המחברים מודים Priscu ג&#39;, א Chiuchiolo ו LTER מקמרדו צוות האגמים לסיוע באיסוף ושימור דגימות באנטארקטיקה. אנו מודים Ratheon שירותי פולאר ומסוקים PHI לתמיכה לוגיסטית. Micrographs אור נוצרו במרכז של מיאמי על מיקרוסקופיה מתקדמים מרכז הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי משרד NSF מענקים של תוכניות פולאר 0631659 ו 1056396.

1. לדוגמא רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר להכין את האתר הדגימה יום אחד לפני הדגימה עמודת המים. זה יאפשר מרובדת שכבות של עמודת המים לתקן לאחר הפרעות בשל קידוח חור בקרח נמס. זיהוי המיקום של האתר התרגיל על ידי GPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגשת אל עמודת המים, להתחיל לקדוח חור בקרח עם במקדחה קרח הנרתיק המצורף הרחבה 4 אינץ&#39; הנרתיק טיסה קצת חיתוך. כדי למנוע הקפאת לקדוח חור, נסו להימנע קידוח למים נוזליים על ידי עצירת כ 4-6 ס&quot;מ הקידוח מעל החלק העליון של עמודת המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור קידוח יהיה צורך התרחב מ בקוטר של 15 עד 60 ס&quot;מ לפני הדגימה. מטרה זו מושגת על ידי שימוש melter חור (דגם Hotsy) אשר מפיצה פוליאתילן גליקול מחוממת דרך צינור הנחושת. ההיתוך חור נמשכת בדרך כלל עד 18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדגימה עמודת המים, להבטיח כי כל הציוד הנדרש רחוב מדגםכלי orage מורכבים באתר הדגימה. חומרי דגימה כוללים: בקבוק Niskin (קיבולת L 5-10), עם כבל כננת מעמיק מכויל, Messenger, בקבוקי מדגם מספיק לעומק כל הדגימה קירור להובלת המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הדגימה מוקדם יותר באותו יום (~ 05:00), כמו סינון אגם מים אמורה להסתיים ביום הדגימה. איסוף דגימות מים (1-5 ליטר) ממעמקים הרצוי (עבור מחקר זה: 6 מ &#39;, 15 מ&#39; ו 18 מ &#39;עומק דגימה, נמדד ממפלס המים piezometric בחור קרח) באמצעות סמפלר Niskin מחובר מכויל יד הכננת. כדי למנוע הפרעה של עמודת המים לאסוף בעומקים רדודים לפני אלה עמוקים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החנות האגם דגימות צידניות ותחבורה מהאתר המדגם למעבדה בתחום באמצעות מזחלת מחובר טרקטורונים (כל רכב שטח). דוגמאות צריך להיות מעובד או התייצב (למשל עבור: הקפאה בחנקן נוזלי Flash) במעבדה בתחום הדגימה הבאה מיד. </li></ol> 2. DevelopmeNT תרבויות העשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגידול של תרבויות העשרה, להתרכז 0.5-1 ליטר של מים באגם על 47 מיקרומטר 0.45 מ&quot;מ גודל הנקבוביות מסננים polyethersulfone באמצעות סינון עדין (&lt;0.3 ATM). אם המגוון של הקהילה טבעי הוא הרצוי, לסנן מדגם 2 על 47 מ&quot;מ 0.45 מיקרומטר מסננים גודל הנקבוביות polyethersulfone ופעל על פי פרוטוקולים Bielewicz et al. 4 לגיוון פילוגנטי eukaryote. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את מסנן צינור 50 מ&quot;ל בז סטרילית המכילה ~ 20 מ&quot;ל של מים מסוננים האגם שנאספו עומק הדגימה כמו מסנן. לשטוף בעדינות תאים מסנן באמצעות פיפטה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה תא 25 ס&quot;מ 2 בקבוק תרבות סטרילית התא. מוסיפים מים מסוננים האגם נאספו מעומק כל דגימה כדי להגדיל את נפח תרבות מ&quot;ל 45. הגדרת מספר משכפל את עומק דגימה אם enrichments על התקשורת והתרבות השונים הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסף התרבות עם צלוחיות של 50Xפתרונות terile לריכוז הסופי של 1X של התקשורת והתרבות הבאים: בינוני בסל של מודגש, BG11 ו-F / 2. אם טיפוח של אורגניזמים mixotrophic נדרש, הגדרת שני כלי F/2-supplemented ולהוסיף 2-3 גרגרי אורז סטרילית לאחד את צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלוחיות תרבות בטמפרטורה נמוכה (4 ° C) irradiance נמוכה (20 פוטונים μmol מ -2 מכלל -1) בצמיחה טמפרטורה מבוקרת חממה לפחות 4 שבועות באנטרקטיקה לפני המשלוח למעבדה שלך בארה&quot;ב. אם מבודד הם הרצוי, 250 צלחת μL של תרבות והעשרה על צלחות אגר המכילות מדיה צמיחה המתאימים