המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר זכריה ז בראון וג&#39;ניפר Alleva לפיתוח הראשוני של טכניקה זו סינתזה מוצק בשלב פרקר ומתיו FL לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכת על ידי הסוכנות איום הפחתת ההגנה (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) ואת פרס Witzel הורסט אחוות נתמך על ידי Cephalon, Inc

1. הגדרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה הגדרת לסינתזה מוצק בשלב זה מחסנית פוליפרופילן פילטר או הכור זכוכית המחוברת דרך צינור פוליפרופילן בקבוק סינון סגורה תחת ואקום, כפי שמוצג באיור 1. התגובה יכולה להיות מעורב בר סערה מגנטית או מבעבעים חנקן באמצעות כור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעפת הגז המחובר גליל ארגון מצויד בצינור ייבוש bubbler שמן מומלץ גם היא מאפשרת את כלי התגובה להיכלל תחת אווירה פעיל ולא מאפשר הסרה של חומרים כימיים מ באריזות סגורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הפעולות נעשות במנדף ונכון ציוד מגן אישי (משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות nitrile) נדרשת. </li></ol> 2. ראשית טוען Bis-peptide על גבי שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 114 מ&quot;ג HMBA-AM שרף (0.88 mmol / טעינה גרם, 100 μmol) לכלי 8 תגובה מ&quot;ל ולהוסיף בר סערה מגנטית. מכסה את החלק העליון של הדואר עם כלי מחצה גומי טיהור צינור עם ארגון לפחות 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, שוקל 117.3 מ&quot;ג של מתחם 1 של איור 3 (586.63 g / mol, 2eq) ו - 59.2 מ&quot;ג של 1 - (mesitylene-2-sulfonyl)-3-Nitro-1-,2,4 triazole (MSNT, 296.0 g / mol, 2eq) לתוך צינור 15 צנטריפוגות הפנויה מ&quot;ל ו להתמוסס dichloromethane מ&quot;ל 2 נטול מים (DCM). הוסף 24 μL של 1-methylimidazole (NMI, 80.81 מ&quot;ל / mol, 3eq) לפתרון ומערבבים עד שהיא נמסה לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון מופעל לכלי התגובה באמצעות מזרק ולאפשר לעורר תחת ארגון לילה ~~~HEAD=NNS (10 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחיצת ומסננים את התערובת התגובה. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ו dimethylformamide (DMF) (5x). לבצע את &quot;מבחן מתיל אדום&quot; המתואר בסעיף 10.1 כדי להעריך את מידת הטעינה שרף. אם שרף נשאר אדום במהלך הבדיקה מתיל אדום ואז צעדים 2.2 ו 2.3 יש לחזור. צבע צהוב, מצביע על מבחן שלילי מתיל אדום, היא המועדפת;עם זאת, מאז באף אחת מהקבוצות הידרוקסיל הנותרים יהיו כתרים בשלב הבא, תוצאה חיובית מעט (אור בצבע כתום שרף) עשוי להיות מקובל. </li></ol> 3. Deprotection של שרף Bis-peptide בו זמנית ראשון תקרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של DCM לכלי התגובה ולאחר מכן להוסיף 1 ברומיד מ&quot;ל מימן 33% dropwise חומצה אצטית על 30 שניות (מבעבע מתרחשת) ולאפשר לעורר במשך 15 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). לנטרל את שרף על ידי שטיפה פעמיים עם פתרון V / V 5% N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) ב DMF מכן לשטוף עם DCM (5x) ו DMF (5x) שוב. לבצע את &quot;מבחן מתיל אדום&quot; ו - &quot;מבחן chloranil&quot; שהוזכר בסעיף 10.1 ו -10.2. תוצאות צריך להיות שלילי אדום מתיל הבדיקה חיובית למבחן chloranil. </li></ol> 4. צימוד BOC / tBu מוגן פונקציונליות Bis-עמילא חומצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר אווירה אינרטי לכלי, המכיל שרף תגובה על ידי שטיפה שלוש פעמים עם DCM נטול מים מכן לצרף מחצה וקו ארגון. לנקות ולשטוף את הכלי על ידי הוספת 1-2 מ&quot;ל של DCM נטול מים ולתת ומערבבים במשך 30 שניות ולאחר מכן ניקוז כלי עד קו ארגון bubbler מתחיל לעלות. האם זה לפחות עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה של 0.15 M פונקציונליות BIS-חומצת אמינו (3eq) ו - 245 מ&quot;ג של 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt, 136.11 g / mol, 18eq) ב 2 מ&quot;ל של DCM 02:01: DMF במבחן האש יבשים צינור תחת אווירה ארגון. הוסף 47 μL של diisopropylcarbodiimide (DIC, 156.6 מ&quot;ל / mol, 3eq) ומערבבים במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 35 DIPEA μL (174.19 מ&quot;ל / mol, 2eq) ב DMF 666 נטול מים μL כדי שרף ומאפשרים לערבב במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר מראש פעיל BIS-חומצה אמינית פתרון לכלי התגובה באמצעות מזרק ולאפשר לעורר לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את התערובת התגובה ולשטוף פעמיים עם DCM נטול מים בתקופת<html> ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקדם את סגירת diketopiperazine, להוסיף פתרון 0.25 מ &#39;של HOAt (136.11 g / mol, 10eq) ו DIC (156.6 מ&quot;ל / mol, 10eq) ב 4 מ&quot;ל של 1:1 DCM: DMF ולאפשר לעורר במסגרת ארגון שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחיצת ומסננים את התערובת התגובה. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ו DMF (5x). אם תרצה, לבצע את &quot;מבחן chloranil&quot; שהוזכר בסעיף 10.2. </li></ol> 5. Deprotection של BOC / tBu מוגן חומצה אמינו Bis-פונקציונליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של תמיסה של חומצה trifluororacetic 95:5 (TFA): triisopropylsilane (TIPS) לכלי התגובה ולאפשר לו ומערבבים במשך שעה 1. מסננים שוטפים את שרף במשך כ 30 שניות עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). לנטרל את שרף על ידי שטיפה פעמיים עם פתרון V / V 5% DIPEA ב DMF אז לשטוף DCM (5x) ו DMF (5x) שוב. אם תרצה, לבצע את &quot;מבחן chloranil&quot; שהוזכר בסעיף 10.2. </li></ol>לה טמפ &quot;&gt; 6. חזור על שלבים 4 ו -5 לפי הצורך לסנתז ממוקד BIS-peptide. 7. Functionalizing סוף Bis-peptide Prolidine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף prolidine של פפטיד BIS הגוברת ניתן acylated באופן עצמאי או יחד באמצעות diketopiperazine. כמו כן, לצורך כך ניתן להשאיר מוגנים, אשר יהיה ביקע האחרונים והנותן את חומצת האמינו חינם. אם תרצה, לבצע את &quot;מבחן chloranil&quot; שהוזכר בסעיף 10.2 כדי להעריך את יעילות צימוד. </li></ol> 8. Deprotection של Fmoc ו Acylation הסוף הרביעון של Bis-peptide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2ml של piperidine 20% DMF נוסף והתגובה היא מעורבת במשך 20 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DMF (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.15 מ &#39;של חומצת אמינו (3eq) ב 2 מ&quot;ל של N-methylpyrrolidone (NMP) עם 114 מ&quot;ג 2 - (7-עזה-1H-benzotriazole-1-י.ל.) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate<html> (HATU, 380.2 גרם / מול, 3eq) ו 104.5 DIPEA μL (174.19 מ&quot;ל / mol, 6eq) ומערבבים היטב. הוסף תגובה כלי ולאפשר לעורר במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). </li></ol> 9. הסר את הקבוצה BOC שרף כרוך חומצת אמינו ו קליב שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של TFA 01:01: פתרון DCM לכלי התגובה ולאפשר לעורר במשך 30 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולנקז שרף במשך 30 שניות עם DCM (5x) ואז DMF (5x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של תמיסה של DIPEA 10% DMF נטול מים ולאפשר לעורר 24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התערובת לתוך בקבוק התגובה מראש שקל בתחתית הסיבוב. העברת 30 μL של פתרון זה μL 450 של THF בבקבוקון LC-MS ולהגיש לבדיקה. לשטוף את שרף עם aliquots נוספים של DMF ולאסוף לתוך הבקבוק התחתון בסיבוב מכן הסר ממס ב vacuo. