין ואתנול 70%. </li></ol> 4. נוהל כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה סטרילי לאורך הניתוח. לעשות חתך (1-1.5 ס&quot;מ) אנכית דרך שכבת העור בלבד של הצוואר מעל עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דיסקציה בוטה, להפריד fascia לחשוף את העורק הראשי הנכון באמצעות 2 זוגות מלקחיים שיניים מעוקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את העורק מתוך חלל הצוואר, ושני מקום 10 ס&quot;מ באורך של משי תפר מתחת העורק ולקשור את העורק בסוף cephalic נחשף, הצב קליפ על Arteר&quot;י כדי למנוע דימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חור קטן בחלק העליון של העורק באמצעות צנתר ההיכרויות (בקטון דיקינסון, ללא סדר. 406,999), הכנס קטטר עם מלקחיים דרך החור בעורק, להסיר את הסרטון ולדחוף את הצנתר לכיוון הלב עד ההתנגדות מתקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את תפר רופף לקראת סוף הזנב של העורק ולהבטיח קטטר במקום עם תפר משי כאשר הקטטר נמצא במקום כפי שנקבע על ידי: א) את אורך קטטר מוכנס (4-5 ס&quot;מ), ב &#39;) התנגדות לקידום נוסף , ו-III) הפעימה של קטטר עם קצב הלב. להשאיר את הקטטר במקום עד סוף הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור תפר עודף ומסתיים קטטר, ולוודא כי אין דימום מן קטטר. לתחוב את הקצוות מתחת לעור הצוואר ולסגור את העור עם קטעי עור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה בכלוב במקום חמים עד התאושש מן ההרדמה, ולספק מזון ומים. בדוק את החולדה לעיתים קרובות במהלךלאחר ההתאוששות מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח זה הוא &quot;E קטגוריה&quot; ההליך. ההליכים המיוצרים הכאב הוא אינסופי על ידי משככי כאבים מאז דלקות MRSA הנלוות מצוקה לבעלי החיים. </li></ol> 5. זיהום MRSA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום יכול להתבצע בין 1 ל 7 ימים אחרי ניתוח, אבל לשמור על עקביות בתוך ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברוש זנב נקי עם אתנול 70%, ולהזריק 0.5 מ&quot;ל MRSA בספירה התא הרצוי (אפריל 10 - יוני 10 CFU / חיה עבור רוב זני ס aureus). עם מחט 27 G 1/2 אינץ מווריד לווריד הזנב זהירות : תרבות MRSA שייך לרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) ויש לו פוטנציאל סיכון בינונית עד כוח אדם ואיכות הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלחץ החזק במקום עד hemostasis מתרחשת לפני החזרה חולדה לכלוב. </li></ol> 6. הקרבה חולדות היעד ורקמות תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החולדות על ידי הזרקת ה-IP של נתרן pentobarbital מ&quot;ג 200 (/ ק&quot;ג) לאחר 1 עד 6 ימים לאחר הפגיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה על גבה ולנגב את החזה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בצורת V בחזה מתחת עצם החזה, וחותכים בסחוס של הצלעות בכל צד של עצם החזה כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את הלב בעדינות, קליפ דרך רקמת הלב קרוב אבי העורקים ו לנתח את לשחרר את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הלב על צלחת פטרי סטרילית עם גזה בתוך 4x4 אינץ&#39;, לעשות חתך דרך קיר חדר שמאל הפנימית ולפתוח את החדר השמאלי צדדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק חזותית עבור מיקום קטטר. לבחון ולהסיר vegetations מ שסתום עם מספריים מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את homogenize vegetations, ולעשות דילולים סדרתי עם PBS לתרבות כמותית. </li></ol> 7. נציג תוצאות מיד לאחר החדרת צנתר לתוך העורק ודוחף את הקטטר על 4-5 ס&quot;מ לכיוון הלב, ההתנגדות תהיה experienCED. אם אין התנגדות מורגש, קטטר אולי לא בהצלחה מוכנס לתוך הצד השמאלי של החדר לב, אשר עשויים להשפיע על מיקום של קטטר. מיקום קטטר הנכונה שפורסם קודם לכן 9 מוצג באיור 1. חלק דגימות MRSA זיהום צריך להיות תרבותי כמותי לוודא את הספירה המדויקת חיידקי מעשית עבור זיהום וטוהר המדגם זיהום. בנוסף, את האורגניזמים שהתגלו vegetations צריך להיות זהה לאלה המשמשים הבידוד. לוח 1 מציג דוגמה ארסיות של ס &#39; aureus זן במודל חולדה אנדוקרדיטיס אשר פורסם בעבר 9. כל בעלי החיים תיגר עם inocula של 10 5 ו 10 6 CFU והקריב בין 3 עד 6 ימים לאחר זיהומים endocardits שפותחו עם ס &#39;גבוהה aureus צפיפות ב vegetations לב, כמו גם כליות וטחול ( <strong&gt; לוח 1). חולדות עם תרבויות שסתום סטריליים נחשבים נגוע. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3863/3863fig1.jpg" /> באיור 1. קטטר נמצא במקום הנכון (בצד שמאל של החדר לב), ו vegetations רבים נראים סביב השסתומים אבי העורקים 9. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> הבידוד (מספר אנימס) </td><td colspan="3"> זאת אומרת להיכנס 10 CFU / g של רקמת ± SD ב: </td></tr><tr><td></td><td> צמחיה </td><td> כליה </td><td> טחול </td></tr><tr><td> 10 6 CFU / בעלי חיים (9) </td><td> 10.36 ± 0.85 </td><td> 7.30 ± 0.64 </td><td> 6.70 ± 0.57 </td></tr><tr><td> 10 5 CFU / בעלי חיים (8) </td><td> 9.93 ± 0.53 </td><td> 7.14 ± 0.53 </td><td> 6.44 ± 0.63</td></tr><tr><td> 10 4 CFU / בעלי חיים (7) </td><td> 3.46 ± 0.50 * </td><td> 1.81 ± 0.74 * </td><td> 1.58 ± 0.59 * </td></tr></tbody></table> סטיית SD, סטנדרטי. P &lt;0.001 ביחס 5 10 או 10 6 CFU-תיגר על בעלי חיים. טבלה 1. ס aureus צפיפות vegetations לב עם inocula שונה במודל חולדה אנדוקרדיטיס 9.