לאחר הדגירה שבועות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשלוח בארה&quot;ב, העשרה העברת תרבויות לצינורות סטריליים 50 מ&quot;ל פלקון. משלוח הבקשה הדרישה של &quot;לא לקפוא&quot; ו - &quot;לשמור על קור רוח&quot; על משלוח הבקשה. בעוד תהליך משלוח מ אנטארקטיקה היא מהירה יחסית (2 שבועות בדרך האוויר מסחרי) ואמין מאוד, קיימת אפשרות של אובדן איבר אניןהאיזמים במהלך ההובלה. לכן, החוקרים אולי כדאי לשמור על subsample לפני המשלוח, כך הפסד של מינים מסוימים במהלך תהליך משלוח ניתן להעריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ההגעה בארה&quot;ב, העברת 5 מ&quot;ל של תרבות והעשרה לתוך 45 מ&quot;ל של התקשורת צמיחה המתאימים בקבוק 125 מ&quot;ל, Erlenmeyer סטרילית כתרים עם ספוג סטרילי. תרבויות העשרה יש לשמור על עמידה תרבויות בטמפרטורה מבוקרת תא הצמיחה הסביבה (לשכת צמיחה יומי, VWR) בשעה 4 ° C/20 פוטונים μmol m -2 s -1. תרבויות יש להעביר מדיה טריים מדי 30 יום. </li></ol> 3. Lysate תא חילוץ מתוך Enrichments מסוננים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן 5 מ&quot;ל של תרבות והעשרה על 25 מ&quot;מ Whatman GF / F מסנן באמצעות ואקום עדין (&lt;10 PSI). מסנן עשוי להיות מאוחסן במשך מספר שבועות ב -80 ° C לפני הפעילות RuBisCO מנסה לאמוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המסנן למקטעים 4-5 במספריים פלדה סטריליים ולהעביר את חתיכות עם מלקחיים סטריליות על צינור 2 מ&quot;ל כובע בורג מלא חמישית באופן מלא עם 0.1 מ&quot;מ בקוטר Zirconia / סיליקה חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.25 מ&quot;ל של מיצוי מאגר מסנן (50 bicine מ&quot;מ, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל BSA, ו -0.1% טריטון X-100, הוסיפו חדש: 10 מ&quot;מ NaHCO 3, 10 mM DTT, 3.3 mM aminocaproic חומצה, benzamidine 0.7 מ&quot;מ, ה-pH 7.8) 13 ולשבש תאים באמצעות מקצף Minibead שלוש פעמים בשנות ה -30 על הגדרת מהירות 48. כדי למנוע חימום של המדגם, beadbeating חלופי עם הדגירה 1 קרח דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת slurry מסנן דק &#39;2 ב XG 3000 ב 4 ° C כדי ליצור גלולה רופפת של GF / F סיבים המסנן הקיר פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר aliquot 200 לטבול μL וב μL 800 של אצטון קר כקרח 90%. למדוד כלורופיל שניתן להפיק (CHL) ב ספקטרופוטומטר בערכים אורך גל של 664 ננומטר ו -14 ננומטר 647. העברת supernatant לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת remaining supernatant על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב XG 15,000 ולהעביר supernatant (להימנע גלולה של קרומים תאיים מסיסים ונשאר GF / F סיבים סינון) כדי צינור microcentrifuge נקי 1.5 מ&quot;ל. Lysate זה תא מסיסים עשויים כעת לשמש assay פעילות carboxylase RuBisCO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysate ניתן לאחסן ב -80 ° C, לאחר תוספת של גליצרול 12.5% ​​והקפאה פלאש בחנקן נוזלי. אובדן הפעילות עשויה להתרחש לאחר ההקפאה / הפשרה מחזורים רבים, תלוי ברגישות של אנזימים lysate. לכן, הפעילות של lysate טרי לעומת קפוא יש לבדוק לפני התא גדול בקנה מידה lysate עקירות. </li></ol> 4. RuBisCO פעילות carboxylase מסנן Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 125 μL של lysate מסיסים אל צינור 15 מ&quot;ל שווי microcentrifuge בורג (CAP לא צריך) כי כבר קר על הקרח. לקבלת דוגמיות שליטה שליליות, להוסיף 125 lysate מסיסים μL עד 15 מ&quot;ל צינור כובע בורג microcentrifuge, אבל לא להוסיף מצע (בשלב 4.7). לרוץלשכפל את התגובות של כל דגימות בקרות שליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של חיץ assay טרי (50 מ&quot;מ Bicine-NaOH, pH 8.0, 50 מ&quot;מ NaHCO 3, 25 מ&quot;מ MgCl 2) ומקררים על קרח. מספיק למאגר assay עבור כל דגימות בקרות שליליות (100 μL לדגימה / בקרת פלוס 100 תוספת μL) למבחנה 5 מ&quot;ל aliquot. לבצע את