Yazarlar, yararlı tartışmalar için bu katı faz sentezi tekniği ve Matthew FL Parker ilk geliştirme Dr Zachary Z. Brown ve Jennifer Alleva teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Cephalon, Inc tarafından desteklenen Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) ve Horst Witzel Burs Ödülü tarafından desteklenmektedir

1. Kurulum <ol><li> Katı faz sentezi için reaksiyon kurulum Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, vakum altında kapalı bir filtreleme şişesine polipropilen hortumu aracılığıyla bağlı olan bir polipropilen filtre kartuş veya cam reaktör olup. Reaksiyon, bir manyetik karıştırma çubuğu ile veya reaktör ile azot gazı ile karıştırılabilir. </li><li> Bu reaksiyon kabına inert bir atmosfer altında bulunan imkan verir ve ambalajlarında gelen reaktiflerin çıkarılmasını sağlar gibi bir kurutma tüpü ve yağ bubbler ile donatılmış bir silindir Argon bağlanmış bir gaz manifoldu ayrıca tavsiye edilir. </li><li> Tüm işlemler bir çeker ocak ve uygun kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve nitril eldiven) gereklidir yapılmaktadır. </li></ol> 2. Reçine üstüne Bis-Peptid İlk Yükleme <ol><li> 8 ml reaksiyon kabı içerisine HMBA-AM Reçine (0.88 mmol / g yükleme, 100 mmol) 114 mg tartılır ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Th tepe başlıken az 5 dakika argon ile bir lastik septum ve tahliye borusu ile e gemi. </li><li> Bu arada, Şekil 3 (586,63 g / mol, 2 eşdeğer) ve 1 59.2 mg bileşik 1 ile 117,3 mg ağırlığında - (mezitilen-2-sülfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296.0 Bir 15 mL atılabilir santrifüj tüpüne g / mol, 2 eşdeğer) ve 2 ml susuz diklorometan (DCM) içinde çözülür. Eritilip solüsyon ve karışımına 1-metilimidazol (NMI, 80,81 mL / mol, 3 eşdeğer) 24 uL ekleyin. </li><li> Şırınga yoluyla reaksiyon kabına aktarılması çözeltisi aktive edilmiş ve gece boyunca argon (~ 10 saat) karıştırılmasına izin verir. </li><li> Septum çıkarın ve reaksiyon karışımı süzün. DCM (5x) ve dimetilformamit (DMF) (5x) ile reçine yıkanır. Reçine yükleme derecesini değerlendirmek için bölüm 10.1 açıklanan &quot;metil kırmızısı testi&quot; yapın. Reçine metil kırmızısı testi sırasında kırmızı kalırsa daha sonra 2.2 ve 2.3 tekrarlanması gereken adımlar. Olumsuz bir metil kırmızısı testi göstergesidir sarı bir renk, tercih edilir;Ancak, kalan hidroksil grupları sonraki adım, biraz daha pozitif sonuç (açık turuncu renkli reçine) kapağı kapatılmış olacak beri kabul edilebilir. </li></ol> 3. Kapatma İlk Bis-Peptid ve Simultane Reçine deproteksiyonu <ol><li> Reaksiyon kabına DCM 1 mL sonra 30 saniye (köpürme meydana) içinde damla damla asetik asit içinde 1 mL% 33 hidrojen bromür ilave ve 15 dakika için karıştırılmaya izin verir. DCM (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işleyecek tekrarlayın. </li><li> DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. N, bir% 5 v / v çözeltisi, DMF içinde bir N-diizopropiletilamin (DIPEA) daha sonra DCM (5x) ve tekrar DMF (5x) ile yıkama ile iki kez yıkanarak reçine nötralize. &quot;Metil kırmızısı testi&quot; ve bölüm 10.1 ve 10.2 tartışılan &quot;kloranil testi&quot; yapın. Sonuçlar kloranil test için metil testi kırmızı ve pozitif negatif olmalıdır. </li></ol> 4. Kavrama Boc / tBu-Korumalı Fonksiyonlu Bis-AmiHiçbir Asit <ol><li> Susuz DCM ile üç kez yıkanarak reçine içeren reaksiyon teknesine bir inert atmosfer reintroduce daha sonra bir septum ve argon hattı takın. Temizlemek ve susuz DCM 1-2 ml ekleyerek ve argon hattı bubbler yükselmeye