Yazarlar J. Priscu, A. Chiuchiolo toplanması ve Antarktika&#39;daki örneklerinin korunması konusunda yardım almak için McMurdo tlar limnoloji ekibinize teşekkür. Biz lojistik destek Ratheon Polar Hizmetler ve PHI helikopterler teşekkür ederiz. Işık mikrograflar Gelişmiş Mikroskopi ve Görüntüleme Merkezi için Miami&#39;nin Merkezi oluşturulmuştur. Bu çalışma Polar Programları Hibe 0631659 ve 1056396 ile NSF Ofisi tarafından desteklenmiştir.

1. Numune Alma <ol><li> Seçin ve su kolonu örnekleme önce bir gün örnekleme sitesini hazırlamak. Bu su kolonunun tabakalı katmanları sondaj ve buz delik erime nedeniyle rahatsızlıklardan sonra reform sağlayacaktır. GPS ile matkap sitenin konumunu tanımlayın. </li><li> Su sütunu erişmek için, bir 4-inç Jiffy uçuş uzatma ve kesme bit bağlı bir Jiffy buz burgusu ile buz bir delik delerek başlar. Delik delme donmasını önlemek için, su kolonunun üst seviyesinde sondaj yaklaşık 4-6 santim durdurarak sıvı suya sondaj kaçınıyorum. </li><li> Delik önce örnekleme için 15 ile 60 cm çapı genişlemiş gerekecektir. Bu, bir bakır boru yoluyla ısıtılmış polietilen glikol sirküle bir delik eritici (Hotsy Model) kullanılması ile gerçekleştirilir. Delik erime genellikle 18 saat kadar sürer. </li><li> Önce su kolonu örnekleme, emin olun gerekli tüm ekipman ve örnek stOraj damarları örnekleme yerinde monte edilir. Örnekleme malzemeleri: Niskin şişe (5-10 lt kapasiteli), derinlik-kalibre kablo ile Vinç, Messenger, her örnekleme derinlik için yeterli numune şişeleri ve numune taşıma için soğutucular. </li><li> Gölün su filtreleme örnekleme gününde tamamlanması gerektiği gibi, günün erken saatlerinde (~ 5 am) örnekleme başlayın. Kalibre edilmiş bir bağlanmış bir Niskin örnekleyici kullanılarak: (6-m, 15 m-ve buz deliğe piyezometrik su seviyesi ile ölçülen 18-m örnekleme derinlikleri, bu çalışma için) istenen derinlikleri su numuneleri (1-5 L) toplamak el vinci. Su sütunu olumsuz yönde etkilenmemesi için daha derin olanlar önce sığ derinliklerde toplamak. </li><li> Mağaza göl örnekleri soğutucular ve örnek sitesinden bir ATV (tüm arazi aracı) bağlı bir kızak kullanılarak alanına laboratuara taşımacılığında. Alan laboratuar hemen aşağıdaki Örnekleme: Numuneler işlenmiş veya (sıvı azot flaş dondurma örn) stabilize edilmelidir. </li></ol> 2. DevelopmeZenginleştirme Kültürlerin nt <ol><li> Zenginleştirme kültürlerin ekimi için, nazik filtrasyon (&lt;0.3 atm) kullanılarak 47 mm 0.45 mikron gözenek büyüklüğüne polyethersulfone filtreleri üzerine göl suyunun 0.5-1 L Konsantre. Doğal toplumun çeşitliliğinin istenirse, 47 mm 0.45 mikron gözenek büyüklüğüne polyethersulfone filtreler üzerine ikinci bir numune filtre ve. 4 ökaryot filogenetik çeşitliliği Bielewicz ark göre protokolleri uygulayın. </li><li> Filtre olarak aynı örnekleme derinlik toplanan filtre göl suyunun ~ 20 mL içeren 50 ml steril falcon tüp filtre aktarın. Yavaşça steril bir pipet kullanarak filtre hücreleri yıkayın. </li><li> 25 cm 2 steril hücre kültürü şişesi için hücre süspansiyonu aktarın. 45 mL kültür hacmini artırmak için her bir örnek derinliği toplanan filtre göl suyu ekleyin. Farklı kültür ortamı üzerinde zenginleşme istendiğinde birden her örnekleme derinlik çoğaltır ayarlayın. </li><li> 50X s ile kültür şişeleri SupplementKalın en Bazal Orta, BG11 ve F / 2: şu kültür ortamının 1X bir son konsantrasyon elde etmek terile çözümler. Mixotrophic organizmaların ekimi, set-up iki F/2-supplemented gemi gereklidir ve matara birine steril pirinç 2-3 tane eklemek durumunda. </li><li> Lütfen ABD laboratuvara Sevkiyat öncesi Antarktika&#39;daki en az 4 hafta boyunca sıcaklık kontrollü bir büyüme inkübatör düşük sıcaklıkta (4 ° C) ve düşük ışınım (20 ľmol fotonlar m -2 s -1) de kültür şişeleri inkübe edin. 2 hafta inkübasyondan sonra uygun büyüme ortamı içeren agar üzerinde zenginleştirme kültür izolatları arzu ediyorsanız, plaka 250 