כל השלבים הבאים מתחת במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μL לאא 14 CO 3 (500 μCi / מ&quot;ל) לכל מ&quot;ל של חיץ assay למאגר aliquoted ולשמור על חיץ על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μL של למאגר assay המכיל 14 C ו לדלל אותו מ&quot;ל 1 של חיץ assay. לאחר היפוך לערבב, להוסיף 100 μL של תערובת מדוללת 1:100 ל 3 מ&quot;ל של הנצנץ השני Bio-Safe לספור קוקטייל בבקבוקון נצנץ. הפוך לערבב. ספירת נצנץ (Beckman LS6500) צריך להיות מעל 18,000 עותקים לדקה לפני המשך assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מספיק לאא 14 CO 3 נוספה למאגר assay,להעביר את צינורות תגובה אמבטיה יבש מראש ל 25 מעלות צלזיוס, דגירה של 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 חיץ assay μL על lysates ו דגירה במשך 5 דקות במהירות של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של bisphosphate Ribulose 15 מ&quot;מ, כדי דגימות ומאפשרים תגובה להמשיך עבור 5-10 דקות במהירות של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 חומצה propionic μL (100%) (פישר) כדי לעצור את התגובה. סרכזת שעה 1 XG ב 2000 למצות מאוגדים 14 ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הנפח הכולל של הדגימות כדי בקבוקונים המכילים נצנץ 3 מ&quot;ל Bio-Safe II קוקטייל נצנץ לספור. קביעת עלות לאלף הופעות של מוצרים חומצה הקצה יציבים על ידי ספירת נצנץ (ב &#39;ויטה, ר&#39; Tabita תקשורת אישית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב שיעורי RuBisCO פעילות CHL בסיס 14. </li></ol> 5. נציג תוצאות ניצלנו culturing העשרה לבודד phototrophic קר מותאמת protists mixotrophic המתגוררים L אנטארקטיקהאייק בוני. כדי ללכוד מגוון גדול יותר של אורגניזמים, בדקנו שלושה סוגי מדיה צמיחה: בינוני בסל של מודגש (BBM) 15, F/2-Si ימית בינוני 16, 17 ו BG11 בינוני 18. בדיקה ויזואלית של תרבויות העשרה על ידי מיקרוסקופ אור גילה כי התרבויות נשלטו על ידי protists phototrophic (מסומן על ידי נוכחות של הפיגמנט כלורופיל ברוב התאים) והוא טיפח מגוון מורפולוגיות סלולריים, תלוי בעומק הדגימה שממנה נלקח הבידוד ואת סוג המדיה המשמשים התרבות (איור 1). מדדנו שיעורי מקסימום של פעילות carboxylase catalyzed ידי RuBisCO האנזים כמו proxy עבור פוטנציאל קיבוע הפחמן. שפע CHL היה פיקוח גם הערכה של ביומסה הפרוטיסטי phototrophic (איור 2). למרות גידול של התרבויות תחת משטר הטמפרטורה / אור זהה (כלומר, 4 ° C/20 μmol m -2 s -1), קיבוע פחמן פוטנציאלו ביומסה phototrophic מגוונות דרמטי בין תרבויות העשרה. הפעילות המקסימלית RuBisCO נצפתה בתרבויות העשרה הגדלים או BBM (Enrichments 4 ו -6) או BG11 (Enrichments 13 ו -14) מדיה הצמיחה, בעוד תרבויות מועשר על המדיום F / 2 הצמיחה (Enrichments 19, 21, 23) הציג 4 - ל 34, לקפל פעילויות נמוכות carboxylase מקסימלית. הבדלים אלה לא היו בשל רמות נמוכות יותר ביומסה ה-F / 2 תרבויות, כפעילות carboxylase באה לידי ביטוי באופן CHL. יתר על כן, הפעילות RuBisCO לא לתאם עם ריכוז CHL (r = -0.023, p&gt; .1:. איור 2, הבלעה). תרבויות BBM מחוסן עם מים באגם מ מ 6 מ &#39;ו 15 (Enrichments 4 ו -5) היה הגבוה ביותר CHL כמה רמות, כאשר כל התרבויות האחרות הציגו CHL נמוך יחסית, ללא תלות פעילות האנזים RuBisCO (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> באיור 1.חיידקים נציג eukaryote העשרה תרבויות אשר נבחרים לצמיחה של אורגניזמים שונים. הזהות של התרבות ניתנת השמאלי התחתון של הלוחות. כל התמונות לייצג micrographs האור שנוצר באמצעות טבילה שמן בהגדלה 1000x. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> איור 2. פוטנציאל קיבוע הפחמן הקיבולת כלורופיל להפיק כמה רמות eukaryote אנטארקטיקה חיידקים תרבויות העשרה מבודד אגם בוני ו גדל על תרבות התקשורת השונים. ראה לוח 1 לפרטים התרבות הבלעה. מתאם פירסון בין כלורופיל פוטנציאל שפע קיבוע הפחמן ב eukaryote אנטארקטיקה תרבויות חיידקים העשרה.