başlayıncaya kadar sonra geminin boşaltılması 30 saniye boyunca heyecan vererek gemi yıkayın. En az bir kez daha yapın. </li><li> Bir alev kurutulmuş test DMF: bis-amino asit (3eq.) ve 2:1 DCM 2 mL, 1-hidroksi-7-azabenzotriazole (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) ile fonksiyonelleştirilmiş 245 mg 0.15 M çözeltisi hazırlayın argon atmosferi altında bir tüp. Diisopropilkarbodiimide 47 uL (DIC, 156.6 ml / mol, 3eq.) ekleyin ve 90 dakika daha çırpın. </li><li> Reçineye 666 uL susuz DMF içinde 35 uL DIPEA (174,19 mL / mol, 2 eşdeğer) ekleyin ve 5 dakika için karıştırılmıştır izin verir. </li><li> Şırınga yoluyla reaksiyon kabına pre-aktive bis-amino asit çözeltisi aktarılır ve gece boyunca karışmaya izin verir. </li><li> Reaksiyon karışımı akmasını ve susuz DCM ile iki kez yıkayıp altında iken<html> argon. </li><li> Diketopiperazine kapanması teşvik etmek için, 1:1 DCM bir 4 mL HOAt (136,11 g / mol, 10eq) ve DIC (156.6 mL / mol, 10eq) ve bir 0.25 M solüsyon ilave: DMF ve argon altında karıştırılır izin 1 saat karıştırıldı. </li><li> Septum çıkarın ve reaksiyon karışımı süzün. DCM (5x) ve DMF (5x) ile reçine yıkanır. Eğer istenirse, bölüm 10.2 tartışılan &quot;kloranil test&quot; gerçekleştirin. </li></ol> 5.. Boc / tBu-Korumalı Fonksiyonlu Bis-Amino Asit deproteksiyonu <ol><li> Reaksiyon kabına triisopropylsilane (TIPS) ve 1 saat için karıştırılmaya izin: 95:5 trifluororacetic asit (TFA) solüsyonu 2 ml ilave edilir. Suyunu süzün ve daha sonra bir kez daha işlemi yineleyin DCM (5x) ile yaklaşık 30 saniye reçine yıkayın. </li><li> DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. Daha sonra DCM (5x) ve tekrar DMF (5x) yıkayıp DMF içinde DIPEA bir% 5 v / v çözeltisi ile iki kez yıkanarak reçine nötralize. Eğer istenirse, bölüm 10.2 tartışılan &quot;kloranil test&quot; gerçekleştirin. </li></ol>bis-peptid hedef sentezlemek için istediğiniz gibi le &quot;&gt; 6. adımları tekrarlayın 4 ve 5. 7. Bis-Peptid Prolidine End göstermeye çalışıyor <ol><li> Büyüyen bir bis-peptid prolidine ucu bir diketopiperazine aracılığıyla tek tek veya birlikte asilatlanabilir. Ayrıca, bu amaçla serbest amino asit affording, ikinci parçalanabilen edilecek olan, korunan bırakılabilir. İsterseniz, kaplin verimliliğini değerlendirmek için bölüm 10.2 tartışılan &quot;kloranil test&quot; gerçekleştirin. </li></ol> 8. Bis-Peptid Kuvaterner sonu Fmoc ve Açilleme deproteksiyonu <ol><li> 20 dakika boyunca DMF içinde% 20 piperidin bir 2mL solüsyonu ilave edilir ve reaksiyon karıştırılır. DMF (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işlemi tekrarlayın. </li><li> DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. </li><li> 114 mg 2 ile N-metilpirrolidon 2 mL (NMP) amino asit (3eq.) bir 0.15 M solüsyon hazırlanır - (7-aza-1 H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-<html> (HATU, 380.2 g / mol, 3 eşdeğer) ve 104.5 uL DIPEA (174,19 mL / mol, 6EQ) ve iyice karıştırın. Reaksiyon kabına ekleyin ve 6 saat boyunca karıştırılır izin verir. </li><li> DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. </li></ol> 9. Reçine gelen Amino Asit ile Cleave Bound reçineden Boc grubu çıkarın <ol><li> Reaksiyon kabına DCM çözeltisi ve 30 dakika için karıştırılmaya izin: a 1:01 TFA 2 ml ilave edilir. DCM (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işleyecek tekrarlayın. </li><li> Sonra DCM (5x) DMF (5x) ile 30 saniye reçine yıkayın ve süzün. </li><li> Susuz DMF içinde% 10 DIPEA bir çözelti 2 mL ekleyin ve 24-48 saat için karıştırılmaya izin verir. </li><li> Önceden