uL. </li><li> ABD, steril 50 ml falcon tüpleri transfer zenginleştirme kültürleri gönderilecek. Talebi sevk gereksinimi &quot;dondurmak değil&quot; ve istek nakliye üzerine &quot;soğuk tutmak&quot;. Antarktika&#39;dan nakliye işlemi nispeten hızlı (2 hafta ticari hava) ve oldukça güvenilir olmasına rağmen, titiz organ kaybı olasılığı vardırtaşıma işlemi sırasında izm. Böylece, araştırmacılar nakliye işlemi sırasında bazı türlerin kaybının değerlendirilmesi, böylece nakliye öncesinde bir alt örnek korumak isteyebilirsiniz. </li><li> ABD&#39;de geldikten sonra, bir 125 ml steril Erlenmeyer şişesinde uygun büyüme ortamı 45 mL içine zenginleştirme kültür transferi 5 mL steril bir sünger ile kaplandı. Zenginleştirme kültürleri 4 de kontrollü çevre büyüme odası (sadece gündüz Büyüme Odası, VWR) ° C/20 ľmol fotonlar m -2 s -1 bir sıcaklık kültürler ayakta olarak muhafaza edilmelidir. Kültürler taze medya her 30 günde bir transfer edilmelidir. </li></ol> 3. Filtreli zenginleşme gelen Hücre Lysate Ekstraksiyon <ol><li> Hafif vakumlu (&lt;10 psi) ile bir 25 mm Whatman GF / F filtresi üzerine zenginleştirme kültür filtrenin 5 mL. Filtre -80 birkaç hafta saklanabilir ° C önceden RUBISCO&#39;nun aktivite içlin için. </li><li> Steril çelik makas ile 4-5 bölüme filtre kesin veaktarmak 2 ml vidalı kapaklı tüpe steril forseps adet 0.1 mm çapında zirkonyum / silika boncuklar ile tam yolu beşte birini doldurdu. </li><li> 10 mM NaHCO 3, 10 mM DTT, 3.3 mM aminokaproik: taze eklemek; filtre ekstraksiyon tamponu 1.25 ml (50 mM bicine, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA,% 0.1 Triton X-100 ekleme asit, 0.7 mM benzamidin, pH 7.8) 13 ve hız ayarı 48. 30&#39;lu için Minibead çırpıcı üç kez kullanarak hücrelerin bozabilir. 1 dakika buz inkübasyon ile örnek ısıtma, alternatif beadbeating önlemek için. </li><li> GF / F filtresi elyaflar ve hücre duvarı kalıntı gevşek bir pelet oluşturmak için 4 ° C&#39;de 3.000 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüje bulamaç filtre. </li><li> Buz% 90 aseton 800 uL bir 200 ul tablet ve suya batırın çıkarın. Ekstrakte klorofil ölçün (chl) 664 nm ve 647 nm dalga boyunda 14 değerlerinde bir spektrofotometre bir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın. </li><li> Remaini Santrifüj4 at ng süpernatant ° 2 15.000 xg&#39;de dk ve temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe (çözünmez hücre zarının pelet ve kalan GF / F filtre lifleri kaçının) Süpernatant aktarmak için C. Bu çözünür hücre lizatı artık RUBISCO&#39;nun karboksilaz aktivite tayini için kullanılabilir. </li><li> Lizat -80 ° C&#39;de sıvı azot içinde% 12.5 gliserol ve flaş donma eklenmesinden sonra saklanabilir. Aktivite kaybı lizatı enzimlerin hassasiyetine bağlı olarak birden fazla donma / çözülme döngüsünden sonra oluşabilir. Bu nedenle, taze donmuş lizatı karşı aktivitesi büyük ölçekli hücre lizatı çekimlerinden önce test edilmelidir. </li></ol> 4. RUBISCO&#39;nun karboksilaz Aktivitesi Filtre Testi <ol><li> Buz üzerinde soğutulmuş olan bir 15 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpü (gerekli değildir kap) çözünür lizat 125 uL aktarın. Negatif kontrol örnekleri için, 15 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpüne 125 uL çözünür lizat ekleyebilirsiniz, ancak (Adım 4.7) substrat ilave etmeyiniz. Çalıştırmaktüm örnekler ve negatif kontroller için reaksiyonlar çoğaltın. </li><li> 10 taze tahlil tamponu mL (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO 3, 25 mM MgCl2) ve buz üzerinde soğutucu hazırlayın. Yeterli bir 5 ml tüp örnekleri ve negatif kontroller (örnek / kontrol artı 100 uL ekstra başına 100 uL) tümü için tahlil tampon kısım. Bir çeker ocak altında sonraki tüm adımları uygulayın. </li><li> 14 CO 3 (500 μCi / ml) mL başına bölünüp tampon tahlil tamponu NaH 40 uL ekleyin ve buz üzerinde tampon tutun. </li><li> 14 C içeren tahlil tampon 10 