<ol>
	<li>Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. P., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., H&#252;ner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+acclimation+of+photosynthetic+microorganisms+to+permanently+cold+environments.">Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments.</a> Microbiol Mol. Biol. Rev. 70, 222-252 (2006).</li><li>Priscu, J. C., Wolf, C. F., Takacs, C. D., Fritsen, C. H., Laybourn-Parry, J., Roberts, J. K. M., Berry-Lyons, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+transformations+in+the+water+column+of+a+perennially+ice-covered+Antarctic+Lake.">Carbon transformations in the water column of a perennially ice-covered Antarctic Lake.</a> Biosci. 49, 997-1008 (1999).</li><li>Caron, D. A., Worden, A. Z., Countway, P. D., Demir, E., Heidelberg, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protists+are+microbes+too:+a+perspective.">Protists are microbes too: a perspective.</a> ISME J. 3, 4-12 (2009).</li><li>Bielewicz, S., Bell, E. M., Kong, W., Friedberg, I., Priscu, J. C., Morgan-Kiss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+diversity+in+a+permanently+ice-covered+Antarctic+lake+during+the+polar+night+transition.">Protist diversity in a permanently ice-covered Antarctic lake during the polar night transition.</a> ISME J. 5, 1559-1564 (2011).</li><li>Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+place+too+cold.">No place too cold.</a> Science. 324, 1521-1522 (2009).</li><li>Roberts, E. C., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophic+cryptophytes+and+their+predators+in+the+Dry+Valley+lakes+of+Antarctica.">Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica.</a> Freshwat. Biol. 41, 737-746 (1999).</li><li>Roberts, E. C., Priscu, J. C., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplankton+dynamics+in+a+perennially+ice-covered+Antarctic+lake-Lake+Hoare.">Microplankton dynamics in a perennially ice-covered Antarctic lake-Lake Hoare.</a> Freshwat Biol. 27, 238-249 (2004).</li><li>Bell, E. M., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophy+in+the+Antarctic+phytoflagellate+Pyramimonas+gelidicola.">Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate Pyramimonas gelidicola.</a> J. Phycol. 39, 644-649 (2003).</li><li>De Wever, A., Leliaert, F., Verleyen, E., Vanormelingen, P., Van der Gucht, K., Hodgson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+levels+of+phylodiversity+in+Antarctic+green+algae:+further+evidence+for+the+existence+of+glacial+refugia.">Hidden levels of phylodiversity in Antarctic green algae: further evidence for the existence of glacial refugia.</a> Proc. Biol. Sci. , 276-3591 (2009).</li><li>Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+mechanisms+in+Antarctic+lakes.">Survival mechanisms in Antarctic lakes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357, 863-869 (2002).</li><li>Lizotte, M. P., Priscu, J. C., Priscu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+succession+and+fate+of+phytoplankton+in+the+dry+valley+lakes+of+Antarctica,+based+on+pigment+analysis.">Distribution, succession and fate of phytoplankton in the dry valley lakes of Antarctica, based on pigment analysis.</a> Ecosystem Dynamics in a Polar Desert: The McMurdo Dry Valleys. , 229-240 (1998).</li><li>Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+abundance+protein+in+the+world.">Most abundance protein in the world.</a> Tren. Biochem. Sci. 4, 241-244 (1979).</li><li>Tortell, P. D., Martin, C. L., Corkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+carbon+uptake+and+intracellular+assimilation+by+subarctic+Pacific+phytoplankton+assemblages.">Inorganic carbon uptake and intracellular assimilation by subarctic Pacific phytoplankton assemblages.</a> Limnol. Oceanogr. 51, 2102-2110 (2006).</li><li>Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+spectrophotometric+equations+for+determining+chlorophyll+a,+b,+c1,+c2+in+higher+plants,+algae+and+natural+phytoplankton.">New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c1, c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton.</a> Biochem. Physiol. Pflanz. 167, 191-194 (1975).</li><li>Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., H&#252;ner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+the+photochemical+apparatus+of+the+Antarctic+green+alga,+Chlamydomonas+subcaudata.">Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata.</a> Photosyn. Res. 56, 303-314 (1998).</li><li>Guillard, R. R. L., Smith, W. L., Chanley, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+phytoplankton+for+feeding+marine+invertebrates.">Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates.</a> Culture of Marine Invertebrate Animals. , 29-60 (1975).</li><li>Johnson, M. D., Tengs, T., Oldach, D., Stoecker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequestration,+performance,+and+functional+control+of+cryptophyte+plastids+in+the+ciliate+Myrionecta+rubra+(Ciliophora.">Sequestration, performance, and functional control of cryptophyte plastids in the ciliate Myrionecta rubra (Ciliophora.</a> J. Phycol. 42, 1235-1246 (2006).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J., Herdman, M., Stanier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+assignments,+strain+histories+and+properties+of+pure+cultures+of+cyanobacteria.">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria.</a> J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Not, F., del Campo, J., Balague, V., De Vargas, C., Massana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+diversity+of+marine+picoeukaryotes.">New insights into the diversity of marine picoeukaryotes.</a> PLoS ONE. 4, e7143 (2009).</li><li>Sherr, B. F., Sherr, E. B., Caron, D. A., Vaulot, D., Worden, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oceanic+Protists.">Oceanic Protists.</a> Oceanography. 20, 130-135 (2007).</li><li>Finlay, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+taxonomy:+an+ecological+perspective.">Protist taxonomy: an ecological perspective.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359, 599-610 (2004).</li><li>Foissner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+diversity:+estimates+of+the+near-imponderable.">Protist diversity: estimates of the near-imponderable.</a> Protist. 150, 363-368 (1999).</li><li>Gast, R. J., Moran, D. M., Dennett, M. R., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kleptoplasty+in+an+Antarctic+dinoflagellate:+caught+in+evolutionary+transition.">Kleptoplasty in an Antarctic dinoflagellate: caught in evolutionary transition.</a> Environmental Microbiology. 9, 39-45 (2007).</li><li>Gast, R. J., Moran, M. A., Beaudoin, D. J., Blythe, J. N., Dennett, M. R., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+abundance+of+a+novel+dinoflagellate+phylotype+in+the+Ross+Sea.">High abundance of a novel dinoflagellate phylotype in the Ross Sea.</a> Antarctica. J. Phycol. 42, 233-242 (2006).</li><li>Moran, D. M., Anderson, O. R., Dennett, M. R., Caron, D. A., Gast, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Description+of+Seven+Antarctic+Marine+Gymnamoebae+Including+a+New+Subspecies,+Two+New+Species+and+a+New+Genus:+Neoparamoeba+aestuarina+antarctica+n.+subsp.,+Platyamoeba+oblongata+n.+sp.,+Platyamoeba+contorta+n.+sp.+and+Vermistella+antarctica+n.+gen.+n.+sp.">A Description of Seven Antarctic Marine Gymnamoebae Including a New Subspecies, Two New Species and a New Genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n. sp.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 54, 169-183 (2007).</li><li>Rose, J. M., Vora, N. M., Countway, P. D., Gast, R. J., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+and+gross+growth+efficiency+of+an+Antarctic+bacterivorous+protist.">Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist.</a> The ISME journal. 3, 252-260 (2009).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