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. טיהור של ה-BIS-peptide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים גולמי BIS-peptide בסכום מינימלי של sulfoxide דימתיל (100-250 μL) ולהעביר את הכנס בקבוקון HPLC. הכנס לתוך המקום autosampler של חצי prepitive HPLC המערכת (Hewlett Packard 1100 הסדרה) מצויד הכנה XTerra MS טור C18 7.8x150 5 מ&quot;מ מיקרומטר ו לולאה 100 הזרקת μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע מספר רב של 50 זריקות μL של המדגם באמצעות תוכנית הדרגתי של 5-95% אצטוניטריל במים עם חומצה פורמית 0.1% מעל 30 דקות תוך ניטור ב 274 ננומטר. איסוף המוצר שיא בצינור מראש שקל חד פעמי צנטריפוגות ולהקפיא יבש באמצעות lyophilizer. זהירות יש לנקוט עם הסיבוב הראשון כמו שינוי קל זמן השמירה שיא בהשוואה LCMS אנליטיים הוא נצפה בדרך כלל. </li></ol> 11. שיטות הערכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתיל אדום מבחן 7: הסר ~ 1 מ&quot;ג של שרף יבש באמצעות פיפטה חד פעמי לשטוף את כלי התגובה 4 מ&quot;ל. הוסף פתרון של 20 מ&quot;ג מתיל אדום, 50 N μL, ללהקת diisopropylcarbodiimide (DIC), ו 5 מ&quot;ג 4-dimethylaminopyridine (DMAP) ב DCM 500 נטול מים μL ולאפשר לעורר למשך 5-10 דקות. מסננים לשטוף שרף עם DCM עד תסנין הופך חסר צבע. סימן חיובי הוא שרף את החרוזים הנותרים כתום או אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן CHLORANIL 12: העברה ~ 1 מ&quot;ג של שרף יבש לתוך בקבוקון קטן באמצעות פיפטה חד פעמי. הוסף 3 טיפות של chloranil הן 0.8 מ&quot;מ פתרון DMF ו אצטילדהיד 2% בתמיסה DMF ולתת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות. אינדיקציה חיובית היא החרוזים שרף מפנה כחול / סגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלכודת הפעלת מבחן: תרכובות מופעל במהלך הסינתזה ניתן להעריך על ידי העברת כמות קטנה (μL 5-10) של הפתרון מופעל על כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה נוזלית (LC-MS) בקבוקון המכיל 50 μL של pyrrolidine. מערבבים ביד במשך כמה שניות (solutiב צריך להיות צהוב) ואז לדלל עם μL 450 של tetrahydrofuran (THF) ולהגיש לניתוח LC-MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנליטי LC-MS: המוצר הסופי ביניים הפעיל ניתן להעריך באמצעות HP 1200 סדרת LC-MS מערכת מצויד Xterra ווטרס טרשת נפוצה 3.5 מיקרומטר C18 4.6 מ&quot;מ x 150 מ&quot;מ טור מערכת שיפוע של אצטוניטריל 5-95% במים עם חומצה פורמית 0.1% מעל 30 דקות. </li></ol> 12. נציג תוצאות דוגמה בוטה הן (איור 4) מטוהרים (איור 5) עקבות LCMS מסופקים. התשואות מטוהרים של כ -10% צפויים להשתמש בשיטות שתוארו לעיל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים של ניסיוני הגדרת לסינתזה שלב מוצק. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> איור 2.מינוח רלוונטי של ה-BIS, חומצות אמינו / כתם למוצרי פפטידים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> איור 3. תוכנית סינטטי בסך הכל. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <img alt="איור 4 א" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> איור 4 א. Trace HPLC של מוצר גולמי ב 274 ננומטר. <img alt="איור 4 ב &#39;" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> איור 4 ב &#39;. ספקטרום MS שיא של מוצר גולמי. <img alt="איור 5 א" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> איור 5 א. HPLC עקבות של מטוהרים מוצר ב 274 ננומטר. <img alt="איור 5 ב &#39;" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> איור 5 ב &#39;. MS ספקטרום של מטוהרים producלא שיא.