<ol>
	<li>Petti, C. A., Fowler, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+bacteremia+and+endocarditis.">Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis.</a> Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).</li><li>Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+infective+endocarditis.">Update on infective endocarditis.</a> Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).</li><li>Fowler, V. G., Justice, A., Moore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+hematogenous+complications+of+intravascular+catheter-associated+Staphylococcus+aureus+bacteremia.">Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia.</a> Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).</li><li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).</li><li>Hoen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+issues+in+the+management+of+infective+endocarditis+caused+by+gram-positive+cocci.">Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci.</a> Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).</li><li>Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+clinical+outcomes+when+utilizing+high-dose+(&gt;+or+=8+mg/kg)+daptomycin+therapy.">Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (&gt; or =8 mg/kg) daptomycin therapy.</a> Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).</li><li>Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+patients+receiving+daptomycin+for+the+treatment+of+Staphylococcus+aureus+infections+and+assessment+of+clinical+factors+for+daptomycin+failure:+a+retrospective+cohort+study+utilizing+the+Cubicin+Outcomes+Registry+and+Experience.">Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience.</a> Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).</li><li>Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+evaluating+the+efficacy+of+antibiotics+in+a+rat+Staphylococcus+aureus+endocarditis+model.">Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).</li><li>Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gC1qR/p33+blockade+reduces+Staphylococcus+aureus+colonization+of+target+tissues+in+an+animal+model+of+infective+endocarditis.">gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis.</a> Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).</li><li>Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+model+of+the+Staphylococcus+aureus+ClfA-fibrinogen+interaction+opens+new+avenues+for+the+design+of+anti-staphylococcal+therapeutics.">A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics.</a> PLoS Pathog. 4, e1000226 (2008).</li><li>Boles, B. R., Horswill, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+biofilm+disassembly.">Staphylococcal biofilm disassembly.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+Infection+of+Methicillin+Resistant+Staphylococcus+Aureus+(MRSA).">Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> J. Vis. Exp. (48), e2528 (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אנדוקרדיטיס עכברוש הוא מודל החיה חשוב היטב מאופיין עבור במחקרים vivo בהיווצרות וסוכני מיקרוביאלית בטיפול בזיהומים חיידקיים 9-11. בנוסף, דלקת פנים הלב המודל חולדה מייצג שילוב של דלקת חריפה ותת חריפה, יחקה המקבילה האנושית מגוף האדם אנדוקרדיטיס הילידים. יתר על ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> צלחת אגר דם, דם כבשים 5% אגר סויה Trypticase (TSA) </td><td> הארדי אבחון </td><td> A10BX </td><td></td></tr><tr><td> Trypticase סויה מרק (TSB) </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 211825 </td><td></td></tr><tr><td> רועד חממה </td><td> Labnet </td><td> I5311-DS </td><td></td></tr><tr><td> צינורות פוליאתילן </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 427401 </td><td></td></tr><tr><td> קטטר ההיכרויות </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 6999 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluorance </td><td> הרפואה המערבית suppy, Inc </td><td> 2147 </td><td> עקוב מידע בטיחות הטיפול </td></tr><tr><td> כירורגי מכשירים </td><td> מדע כלים עדינים ולפי מכשירים מחקר ביו, Inc </td><td></td><td> מצא את המכשירים של שתי החברות עבור הצרכים שלך </td></tr></tbody></table>

experimental endocarditis model of methicillin resistant staphylococcus aureus (mrsa) in rat