מחקרים מולקולריים האחרונות דיווחו על מגוון גבוה של חד תאיים אאוקריוטים במגוון של סביבות 3, 19, 20, אולם בשל חוסר מבודד על פני מגוון רחב של בתי גידול לפרוטיסטים התפקידים תפקודית של אותם מינים בודדים רשתות המזון בעיקר לא ידוע. במחקר זה, שתיארנו מתודולוגיות להעשיר עב?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> BBM </td><td> סיגמא </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> סיגמא </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> סיגמא </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F מסנן, 25 מ&quot;מ </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F מסנן, 47 מ&quot;מ </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethersulfone מסנן, נקבוביות 0.45 מיקרומטר, 47 מ&quot;מ </td><td> מל מדעי החיים </td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td> תא סטרילי בקבוק תרבות, 25 ס&quot;מ 2 </td><td> קורנינג </td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurnaאני קאמרית הצמיחה </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> Zirconia / חרוזים סיליקה, 0.1 מ&quot;מ diamter </td><td> BioSpec מוצרים </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> מיני מכה ביד </td><td> BioSpec מוצרים </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> בורג יתר microcentrifuge צינור (1.5 μL) </td><td> ארה&quot;ב מדעי </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> לאא 14 CO 3 </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> לשמור על aliquots של μL 400 ב -20 ° C </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> סיגמא </td><td> R0878-100 מ&quot;ג </td><td> ממיסים בחומצה 10 טריס-propionic מ&quot;מ (pH 6.5) </td></tr></tbody></table>

