Les auteurs tiennent à remercier J. Priscu, A. Chiuchiolo et le McMurdo LTER limnologie équipe d&#39;assistance dans la collecte et la conservation des échantillons dans l&#39;Antarctique. Nous remercions Ratheon services polaires et des hélicoptères PHI pour le soutien logistique. Microscope optique ont été générés dans le centre de Miami pour la microscopie avancée et le Centre d&#39;imagerie. Ce travail a été soutenu par le Bureau de la NSF de subventions et de programmes polaires 0631659 1056396.

1. L&#39;acquisition des échantillons <ol><li> Choisir et préparer le site d&#39;échantillonnage un jour avant l&#39;échantillonnage de la colonne d&#39;eau. Cela permettra aux couches stratifiées de la colonne d&#39;eau à la réforme après la perturbation due au forage et à la glace-trou de fusion. Identifier l&#39;emplacement du site de forage par GPS. </li><li> Pour accéder à la colonne d&#39;eau, commencez par percer un trou dans la glace avec une tarière à glace Jiffy attaché à une prolongation de 4 pouces Jiffy vol et peu de coupe. Pour prévenir le gel de la perceuse dans le trou, essayez d&#39;éviter de forage dans l&#39;eau liquide par l&#39;arrêt de forage d&#39;environ 4-6 cm au-dessus du haut de la colonne d&#39;eau. </li><li> Le trou de forage devra être élargi à partir d&#39;un diamètre de 15 à 60 cm avant l&#39;échantillonnage. Ceci est réalisé par utilisation d&#39;un générateur trou (Modèle Hotsy) qui circule polyéthylèneglycol chauffé à travers un tube de cuivre. Trou de fusion prend habituellement jusqu&#39;à 18 heures. </li><li> Avant l&#39;échantillonnage de la colonne d&#39;eau, veiller à ce que tous les équipements requis et st l&#39;échantillonOrage bateaux sont assemblés sur le site d&#39;échantillonnage. Matériaux d&#39;échantillonnage comprennent: bouteille Niskin (capacité L 5-10), avec la profondeur Winch-calibré par câble, Messenger, bouteilles d&#39;échantillon suffisant pour chaque profondeur d&#39;échantillonnage et de refroidisseurs pour le transport des échantillons. </li><li> Commencer l&#39;échantillonnage tôt dans la journée (~ 5 heures), que le filtrage de l&#39;eau des lacs devrait être achevée le jour de l&#39;échantillonnage. Prélever des échantillons d&#39;eau (1-5 L) à des profondeurs désirées (pour cette étude: 6-m, 15 m et des profondeurs d&#39;échantillonnage de 18 m, mesurée à partir du niveau de l&#39;eau piézométrique dans le trou dans la glace) à l&#39;aide d&#39;un échantillonneur Niskin attaché à un calibré treuil à main. Pour éviter une perturbation de la colonne d&#39;eau de recueillir de faibles profondeurs avant plus profonds. </li><li> Magasin échantillons lacustres dans les refroidisseurs et de transport à partir du site échantillon au laboratoire champ à l&#39;aide d&#39;un traîneau attaché à un VTT (véhicule tout terrain). Les échantillons doivent être traités ou stabilisés (pour exemple: gel rapide dans l&#39;azote liquide) au laboratoire échantillonnage sur le terrain immédiatement après. </li></ol> 2. Development des cultures d&#39;enrichissement <ol><li> Pour la culture de cultures d&#39;enrichissement, de 0,5 à 1 L Concentré d&#39;eau du lac sur 47 mm filtres 0,45 um pores de taille à l&#39;aide de filtration polyéthersulfone douce (&lt;0,3 atm). Si la diversité de la communauté naturelle est souhaitée, filtrer une deuxième échantillon sur 47 mm 0,45 um pores des filtres de polyéthersulfone taille et suivre les protocoles en fonction de Bielewicz et al. 4 pour eucaryote diversité phylogénétique. </li><li> Transfert filtre à Falcon de 50 ml tube stérile contenant ~ 20 ml d&#39;eau du lac filtrée recueillies auprès de la profondeur d&#39;échantillonnage que le filtre. Lavez délicatement les cellules du filtre à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile. </li><li> Transfert suspension cellulaire à un ballon de 25 cm 2 de culture cellulaire stérile. Ajouter l&#39;eau du lac filtrée recueillies auprès de chaque profondeur de l&#39;échantillon pour augmenter le volume de la culture à 45 ml. Mettre en place plusieurs répétitions pour chaque profondeur d&#39;échantillonnage, si enrichissements sur différents milieux de culture sont souhaitées. </li><li> Supplément flacons de culture avec 50X ssolutions terile à une concentration finale de 1X des milieux de culture suivants: Moyen basale Bold, BG11 et F / 2. Si la culture d&#39;organismes mixotrophes est nécessaire, le démarrage deux navires F/2-supplemented et ajouter 2-3 grains de riz stérile l&#39;une quelconque des flacons. </li><li> Incuber flacons de culture à basse température (4 ° C) et sous faible éclairement (20 umol photons m -2 s -1) dans une croissance à température contrôlée incubateur pour au moins 4 semaines dans l&#39;Antarctique avant l&#39;expédition de votre laboratoire américain. Si des isolats sont souhaités, la plaque 250 uL de culture d&#39;enrichissement sur gélose contenant un milieu de croissance approprié, après une incubation de 2 semaines. </li><li> Pour l&#39;expédition aux États-Unis, les cultures d&#39;enrichissement de transfert aux stériles de 50 mL tubes Falcon. Exigence d&#39;expédition Demande de &quot;ne pas congeler&quot; et &quot;Keep cool&quot; sur le transport de la demande. Alors que le processus d&#39;expédition de l&#39;Antarctique est relativement rapide (2 semaines par voie aérienne commerciale) et très fiable, il ya une possibilité de perte