<ol>
	<li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (1989).</li><li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides.">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li><li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-Programmable+Macromolecules.">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li><li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids.">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li><li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues.">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li><li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports.">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li><li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis.">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li><li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation.">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li><li>Plas, S. E. V. a. n. d. e. r., Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs:+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC.">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li><li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides.">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li><li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase.">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

הגישה המוצגת כאן סינתטי מספק שיטה לסינתזה של פפטידים למוצרי כתם פונקציונליות מ-BIS אמינו אבני הבניין של חומצות באמצעות נפוצות מוצק שלב סינתזה טכניקות פפטיד. סינתזה מונומר אלה אבני הבניין &quot;Pro4&quot; מ 3 טרנס-4-hydroxyproline היא מדרגית הושלם בהצלחה השלב hydantoin ב mmol 600 (234 גרם) בהיקף (לא פורסם). לאחר מונומרים הם ביד, השימוש מוצק שלב טכניקות מספק שיטה מהירה יותר של סינתזה BIS-peptide מ המתודולוגיה הנוכחית פתרון שלב 4 שלנו על ידי ביטול הצורך התגובה עבודה עליות purifications ביניים. האתגר העיקרי בסינתזה מוצק הוא שלב באבחון התקדמות הבעיה סינתטי פתרון ביניים שכן אין הם מבודדים. זה הוביל לפיתוח של בדיקות colorimetric רבים כולל אלה כדי לזהות אם אמינים חינם (קייזר מבחן 10) או ללא hydroxyls (מתיל מבחן האדום 7) נחשפים על שרף. למרבה הצער, מבחן נפוץ קייזר 10 אינו חל בדרך כלל סינתזה שלנו מוצק שלב עקב השימוש הבלעדי כמעט של אמינים או אמינים משניים המחובר לפחמן הרביעון. אפשרויות אחרות להערכה על שרף HMBA כוללים השסעים הבדיקה באמצעות nucleophile כגון 11 הידרזין, מחשוף Fmoc כמותית פיקוח על ידי UV / Vis 1,11, ו - השמנה וניתוח תרכובות מופעל נכנסות. נושא נוסף התעלמו בסינתזה מוצק בשלב זה האופי החוזר ונשנה של צעדים סינתטיים הנדרשים על ידי המפעיל. עם זה בחשבון, החוקרים ממליצים על שימוש בגיליון אלקטרוני או רשימת הבדיקה בעת ביצוע כל סינתזה ידנית מוצק בשלב פפטיד. המתקשים בשימוש כתם למוצרי פפטידים לסינתזה מוצק בשלב לעומת α-אמינו חומצות נפוצות כוללת את פוטנציאל הזיווגים קשה יותר בשל הין סטריתdrance, הצורך ב-שרף סגר diketopiperazine, ו deprotections בו זמנית (BOC / tBu; Cbz / tBu). המתקשים נוסף טמון בהשגת שחרור הכמותי לעומת שרף באמצעות &quot;הניצרה&quot; השיטה בהשוואה אמצעי יותר קונבנציונאלי. עם גורמים אלה בחשבון, זה אפשרי מאוד אופטימיזציה נוספת של שיטה זו יכולה להיות מושגת ואת המאמצים הנוכחיים נערכים בקבוצה שלנו כדי לשפר את השיטה המוצגת כאן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> HMBA-Am שרף </td><td> NovaBiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> NovaBiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> מסרטן </td></tr><tr><td> נטול מים DCM </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> מסרטן </td></tr><tr><td> מימן ברומיד 33% חומצה אצטית </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> רעיל, קורosive, אדים כאשר פתוח </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> דליק, רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> DMF </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> AC27960 </td><td> דליק, רעיל </td></tr><tr><td> נטול מים DMF </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> דליק, רעיל </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> דליק, רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> טיפים </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> דליק, רעיל </td></tr><tr><td> Piperidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> דליק, רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><tdToxic&gt; </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> רעיל </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> NovaBiochem </td><td> 851055 </td><td> רעיל </td></tr><tr><td> מתיל אדום </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> דליק, חמצן רעיל, יוצרים </td></tr><tr><td> Pyrrolidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> דליק, רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> דימתיל Sulfoxide </td><td> דיג </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS כלי התגובה </td><td> חסד </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> 1200 Series </td><td></td></tr><tr><td> חצי הכנה LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> 1100 Series </td><td></td></tr><tR&gt; <td> Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> ארגון </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