tartılmış yuvarlak dipli bir balona Reaksiyon karışımı Collect. LC-MS, bir şişe içinde THF içinde 450 uL Bu çözeltinin 30 uL transferi ve analiz için teslim. DMF ilave alikotları ile reçine yıkanır ve yuvarlak dipli bir balona toplamak ve sonra solvent vakumda kaldırın. </li></ol>&quot;dflinebreak&gt; 10. Bis-Peptid saflaştırılması <ol><li> HPLC flakon yerleştirmeye dimetil sülfoksit (100-250 uL) ve transfer bir asgari tutarda bis-peptid ham eritin. Yarı-prepitive HPLC sistemi (Hewlett Packard 1100 Serisi) ile otosampler&#39;li içine Yeri insert bir Xterra Hazırlık MS C18 5 mikron 7.8x150 mm sütun ve 100 uL enjeksiyon loop ile donatılmıştır. </li><li> 274 nm&#39;de izlerken 30 dakika içinde% 0.1 formik asit ile su içinde% 5-95 asetonitril gradyan programı kullanılarak örnek 50 uL birden fazla enjeksiyon gerçekleştirmek. Önceden tartılmış tek santrifüj tüpündeki ürünü pik toplayın ve bir lyophilizer kullanılarak kuru dondurma. Dikkat tipik olarak görülür analitik LCMS göre pik tutma süresi hafif bir kayma olarak ilk çalıştırma ile alınmalıdır. </li></ol> 11. Değerlendirme Yöntemleri <ol><li> METİL KIRMIZI TEST 7: Pipet ile kuru reçine ~ 1 mg çıkarın ve 4 mL reaksiyon kabı içerisine durulayın. 500 uL susuz DCM içerisinde 20 mg metil kırmızı, 50 uL N, N&#39;-diizopropilkarbodiimid (DIC), ve 5 mg 4-dimetilaminopiridin (DMAP) içindeki bir çözeltisine ilave edip 5-10 dakika için karıştırılmaya izin verir. Boşaltın ve süzüntü renksiz hale gelinceye kadar DCM ile reçine yıkayın. Pozitif göstergesi turuncu veya kırmızı kalan reçine boncuk olduğunu. </li><li> Kloranil TEST 12: Transfer ~ pipet aracılığıyla küçük bir şişeye kuru reçine 1 mg. Bir 0,8 mM DMF çözelti içinde kloranil ve DMF solüsyonu içinde% 2 asetaldehit hem 3 damla ekleme ve 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. Pozitif göstergesi mor / mavi dönüm reçine boncuk olduğunu. </li><li> AKTİVASYON TRAP TEST: sentezi sırasında aktive bileşikler, bir sıvı kromatografi-kitle spektrometresi (LC-MS) pirolidin 50 uL ihtiva eden bir şişeye aktive çözeltisi küçük bir miktarda (5-10 uL) aktararak değerlendirilebilir. Birkaç saniye için elle karıştırın (solutiüzerine tetrahidrofuran (THF) 450 uL ile sulandırmak ve LC-MS analiz için teslim sonra) sarı olmalıdır. </li><li> Analitik LC-MS: nihai ürün ve aktive edilmiş ara ürünler, bir Waters Xterra MS C18 3,5 um ile donatılmış bir HP 1200 serisi LC-MS sistemi kullanılarak değerlendirilebilir 4.6 mm x 150 mm sütun ve su içinde% 5-95 asetonitril oluşan bir gradyan sistemi 30 dakika içinde% 0.1 formik asit ile. </li></ol> 12. Temsilcisi Sonuçlar Bir hem ham örnek (Şekil 4) ve saflaştırılmış (Şekil 5) LCMS izleri sağlanmaktadır. Yaklaşık% 10 verim saflaştırılmış yukarıda açıklanan yöntemler kullanılarak tahmin edilmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Şekil 1. Katı Faz Sentezi için deneysel Set-Up diyagramı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Şekil 2.Bis-Amino Asitler / Bis-Peptitler ilgili isimlendirme. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Şekil 3. Genel Sentez şeması. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Şekil 4a. 274 nm&#39;de Ham Ürün HPLC Trace. <img alt="Şekil 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Şekil 4b. Ham Ürün Peak MS Spektrumu. <img alt="Şekil 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Şekil 5a. 274 nm&#39;de Ürün Saflaştırılan HPLC Trace. <img alt="Şekil 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Saf Product Şekil 5b. MS Spektrumut Tepe.