uL kaldırmak ve deney tamponu 1 mL içinde tamamlanır. Karıştırmak için ters sonra, bir sintilasyon flakonda kokteyl sayma Bio-Safe II sintilasyon 3 mL 1:100 sulandırılmış karışımı 100 mcL ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin. Sintilasyon sayımı (Beckman LS6500) yöntemi ile devam etmeden önce 18.000 kopya üzerinde olmalıdır. </li><li> Yeterince NaH 14 CO 3 deney tamponu ilave edildiğinde,3-5 dakika için 25 ° C ile inkübe için önceden belirlenmiş bir kuru banyosuna reaksiyon tüpleri hareket eder. </li><li> Lizatları ila 100 uL deney tamponu ekleyin ve 25 de 5 dakika inkübe ° C. </li><li> Numuneler için, 15 mM Ribuloz bisfosfatın 20 uL ekleyin ve reaksiyon 25 dakika için 5-10 ilerlemesine izin ° C. </li><li> Reaksiyonu durdurmak için 100 uL propionik asit (100%) (Fischer) eklenir. Tüzel kişiliği olmayan 14 C tüketmeye 2.000 xg az 1 saat santrifüjleyin </li><li> 3 ml Bio-Safe II sintilasyon sayma kokteyl içeren sintilasyon şişelerine, numunelerin toplam hacmi aktarın. Kıvılcım sayımı (B. Witte, R. Tabita kişisel iletişim) tarafından asit stabil son ürünleri kopya belirleyin. </li><li> Bir chl temeli 14 RUBISCO&#39;nun etkinlik oranları hesaplayın. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Biz soğuk adapte fototrofik ve Antarktika L ikamet eden mixotrophic protistler yalıtmak için zenginleştirme kültürü kullanılmıştırAKE Bonney. Kalın Kullanıcı Bazal Orta (BBM) 15, F/2-Si Deniz Orta 16, 17 ve BG11 Orta 18: organizmaların büyük bir çeşitlilik yakalamak için, biz üç büyüme medya türleri test. Işık mikroskobu ile zenginleştirme kültürlerin görsel denetim kültürleri fototrofik protistler (en hücrelerinde klorofil pigmentinin varlığı ile gösterilir) hâkim olduğunu göstermiştir ve bir inokulum alındığı örnekleme derinliğine bağlı olarak hücre morfolojileri çeşitliliği ve barındırmaktaydı kültürü kullanılan ortam tipi (Şekil 1). Biz karbon fiksasyonu potansiyeli için bir vekil olarak RUBISCO&#39;nun enzim tarafından katalize karboksilaz aktivitesi maksimum hızları ölçüldü. Chl bir bolluk da fototrofik protist biyokütle tahmini (Şekil 2) olarak izlendi. Aynı sıcaklık / ışık rejimi (yani 4 ° C/20 mol m -2 s -1), karbon fiksasyonu potansiyeli altındaki tüm kültürlerin ekimi rağmenve fototrofik biyokütle zenginleştirme kültürleri farklı biçimde hissedildi. Kültürler, bir 4 sergilenen F / 2 büyüme medyumu (zenginleşmesi 19, 21, 23) üzerindeki zenginleştirilmiş iken maksimum RUBISCO&#39;nun aktivitesi, BBM (zenginleşmesi 4 ve 6) ya da BG11 (zenginleşmesi 13 ve 14) büyüme ortamında ya da büyüyen bir zenginleşmesi kültürler gözlendi - 34 kat daha düşük maksimum karboksilaz faaliyetleri. Karboksilaz aktivitesi Chl bir bazında olduğu gibi bu farklılıklar, F / 2 kültürde düşük biyokütle düzeyleri nedeniyle değildi. Ayrıca, RUBISCO&#39;nun aktivite chl bir konsantrasyon (.; Şekil 2, inset r = -0,023, p&gt; 0.1) ile ilişkili değildir. Diğer tüm kültürler, bir, bağımsız olarak RUBISCO&#39;nun enzim aktivitesinin (Şekil 2) nispeten düşük Chl teşhir ederken 6 m ve m 15 (zenginleşmesi 4 ve 5) den göl suyu ile inoküle BBM kültürler, yüksek Chl, bir seviyesine sahipti. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> Şekil 1..Temsilcisi mikrobiyal ökaryot zenginleştirme farklı organizmaların büyümesi için seçtik kültürler. Kültür Kimlik panelleri sol alt verilmiştir. Tüm görüntüler 1000X büyütmede immersiyon yağı kullanılarak oluşturulan ışık mikrografikleri temsil eder. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> Şekil 2. Potansiyel karbon fiksasyon kapasitesi ve ekstrakte klorofil Gölü Bonney izole ve çeşitli kültür ortamında yetişen Antarktika mikrobiyal ökaryot zenginleştirme kültürleri bir düzeyde. Kültürü için Tablo 1&#39;e bakınız Ankastre:. Klorofil arasındaki Pearson korelasyon Antarktika mikrobiyal ökaryot zenginleştirme kültürleri bir bolluk ve karbon fiksasyonu potansiyeli.