establishment of microbial eukaryotic enrichment cultures from a chemically stratified antarctic lake and assessment of carbon fixation potential

אגם בוני הוא אחד רבים לצמיתות מכוסי קרח אגמים הממוקם בעמקים יבש מקמרדו אנטארקטיקה. כיסוי קרח רב שנתי שומרת על עמודת המים מרובדת כימית שלא כמו גופים אחרים בפנים הארץ של מים, בעיקר מונע קלט חיצוני של פחמן וחומרים מזינים מן הזרמים. Biota חשופים ללחצים סביבתיים רבים, בהם חסר כל השנה תזונה חמורה, בטמפרטורות נמוכות, גוון קיצוני, hypersalinity ו -24 שעות חושך בחורף 1. אלה תנאים סביבתיים קיצוניים להגביל את biota באגם בוני כמעט אך ורק מיקרואורגניזמים 2. חד תאיים אאוקריוטים חיידקים (המכונה &quot;protists&quot;) הם שחקנים חשובים אופניים biogeochemical העולמי 3 ו ממלאים תפקידים אקולוגיים חשובים רכיבה על אופניים של פחמן האגמים יבשים העמק, כובש את שני התפקידים הראשיים שלישוני של האינטרנט המזון הימית. ב יבש העמק אינטרנט מימיים מזון, protists כי אני לתקןפחמן norganic (autotrophy) הם המפיקים הגדולים של פחמן אורגני עבור אורגניזמים organotrophic 4, 2. Phagotrophic או protists heterotrophic המסוגלים בליעת חיידקים protists קטנים יותר לשמש הטורפים הטובים ביותר במארג המזון 5. לאחרונה, שיעור ידוע של האוכלוסייה הפרוטיסטי מסוגל חילוף החומרים mixotrophic משולב 6, 7. Mixotrophy ב protists כולל היכולת לשלב יכולת הפוטוסינתזה עם בליעה phagotrophic של מיקרואורגניזמים טרף. צורה זו של mixotrophy שונה חילוף החומרים mixotrophic במינים חיידקים, אשר בדרך כלל כרוך מומס ספיגת מולקולות פחמן. כרגע יש מבודד לפרוטיסטים מעט מאוד מן האגמים הקוטב לצמיתות קרח כתרים, ומחקרים של גיוון הפרוטיסטי ואקולוגיה בסביבה קיצונית זו היה מוגבל 8, 4, 9, 10, 5. הבנה טובה יותר של גמישות מטבולית הפרוטיסטי על מארג מזון פשוט יבש האגם העמק יסייע בפיתוח מודלים של ROLE של protists במחזור הפחמן העולמי. העסקנו תרבות והעשרה הגישה לבודד protists phototrophic פוטנציאל mixotrophic מאגם בוני. בעומק דגימה בעמודת המים נבחרו בהתבסס על המיקום של הייצור מקסימה ראשונית הפרוטיסטי פילוגנטי מגוון 4, 11, כמו גם משונות הגורמים העיקריים המשפיעים אביוטי trophic לפרוטיסטים מצבים: עומק דגימה רדודים מוגבלים עבור החומרים המזינים העיקריים, בעוד דגימה עומק עמוקות יותר מוגבלים על ידי זמינות האור. בנוסף, דגימות אגם מים נוספו עם סוגים שונים של מדיה צמיחה כדי לקדם את הצמיחה של מגוון רחב של אורגניזמים phototrophic. RuBisCO מזרז את קצב הגבלת צעד בנסון קלווין Bassham (CBB) מחזור, מסלול העיקרי שבאמצעותו אורגניזמים autotrophic לתקן פחמן אורגני ולספק פחמן אורגני על רמות גבוהות יותר trophic רשתות המזון הימית 12 ו יבשתי. במחקר הנוכחי, Wדואר להחיל assay radioisotope שונה עבור דגימות מסוננות 13 כדי לעקוב אחר פעילות carboxylase המרבי כ-proxy עבור פוטנציאל קיבוע הפחמן צדדיות מטבולית בתרבויות בוני אגם העשרה.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential at JoVE.com