זיהומים endovascular, כולל דלקת פנים הלב, המהווים סכנת חיים תסמונות זיהומיות 1-3. סטפילוקוקוס אוראוס היא הנפוצה ביותר ברחבי העולם הגורם תסמונות כאלה עם תחלואה ותמותה גבוהים בלתי מתקבל על הדעת אפילו עם טיפולים מתאימים סוכן מיקרוביאלית 4-6. הגידול זיהומים בשל methicillin עמידים ס aureus (MRSA), על שיעור גבוה של קליניים vancomycin כשלים ובעיות טיפול ההולכים וגדלים של linezolid והתנגדות daptomycin יש הכל מסתבך עוד יותר את הניהול של חולים עם זיהומים כאלה, הביאו עלויות שירותי הבריאות הגבוהות 7, 8. בנוסף, יש להדגיש כי מחקרים עדכניים ביותר עם תוצאות טיפול אנטיביוטי התבססו במסגרות קליניות, ולכן עשוי להיות מושפע מגורמים שונים המארחות מחולה לחולה לבצע. לכן, מודל חיה רלוונטי של זיהום endovascular שבו גורמים המארח דומים מן החי בעלי חיים, אליה היא יותרחשוב לחקור בפתוגנזה של חיידקים, כמו גם את היעילות של סוכני מיקרוביאלית הרומן. אנדוקרדיטיס של עכברוש הוא מודל ומבוססת חיים ניסיוני מקרוב בקירוב שסתום האדם אנדוקרדיטיס הילידים. מודל זה נעשה שימוש כדי לבחון את התפקיד של גורמים מסוימים ארסיות staphylococcal ואת היעילות של משטרי טיפול אנטיביוטי אנדוקרדיטיס staphylococcal. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את מודל ניסיוני אנדוקרדיטיס בשל MRSA שיכול לשמש כדי לחקור בפתוגנזה חיידקים בתגובה לטיפול אנטיביוטי.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat at JoVE.com

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

עכברוש ניסיוני אנדוקרדיטיס בשל methicillin עמיד מודל<em&gt; ס &#39; aureus</em&gt;.

אנדוקרדיטיס דגם ניסיוני של Methicillin עמיד<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) ב עכברוש

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

experimental-endocarditis-model-methicillin-resistant-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

15.1K Views.  Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor-UCLA Medical Center. עכברוש ניסיוני אנדוקרדיטיס בשל methicillin עמיד מודל ס ' aureus.

Video: Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for study of the human demyelinating disease, multiple sclerosis (MS). EAE is characterized by pathologic infiltration of mononuclear cells into the CNS and by clinical manifestation of paralytic disease. Similar to MS, EAE is also under genetic control in that certain mouse strains are susceptible to disease induction while others are resistant. Typically, C57BL/6 (H-2b) mice immunized with myelin basic protein (MBP) fail to develop paralytic signs. This unresponsiveness is certainly not due to defects in antigen processing or antigen presentation of MBP, as an experimental protocol described here had been used to induce severe EAE in C57BL/6 mice as well as other reputed resistant mouse strains. In addition, encephalitogenic T cell clones from C57BL/6 and Balb/c mice reactive to MBP had been successfully isolated and propagated.
The experimental protocol involves using a cellular adoptive transfer system in which MBP-primed (200 &mu;g/mouse) C57BL/6 donor lymph node cells are isolated and cultured for five days with the antigen to expand the pool of MBP-specific T cells. At the end of the culture period, 50 million viable cells are transferred into naive syngeneic recipients through the tail vein. Recipient mice so treated normally do not develop EAE, thus reaffirming their resistant status, and they can remain normal indefinitely. Ten days post cell transfer, recipient mice are challenged with complete Freund adjuvant (CFA)-emulsified MBP in four sites in the flanks. Severe EAE starts to develop in these mice ten to fourteen days after challenge. Results showed that the induction of disease was antigenic specific as challenge with irrelevant antigens did not induce clinical signs of disease. Significantly, a titration of the antigen dose used to challenge the recipient mice showed that it could be as low as 5 &mu;g/mouse. In addition, a kinetic study of the timing of antigenic challenge showed that challenge to induce disease was effective as early as 5 days post antigenic challenge and as long as over 445 days post antigenic challenge. These data strongly point toward the involvement of a "long-lived" T cell population in maintaining unresponsiveness. The involvement of regulatory T cells (Tregs) in this system is not defined.

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Certain mouse strains are able to resist induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) with myelin basic protein. Described here is a simple immunization protocol that reverses the unresponsiveness and induces paralytic disease in several typical EAE resistant mouse stains.

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג&#39;ין<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

דגם העכבר כדי להעריך מולדת התגובה החיסונית לזיהום Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...