<ol>
	<li>Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. P., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., H&#252;ner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+acclimation+of+photosynthetic+microorganisms+to+permanently+cold+environments.">Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments.</a> Microbiol Mol. Biol. Rev. 70, 222-252 (2006).</li><li>Priscu, J. C., Wolf, C. F., Takacs, C. D., Fritsen, C. H., Laybourn-Parry, J., Roberts, J. K. M., Berry-Lyons, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+transformations+in+the+water+column+of+a+perennially+ice-covered+Antarctic+Lake.">Carbon transformations in the water column of a perennially ice-covered Antarctic Lake.</a> Biosci. 49, 997-1008 (1999).</li><li>Caron, D. A., Worden, A. Z., Countway, P. D., Demir, E., Heidelberg, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protists+are+microbes+too:+a+perspective.">Protists are microbes too: a perspective.</a> ISME J. 3, 4-12 (2009).</li><li>Bielewicz, S., Bell, E. M., Kong, W., Friedberg, I., Priscu, J. C., Morgan-Kiss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+diversity+in+a+permanently+ice-covered+Antarctic+lake+during+the+polar+night+transition.">Protist diversity in a permanently ice-covered Antarctic lake during the polar night transition.</a> ISME J. 5, 1559-1564 (2011).</li><li>Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+place+too+cold.">No place too cold.</a> Science. 324, 1521-1522 (2009).</li><li>Roberts, E. C., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophic+cryptophytes+and+their+predators+in+the+Dry+Valley+lakes+of+Antarctica.">Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica.</a> Freshwat. Biol. 41, 737-746 (1999).</li><li>Roberts, E. C., Priscu, J. C., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplankton+dynamics+in+a+perennially+ice-covered+Antarctic+lake-Lake+Hoare.">Microplankton dynamics in a perennially ice-covered Antarctic lake-Lake Hoare.</a> Freshwat Biol. 27, 238-249 (2004).</li><li>Bell, E. M., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophy+in+the+Antarctic+phytoflagellate+Pyramimonas+gelidicola.">Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate Pyramimonas gelidicola.</a> J. Phycol. 39, 644-649 (2003).</li><li>De Wever, A., Leliaert, F., Verleyen, E., Vanormelingen, P., Van der Gucht, K., Hodgson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+levels+of+phylodiversity+in+Antarctic+green+algae:+further+evidence+for+the+existence+of+glacial+refugia.">Hidden levels of phylodiversity in Antarctic green algae: further evidence for the existence of glacial refugia.</a> Proc. Biol. Sci. , 276-3591 (2009).</li><li>Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+mechanisms+in+Antarctic+lakes.">Survival mechanisms in Antarctic lakes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357, 863-869 (2002).</li><li>Lizotte, M. P., Priscu, J. C., Priscu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+succession+and+fate+of+phytoplankton+in+the+dry+valley+lakes+of+Antarctica,+based+on+pigment+analysis.">Distribution, succession and fate of phytoplankton in the dry valley lakes of Antarctica, based on pigment analysis.</a> Ecosystem Dynamics in a Polar Desert: The McMurdo Dry Valleys. , 229-240 (1998).</li><li>Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+abundance+protein+in+the+world.">Most abundance protein in the world.</a> Tren. Biochem. Sci. 4, 241-244 (1979).</li><li>Tortell, P. D., Martin, C. L., Corkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+carbon+uptake+and+intracellular+assimilation+by+subarctic+Pacific+phytoplankton+assemblages.">Inorganic carbon uptake and intracellular assimilation by subarctic Pacific phytoplankton assemblages.</a> Limnol. Oceanogr. 51, 2102-2110 (2006).</li><li>Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+spectrophotometric+equations+for+determining+chlorophyll+a,+b,+c1,+c2+in+higher+plants,+algae+and+natural+phytoplankton.">New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c1, c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton.</a> Biochem. Physiol. Pflanz. 167, 191-194 (1975).</li><li>Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., H&#252;ner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+the+photochemical+apparatus+of+the+Antarctic+green+alga,+Chlamydomonas+subcaudata.">Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata.</a> Photosyn. Res. 56, 303-314 (1998).</li><li>Guillard, R. R. L., Smith, W. L., Chanley, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+phytoplankton+for+feeding+marine+invertebrates.">Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates.</a> Culture of Marine Invertebrate Animals. , 29-60 (1975).