בשנת 1962 פרסם RB Merrifield ההליך הראשון באמצעות מוצק שלב סינתזת פפטיד כדרך חדשנית ביעילות לסנתז פפטידים. טכניקה זו במהירות הוכיח יתרון על פני קודמו פתרון שלב בזמן והן העבודה. שיפורים על מהות תמיכה מוצק, קבוצות להגנה על עובדים ואת שיטות צימוד המועסקים בחמש השנים האחרונות הגדילו רק את השימושיות של המערכת המקורית של Merrifield. כיום, השימוש הגנה BOC מבוסס בסיס / שרף nucleophile אסטרטגיה cleavable או Fmoc מבוסס הגנה שרף חומצי אסטרטגיה cleavable, חלוץ ידי RC שפרד, משמשים בדרך כלל לסינתזה של פפטידים 1. בהשראת אסטרטגיה מוצק של Merrifield תמיכה, פיתחנו BOC / טרט-בוטיל מוצק שלב האסטרטגיה סינתזה להרכבה של פונקציונליות למוצרי פפטידים כתם 2, אשר מתואר להלן. השימוש סינתזה מוצק בשלב לעומת to פתרון שלב המתודולוגיה היא לא רק יתרון בזמן והן העבודה כפי שתואר על ידי Merrifield 1, אלא גם מאפשר בקלות רבה יותר בסינתזה של BIS-peptide ספריות. סינתזה שאנחנו מראים כאן משלב לשלב הסופי מחשוף המשתמשת שני שלבים &quot;בטיחות לתפוס&quot; מנגנון לשחרר פונקציונליות BIS-peptide שרף ידי היווצרות diketopiperazine. כתם למוצרי פפטידים הם נוקשים, ספירו סולם oligomers של ה-BIS-חומצות האמינו כי הם מסוגלים למקם פונקציונליות באופן צפוי designable, שבשליטת בסוג סטריאוכימיה של יחידות monomeric ואת הקישוריות בין מונומר אחד. כל חומצה אמינית-BIS הוא טהור stereochemically, פיגום מחזורית המכילה שתי חומצות אמינו (חומצה carboxylic עם α-אמין) 3,4. המעבדה שלנו חוקרים כעת את הפוטנציאל של פונקציונליות כתם למוצרי פפטידים על פני מגוון רחב של תחומים לרבות, קטליזה אינטראקציות בין חלבונים ו-Nanomaterials.

Watch this Scientific Journal Video about Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology at JoVE.com

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

סינתזה יעילה מוצק בשלב פפטיד של trimer BIS-peptide פונקציונליות ניצול &quot;בטיחות לתפוס&quot; הליך מחשוף שרף HMBA מתואר.

סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש &quot;בטיחות תפוס&quot; מתודולוגיה

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

solid-phase-synthesis-functionalized-bis-peptide-using-safety-catch

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.4K Views.  Temple University. סינתזה יעילה מוצק בשלב פפטיד של trimer BIS-peptide פונקציונליות ניצול "בטיחות לתפוס" הליך מחשוף שרף HMBA מתואר.

Video: Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

אופטימיזציה של התגובה אוגי באמצעות סינתזה במקביל וטיפול נוזלי אוטומטי

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

סינתזה כיול nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

שורש יבש רוט רוט מחלה אומר חומוס: מתודולוגיה מפורטת

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...