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

אאוקריוטים חיידקים הם גם מקור של פחמן photosynthetically הנגזרות ואת הדף מינים טורפים ב לצמיתות מכוסי קרח אגמים אנטארקטיקה. דו&quot;ח זה מתאר תרבות והעשרה הגישה לבודד מטבולית אאוקריוטים חיידקים צדדי מן האגם אנטארקטיקה, אגם בוני, ומעריך את הפוטנציאל אורגניים קיבוע פחמן באמצעות assay radioisotope עבור Ribulose-1 ,5-bisphophate פעילות oxygenase (RuBisCO) carboxylase.

הקמת מיקרוביאלית תרבויות העשרה האיקריוטים מ שכבתית כימית אנטארקטיקה אגם והערכת פוטנציאל קיבוע פחמן

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

establishment-microbial-eukaryotic-enrichment-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  Miami University. אאוקריוטים חיידקים הם גם מקור של פחמן photosynthetically הנגזרות ואת הדף מינים טורפים ב לצמיתות מכוסי קרח אגמים אנטארקטיקה. דו"ח זה מתאר תרבות והעשרה הגישה לבודד מטבולית אאוקריוטים חיידקים צדדי מן האגם אנטארקטיקה, אגם בוני, ומעריך את הפוטנציאל אורגניים קיבוע פחמן באמ...

Video: Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

והעשרה של תאים NK מ דם אדם עם קיט RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

פרוטוקול להצפנה באמצעות גנים להגדיר העשרה ניתוח כדי לזהות את המודל החייתי המתאים עבור המחקר Translational

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

מדידת פוטופיזיולוגיה של השלב המצורף של קולאקיום sp. על ידי פלואורומטר קצב חזרה מהירה מסוג Cuvette

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.