</li><li>Johnson, M. D., Tengs, T., Oldach, D., Stoecker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequestration,+performance,+and+functional+control+of+cryptophyte+plastids+in+the+ciliate+Myrionecta+rubra+(Ciliophora.">Sequestration, performance, and functional control of cryptophyte plastids in the ciliate Myrionecta rubra (Ciliophora.</a> J. Phycol. 42, 1235-1246 (2006).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J., Herdman, M., Stanier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+assignments,+strain+histories+and+properties+of+pure+cultures+of+cyanobacteria.">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria.</a> J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Not, F., del Campo, J., Balague, V., De Vargas, C., Massana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+diversity+of+marine+picoeukaryotes.">New insights into the diversity of marine picoeukaryotes.</a> PLoS ONE. 4, e7143 (2009).</li><li>Sherr, B. F., Sherr, E. B., Caron, D. A., Vaulot, D., Worden, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oceanic+Protists.">Oceanic Protists.</a> Oceanography. 20, 130-135 (2007).</li><li>Finlay, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+taxonomy:+an+ecological+perspective.">Protist taxonomy: an ecological perspective.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359, 599-610 (2004).</li><li>Foissner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protist+diversity:+estimates+of+the+near-imponderable.">Protist diversity: estimates of the near-imponderable.</a> Protist. 150, 363-368 (1999).</li><li>Gast, R. J., Moran, D. M., Dennett, M. R., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kleptoplasty+in+an+Antarctic+dinoflagellate:+caught+in+evolutionary+transition.">Kleptoplasty in an Antarctic dinoflagellate: caught in evolutionary transition.</a> Environmental Microbiology. 9, 39-45 (2007).</li><li>Gast, R. J., Moran, M. A., Beaudoin, D. J., Blythe, J. N., Dennett, M. R., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+abundance+of+a+novel+dinoflagellate+phylotype+in+the+Ross+Sea.">High abundance of a novel dinoflagellate phylotype in the Ross Sea.</a> Antarctica. J. Phycol. 42, 233-242 (2006).</li><li>Moran, D. M., Anderson, O. R., Dennett, M. R., Caron, D. A., Gast, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Description+of+Seven+Antarctic+Marine+Gymnamoebae+Including+a+New+Subspecies,+Two+New+Species+and+a+New+Genus:+Neoparamoeba+aestuarina+antarctica+n.+subsp.,+Platyamoeba+oblongata+n.+sp.,+Platyamoeba+contorta+n.+sp.+and+Vermistella+antarctica+n.+gen.+n.+sp.">A Description of Seven Antarctic Marine Gymnamoebae Including a New Subspecies, Two New Species and a New Genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n. sp.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 54, 169-183 (2007).</li><li>Rose, J. M., Vora, N. M., Countway, P. D., Gast, R. J., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+and+gross+growth+efficiency+of+an+Antarctic+bacterivorous+protist.">Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist.</a> The ISME journal. 3, 252-260 (2009).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Son yıllarda yapılan moleküler çalışmalar ortamlarda 3, 19, 20 bir dizi genelinde tek hücreli ökaryotlarda yüksek çeşitlilik bildirdin, ancak protist habitatların tam aralığında izolatların eksikliği nedeniyle bu türlerin tek tek fonksiyonel rolleri besin ağları büyük ölçüde uyumludur bilinmiyor. Bu çalışmada, nispeten undersampled ortamında, kalıcı buz kaplı Antarktika gölden metabolik yönlülük sergileyen mikrobiyal ökaryot türler için zenginleştirmek için yöntemler ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> BBM </td><td> Sigma </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> Sigma </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> Sigma </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtresi, 25 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtresi, 47 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethersulfone filtresi, 0.45 mikron gözenek, 47 mm </td><td> Pall Yaşam Bilimleri </td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td> Steril hücre kültürü şişesi, 25 cm 2 </td><td> Corning </td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurnal büyüme odası </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> Zirkonya / silika boncuk, 0,1 mm Çap </td><td> BioSpec Ürünler </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Boncuk çırpıcı </td><td> BioSpec Ürünler </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> Vida-cap mikrosantrifüj tüpü (1.5 uL) </td><td> ABD Bilimsel </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> CO 3 14 NaH </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> -20 ° C&#39;de 400 uL hacimde tutun </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> Sigma </td><td> R0878-100mg </td><td> 10 mM Tris-propionik asit (pH 6.5) içinde çözünmesi </td></tr></tbody></table>