de l&#39;organe fastidieuxismes au cours du processus de transport. Ainsi, les enquêteurs peuvent vouloir préserver un sous-échantillon avant l&#39;expédition de sorte que la perte de certaines espèces au cours du processus d&#39;expédition peut être évaluée. </li><li> À l&#39;arrivée aux États-Unis, le transfert de 5 ml de la culture d&#39;enrichissement dans 45 ml de milieux de croissance appropriés dans une fiole Erlenmeyer de 125 ml stérile coiffé d&#39;une éponge stérile. Cultures d&#39;enrichissement devrait être maintenu comme debout cultures à une température contrôlée en chambre de croissance de l&#39;environnement (Chambre de croissance diurne, VWR) à 4 ° C/20 photons umol m -2 s -1. Les cultures doivent être transférés sur des supports tous les 30 jours. </li></ol> 3. Extraction lysat cellulaire à partir enrichissements filtrées <ol><li> Filtre 5 ml de la culture d&#39;enrichissement sur un 25 mm Whatman GF / F filtre à l&#39;aide léger vide (moins de 10 psi). Le filtre peut être stocké pendant plusieurs semaines à -80 ° C avant dosage de l&#39;activité Rubisco. </li><li> Coupez le filtre en sections avec des ciseaux en acier 4-5 stériles ettransférer les pièces avec une pince stérile à un tube 2 ml bouchon à vis remplie d&#39;un cinquième de la voie complète avec 0,1 mm de diamètre de zircone / silice billes. </li><li> Ajouter 1,25 ml de tampon d&#39;extraction de filtre (50 bicine, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, et 0,1% de triton X-100, ajouter frais: 10 mM NaHCO 3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocaproïque l&#39;acide, 0,7 mM de benzamidine, pH 7,8) 13 et de perturber les cellules en utilisant un batteur Minibead trois fois pour 30 ans sur 48 réglage de la vitesse. Pour éviter un échauffement de l&#39;échantillon, beadbeating alternent avec une incubation de glace min. </li><li> Centrifugeuse suspension filtre pendant 2 minutes à 3000 x g à 4 ° C pour former une boulette de lâche GF / F fibres filtrantes et les débris paroi cellulaire. </li><li> Suppression d&#39;un aliquote de 200 ul et plongez dans 800 ul de acétone glacée 90%. Mesurer la chlorophylle extractible (chl) a dans un spectrophotomètre à des valeurs de longueur d&#39;onde de 664 nm et 647 nm 14. Transférer le surnageant dans un microtube de 1,5 mL. </li><li> Centrifuger remaining surnageant à 4 ° C pendant 2 min à 15.000 xg et de transférer le surnageant (éviter le culot de membranes cellulaires insolubles et autres GF / F fibres du filtre) à un propre de 1,5 ml microtube. Ce lysat cellulaire soluble peut maintenant être utilisé dans le dosage RubisCO activité carboxylase. </li><li> Lysat peut être conservé à -80 ° C après addition de glycérol de 12,5% et la congélation instantanée dans l&#39;azote liquide. Une perte d&#39;activité peut se produire après plusieurs cycles gel / dégel en fonction de la sensibilité des enzymes dans le lysat. Par conséquent, l&#39;activité de lysat frais versus congelée doit être examinée avant à grande échelle des extractions lysat cellulaire. </li></ol> 4. RubisCO Assay carboxylase filtrer l&#39;activité <ol><li> Transfert 125 ul de lysat soluble à un tube de 15 ml vis microcentrifugeuse bouchon (bouchon n&#39;est pas nécessaire) qui a été sur de la glace. Pour les échantillons de contrôle négatifs, ajouter 125 ul de lysat soluble à tube de 15 ml vis microcentrifugeuse bouchon, mais n&#39;ajoutez pas de substrat (à l&#39;étape 4.7). Courirreproduire les réactions de tous les échantillons et les contrôles négatifs. </li><li> Préparer 10 ml de tampon de dosage frais (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO 3, 25 mM MgCl 2) et le froid sur la glace. Aliquoter assez de la mémoire tampon de dosage pour tous les échantillons et les contrôles négatifs (100 pi par échantillon / contrôle de plus 100 supplémentaires pi) à un tube de 5 ml. Effectuer toutes les étapes ultérieures sous une hotte. </li><li> Ajouter 40 ul NaH 14 CO 3 (500 pCi / ml) par ml de tampon d&#39;essai à la mémoire tampon poolées et de garder la mémoire tampon sur la glace. </li><li> Retirez 10 uL du tampon de dosage contenant 14 C et la diluer dans 1 ml de tampon de dosage. Après inversion de mélanger, ajouter 100 ul du mélange dilué 1:100 à 3 ml de Bio-sécurité à scintillation comptage II cocktail dans un flacon à scintillation. Mélanger par inversion. Compte de scintillation (Beckman LS6500) devrait être plus de 18.000 cpm avant de poursuivre avec le test. </li><li> Quand un nombre suffisant de NaH 14 CO 3 a été ajouté à la mémoire tampon de dosage,déplacer les tubes de réaction à un bain sec préréglée à 25 ° C et incuber pendant 3-5 min. </li><li> Ajouter 100 ul du tampon d&#39;essai à des lysats et incuber pendant 5 minutes à 25 ° C. </li><li> Ajouter 20 ul de 15 mM ribulose biphosphate, à des échantillons et permettre à la réaction se poursuivre pendant 5-10 minutes à 25 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;acide propionique (100%) (Fisher) pour arrêter la réaction. Centrifuger pendant 1 heure à 2000 xg à épuiser non constituée en société 14 C. </li><li> Transférer le volume total des échantillons dans des flacons à scintillation contenant 3 ml de Bio-Safe II cocktail de scintillation comptage. Déterminer cpm de produits acides finaux stables par comptage à scintillation (B. de Witte, R. Tabita communication personnelle). </li><li> Calculer les taux d&#39;activité Rubisco sur un chl une base 14. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Nous avons utilisé la culture d&#39;enrichissement d&#39;isoler phototrophes adapté au froid et protistes mixotrophes résidant dans le L &#39;AntarctiqueAke Bonney. Pour capturer une plus grande diversité d&#39;organismes, nous avons testé trois types de milieux de culture: Moyen basale Bold (BBM) 15, F/2-Si Marine Medium 16, 17 et BG11 moyen de 18 ans. L&#39;inspection visuelle des cultures d&#39;enrichissement par microscopie optique a révélé que les cultures ont été dominées par les protistes phototrophes (indiqué par la présence de pigments chlorophylliens dans la plupart des cellules) et nourrissait une grande variété de morphologies cellulaires en fonction de la profondeur d&#39;échantillonnage à partir de laquelle l&#39;inoculum a été prise et le type de support utilisé dans la culture (fig. 1). Nous avons mesuré les taux maximaux d&#39;activité carboxylase catalysées par l&#39;enzyme rubisco comme un proxy pour le potentiel de fixation du carbone. Chl une abondance a également été suivie que d&#39;une estimation de la biomasse des protistes phototrophes (Fig. 2). Malgré la culture de toutes les cultures dans le cadre du même température / lumière régime (c.-à-4 ° C/20 mol m -2 s -1), le potentiel de fixation du carboneet la biomasse phototrophes variait considérablement entre les cultures d&#39;enrichissement. Maximum RubisCO activité a été observée dans des cultures d&#39;enrichissement de croissance dans les deux BBM (enrichissements 4 et 6) ou BG11 (enrichissements 13 et 14) des milieux de croissance, tandis que les cultures sur milieu de croissance enrichi F / 2 (enrichissements 19, 21, 23) ont présenté une 4 - à la baisse de 34 plis activités carboxylase maximum. Ces différences n&#39;étaient pas dues à des niveaux inférieurs de la biomasse dans les cultures F / 2, que l&#39;activité carboxylase a été exprimé sur une base Chl. En outre, l&#39;activité RubisCO n&#39;était pas corrélée avec une concentration chl (r = -0,023, p&gt; 0,1;. La figure 2, en médaillon). Les cultures BBM inoculés avec l&#39;eau du lac à partir de 6 m et 15 m (enrichissements 4 et 5) ont eu le plus grand chl quelques niveaux, tandis que toutes les autres cultures exposées chl relativement faible a, indépendamment de l&#39;activité enzymatique RubisCO (Fig. 2). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> Figure 1.Représentant cultures microbiennes eucaryotes enrichissement qui ont sélectionnés pour la croissance d&#39;organismes différents. Identité de la culture est donnée dans la partie inférieure gauche des panneaux. Toutes les images représentent des micrographies de lumière générées à l&#39;aide immersion dans l&#39;huile à un grossissement de 1000X. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> Figure 2. Potentiel capacité de fixation de carbone et de la chlorophylle extractible quelques niveaux dans les cultures microbiennes antarctiques enrichissement eucaryotes isolées du lac Bonney et cultivées sur des milieux de culture différents. Voir le tableau 1 pour plus de détails la culture Encart:. De corrélation de Pearson entre la chlorophylle a le potentiel de fixation de carbone dans l&#39;abondance et les cultures microbiennes antarctiques enrichissement eucaryotes.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+and+gross+growth+efficiency+of+an+Antarctic+bacterivorous+protist.">Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist.</a> The ISME journal. 3, 252-260 (2009).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les études moléculaires récentes ont rapporté une grande diversité de eucaryotes unicellulaires à travers une gamme d&#39;environnements 3, 19, 20; toutefois, en raison d&#39;un manque d&#39;isolats dans toute la gamme des habitats protistes les rôles fonctionnels de ces espèces individuelles dans les réseaux trophiques sont en grande partie inconnue. Dans cette étude, nous avons décrit des méthodes pour enrichir des espèces microbiennes eucaryotes présentant polyvalence métabolique à partir d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> BBM </td><td> Sigma </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> Sigma </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> Sigma </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtre, 25 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtre, 47 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polyéthersulfone filtre, 0,45 pores um, 47 mm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td> Stérile flacon de culture cellulaire, 25 cm 2 </td><td> Corning </td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurnachambre de croissance l </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> Zircon / billes de silice, 0,1 mm diamètre maximal </td><td> Produits Biospec </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Bead batteur </td><td> Produits Biospec </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> Microtube à bouchon à vis (1,5 pi) </td><td> USA Scientific </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 14 CO 3 </td><td> Vitrax </td><td> VC 194 </td><td> Gardez en aliquots de 400 ul à -20 ° C </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> Sigma </td><td> R0878-100mg </td><td> Dissoudre dans 10 mM de Tris-propionique l&#39;acide (pH 6,5) </td></tr></tbody></table>