establishment of microbial eukaryotic enrichment cultures from a chemically stratified antarctic lake and assessment of carbon fixation potential

Göl Bonney Antarktika, McMurdo Kuru Vadiler bulunan çok sayıda kalıcı buz kaplı göllerinden biridir. Çok yıllık buz örtüsü bir kimyasal tabakalı su kolonu tutar ve suyun diğer iç organları aksine, büyük ölçüde karbon ve derelerden dış kaynaklı besin girdisini önler. Biota kış döneminde 1 yıl boyunca ciddi besin yetersizliği, düşük sıcaklık, aşırı gölge, aşırı tuzlu ve 24 saat karanlık gibi birçok çevresel streslere, maruz kalmaktadır. Bu zorlu çevre koşullarında mikroorganizmaların 2 neredeyse sadece Gölü Bonney yılında biyotası sınırlar. Tek hücreli mikrobiyal ökaryotlar (&quot;protistler&quot; olarak adlandırılır) küresel biyojeokimyasal bisiklet 3 önemli oyuncu var ve sucul besin ağı birincil ve üçüncül rollerin hem işgal, kuru vadi göllerde karbon bisiklet önemli ekolojik roller oynamaktadır. I düzeltmek kuru vadi sucul besin ağı, protistler olaraknorganic karbon (autotrophy) organotrofik organizmalar için organik karbon 4, 2 büyük üreticiler. Phagotrophic veya bakteri ve küçük protistler ingesting yeteneğine sahip heterotrofik protistler besin ağı 5 en iyi avcılar olarak hareket ederler. Son, protist nüfusun bilinmeyen bir oranda kombine mixotrophic metabolizması 6, 7 yeteneğine sahiptir. Protistler içinde Mixotrophy av mikroorganizmaların phagotrophic yenmesi ile fotosentez yeteneği birleştirmek yeteneği gerektirir. Mixotrophy bu biçimi genellikle alımı çözünmüş karbon molekülleri içerir bakteri türlerinde mixotrophic metabolizması farklıdır. Orada çok az protist izolatlarının kalıcı buz kaplı kutup göllerden şu anda ve bu aşırı ortamda protist çeşitlilik ve ekoloji çalışmaları da sınırlı 8, 4, 9, 10, 5 olmuştur. Basit bir kuru vadi göl gıda web protist metabolik yönlülük daha iyi anlaşılması r için modellerin geliştirilmesinde yardımcı olacakKüresel karbon döngüsünün protistler arasında ole. Biz Gölü Bonney potansiyel olarak fototrofik ve mixotrophic protistler izole etmek için bir zenginlik kültürü yöntemi benimsenmiştir. Su sütununda Örnekleme derinliklerinde birincil üretim maksimum ve protist filogenetik çeşitliliği 4, 11 yeri gibi protist trofik modları etkileyen önemli abiyotik faktörler değişkenlik göre seçilmiştir: sığ, örnekleme derinlikleri Majör besinler için sınırlı iken derin örnekleme derinlikleri Işık durumu ile sınırlıdır. Ayrıca, göl su örneklerinin fototrofik organizmaların çeşitli büyümesini teşvik büyüme ortamı çok tip ile takviye edildi. RUBISCO&#39;nun Calvin Benson Bassham (CBB) döngüsü, ototroflarda inorganik karbon düzeltmek ve sucul ve karasal besin ağları 12 trofik seviyeleri için organik karbon sağlayacak hangi ana yolda hız sınırlama basamağı katalizler. Bu çalışmada, we Gölü Bonney zenginleştirme kültürlerde karbon fiksasyonu potansiyeli ve metabolik çok yönlülük için bir vekil olarak maksimum karboksilaz aktivitesini izlemek için filtrelenmiş örnekleri 13 için modifiye bir radyoizotop testi uygulanır.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential at JoVE.com