establishment of microbial eukaryotic enrichment cultures from a chemically stratified antarctic lake and assessment of carbon fixation potential

Du lac Bonney est l&#39;un des nombreux permanence couvertes de glace des lacs situés dans les vallées sèches de McMurdo, en Antarctique. La couverture de glace pérenne maintient une colonne d&#39;eau chimiquement stratifié et à la différence des organes intérieurs autres cours d&#39;eau, empêche dans une large entrée externe de carbone et des nutriments provenant de flux. Biote sont exposés à de nombreux stress environnementaux, y compris l&#39;année carence en éléments nutritifs graves, les basses températures, de l&#39;ombre extrême, hypersalinité, et 24 heures l&#39;obscurité pendant l&#39;hiver 1. Ces conditions environnementales extrêmes limiter le biote du lac Bonney presque exclusivement aux micro-organismes 2. Eucaryotes microbiens unicellulaires (protistes appelé &quot;&quot;) sont des acteurs importants dans le cycle biogéochimique global 3 et jouer un rôle écologique important dans le cycle du carbone dans les lacs des vallées sèches, occupant les deux rôles primaires et tertiaires dans la chaîne alimentaire aquatique. Dans les vallées sèches aquatiques alimentaires web, protistes que je fixede carbone norganic (autotrophie) sont les principaux producteurs de carbone organique pour les organismes organotrophes 4, 2. Phagotrophic ou protistes hétérotrophes capables d&#39;ingérer les bactéries et les petits protistes agir comme les grands prédateurs dans la bande 5 aliments. Enfin, une proportion inconnue de la population protiste est capable de métabolisme mixotrophe combiné 6, 7. Mixotrophie dans protistes implique la capacité de combiner la capacité photosynthétique à l&#39;ingestion de micro-organismes phagotrophic proies. Cette forme de mixotrophie diffère du métabolisme mixotrophe en espèces bactériennes, ce qui implique généralement des molécules d&#39;absorption du carbone dissous. Il ya actuellement très peu de protistes isolats de permanence de la glace-capped lacs polaires, et les études de la diversité des protistes et de l&#39;écologie dans cet environnement extrême ont été limitées 8, 4, 9, 10, 5. Une meilleure compréhension de la polyvalence métabolique protiste dans le web vallée simples aliments secs lac contribuera à l&#39;élaboration de modèles pour la role des protistes dans le cycle global du carbone. Nous avons utilisé une approche de la culture d&#39;enrichissement d&#39;isoler protistes phototrophes et potentiellement mixotrophe du lac Bonney. Profondeur d&#39;échantillonnage dans la colonne d&#39;eau ont été choisis en fonction de l&#39;emplacement de la production primaire des maxima et des protistes la diversité phylogénétique 4, 11, ainsi que la variabilité dans les grands facteurs abiotiques qui affectent les modes trophiques protistes: profondeurs d&#39;échantillonnage peu profonds sont limitées pour les principaux éléments nutritifs, alors que la profondeur d&#39;échantillonnage plus profondes sont limitées par la disponibilité en lumière. En outre, des échantillons d&#39;eau des lacs ont été complétées par plusieurs types de milieux de croissance pour favoriser la croissance d&#39;une variété d&#39;organismes phototrophes. RubisCO catalyse l&#39;étape cinétiquement limitante dans le Bassham Calvin Benson (CBB) du cycle, la principale voie par laquelle les organismes autotrophes fixent le carbone inorganique et de fournir de carbone organique pour les niveaux trophiques supérieurs des réseaux trophiques aquatiques et terrestres 12. Dans cette étude, we appliqué un test de radio-isotopes pour la modification de 13 échantillons filtrés pour surveiller l&#39;activité maximale carboxylase comme un proxy pour le potentiel de fixation du carbone et la polyvalence métabolique dans les cultures du lac Bonney les enrichissement.

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Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Eucaryotes microbiens sont à la fois une source de carbone photosynthétique dérivé et principales espèces prédatrices en permanence lacs antarctiques couvertes de glace. Ce rapport décrit une approche de la culture d&#39;enrichissement d&#39;isoler métaboliquement eucaryotes microbiens polyvalents du lac de l&#39;Antarctique, le lac Bonney, et évalue le potentiel de fixation du carbone inorganique en utilisant un dosage radio-isotope pour ribulose-1 ,5-oxygénase bisphophate carboxylase (RubisCO) l&#39;activité.

Mise en place de cultures microbiennes eucaryotes à partir d&#39;un enrichissement chimique stratifié lac Antarctique et de l&#39;évaluation du potentiel de fixation du carbone

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

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Research

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Biology

11.3K vues.  Miami University. Eucaryotes microbiens sont à la fois une source de carbone photosynthétique dérivé et principales espèces prédatrices en permanence lacs antarctiques couvertes de glace. Ce rapport décrit une approche de la culture d'enrichissement d'isoler métaboliquement eucaryotes microbiens polyvalents du lac de l'Antarctique, le lac Bonney, et évalue le potentiel de fixation du carbone inorganique en utilisant un dosage radio-isotope pour ribulose-1 ,5-oxygénase...

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Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Enrichissement des cellules NK du sang humain avec le Kit de RosetteSep StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Recherche

Biologie

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire de tapis microbiens

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Une méthode hybride d&#39;extraction d&#39;ADN pour l&#39;évaluation qualitative et quantitative des communautés bactériennes de la volaille Échantillons de production

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Purification de l&#39;ensemble du génome de l&#39;ADN extrachromosomique circulaire à partir de cellules eucaryotes

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocole pour l’utilisation de gènes série d’analyses d’enrichissement pour identifier le modèle Animal approprié de recherche translationnelle

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Établissement et entretien des blattes américaines gnotobiotiques (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

Mesure de la photophysiologie du stade attaché de Colacium sp. par un fluoromètre à taux de répétition rapide de type cuvette

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Isolement de microARN à partir de cultures de glandes salivaires ex vivo et de vésicules extracellulaires

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.