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Mikrobiyal ökaryotlarda hem kalıcı buz kaplı Antarktika göllerde fotosentetik kaynaklı karbon ve en yırtıcı türlerinin bir kaynağıdır. Bu rapor, Antarktika gölü Bonney gelen metabolik olarak çok yönlü mikrobiyal ökaryotlar izole etmek için bir zenginleşme kültür yaklaşımı açıklar ve Ribuloz-1 ,5-bisphophate karboksilaz oksijenaz (RUBISCO&#39;nun) faaliyeti için bir radyoizotop testi kullanılarak inorganik karbon fiksasyonu potansiyeli değerlendiriyor.

Karbon Fiksasyon Potansiyel bir Kimyasal Tabakalı Antarktika Gölü ve Ölçme Mikrobiyal Ökaryotik Zenginleştirme Kültürlerinin Kurulması

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

establishment-microbial-eukaryotic-enrichment-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Görüntüleme.  Miami University. Mikrobiyal ökaryotlarda hem kalıcı buz kaplı Antarktika göllerde fotosentetik kaynaklı karbon ve en yırtıcı türlerinin bir kaynağıdır. Bu rapor, Antarktika gölü Bonney gelen metabolik olarak çok yönlü mikrobiyal ökaryotlar izole etmek için bir zenginleşme kültür yaklaşımı açıklar ve Ribuloz-1 ,5-bisphophate karboksilaz oksijenaz (RUBISCO'nun) faaliyeti için bir radyoizotop testi kullanılarak inorganik karbon fiksasyonu potansiyeli değerl...

Video: Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

İnsan Kanı StemCell Teknolojileri RosetteSep Kit ile gelen NK Hücreleri zenginleştirilmesi

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Biyoloji

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Kanatlı Üretim Örneklerden Bakteriyel Topluluklar Nitel ve Nicel Değerlendirme Karma DNA Ekstraksiyon Yöntemi

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Gen kullanmak için bir protokol translasyonel araştırma için uygun hayvan modeli belirlemek için zenginleştirme çözümlemesi ayarla

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Gnotobiyotik Amerikan Hamamböceklerinin Kurulması ve Bakımı (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

Colacium sp.'nin Bağlı Aşamasının Fotofizyolojisinin Küvet Tipi Hızlı Tekrarlama Hızı Florometresi ile Ölçülmesi

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.