<ol>
	<li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (1989).</li><li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides.">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li><li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-Programmable+Macromolecules.">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li><li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids.">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li><li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues.">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li><li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports.">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li><li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis.">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li><li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation.">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li><li>Plas, S. E. V. a. n. d. e. r., Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs:+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC.">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li><li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides.">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li><li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase.">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan sentetik bir yaklaşım sık katı-faz peptid sentezi yöntemleri kullanılarak bis-amino asit inşa edici bloklar fonksiyonlandırılmış bis-peptid sentezi için bir yöntem sağlar. Trans-4-hidroksiprolin 3 bu &quot;Pro4&quot; yapı taşlarından monomer sentezi yüksek ölçeklenebilir ve başarılı bir 600 mg (234 gr) ölçeği (yayımlanmamış) de hidantoin aşaması tamamlanmıştır. Monomerler yandan yerleştirildikten sonra, katı-faz tekniklerin kullanımı reaksiyon work-up ve ara saflaştırılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, mevcut çözelti faz yöntemleri 4 den bis-peptid sentezi daha hızlı bir yöntem sağlar. Katı faz sentezinde primer zorluğun, ara izole edilir yana çözme sentetik ilerleme ve problem teşhis edilir. Bu tanımlamak için de dahil olmak üzere pek çok kolorimetrik testlerin gelişmesine yol açmıştır halinde serbest aminlerin (Kaiser Testi 10) ya da serbest hydroxYLS (Metil Red Testi 7) reçine maruz kalmaktadır. Ne yazık ki, yaygın olarak kullanılan Kaiser Testi 10, bir kuaterner karbona bağlı sekonder aminler ya aminlerin hemen özel kullanımına bağlı olarak bizim katı-faz sentezi genel olarak uygulanabilir değildir. HMBA reçine değerlendirmesi için diğer seçenekler gibi hidrazin 11, UV / Vis 1,11 ile takip kantitatif Fmoc bölünme gibi bir nükleofil kullanarak ve yakalama ve gelen aktif bileşikler analiz testi bölünmelere içerir. Katı-faz sentezi dahilinde bir başka sorun, göz ardı operatör tarafından istenen sentetik adımlardan tekrarlanan olmasıdır. Bu zihin ile herhangi bir manuel katı-faz peptid sentezi gerçekleştirirken, yazarlar güçlü bir elektronik tablo veya kontrol listesi kullanmanızı öneririz. Ortak bir α-amino asit ile karşılaştırıldığında bir katı-faz sentezi için bis-peptidler kullanarak zor sterik hin nedeniyle daha zor kavramaları için potansiyel içerirdrance, on-reçine diketopiperazine kapatma ihtiyacı ve aynı anda deprotections (Boc / tBu; Cbz / tBu). Başka daha zor geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu &quot;emniyet mandalı&quot; yöntemi ile reçineden sayısal yayın elde yatmaktadır. Akılda bu faktörler ile, bu yöntemin daha optimizasyonu sağlanır ve mevcut çabaları burada sunulan yöntemi geliştirmek için grubumuzda sürmektedir edilebilir olması çok mümkündür.

<table border="1"><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> HMBA-Am Reçine </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Toksik, aşındırıcı </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Kanserojen </td></tr><tr><td> Susuz DCM </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Kanserojen </td></tr><tr><td> Asetik asit içinde% 33 hidrojen bromür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Toksik, Corrosive, Duman zaman açık </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Korozif, toksik, Parlayıcı </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Toksik, yanıcı </td></tr><tr><td> Susuz DMF </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Toksik, yanıcı </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Korozif, toksik, Parlayıcı </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Toksik, aşındırıcı </td></tr><tr><td> İPUÇLARI </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Toksik, yanıcı </td></tr><tr><td> Piperidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Korozif, toksik, Parlayıcı </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toksik </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Toksik </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Toksik </td></tr><tr><td> Metil Red </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Şekillendirme yanıcı, toksik, Peroksit </td></tr><tr><td> Pirolidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Korozif, toksik, Parlayıcı </td></tr><tr><td> Dimetil Sulfoxide </td><td> Balıkçı </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS&#39;si Reaksiyon Gemileri </td><td> Zarafet </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> 1200 Serisi </td><td></td></tr><tr><td> Yarı Hazırlık LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> 1100 Serisi </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Serisi </td><td></td></tr><tr><td> Argon </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

1962 yılında, RB Merrifield verimli bir peptid sentezi için yeni bir yol olarak katı-faz peptid sentezi ile ilk yayınlanmış prosedürü. Bu teknik, hızlı zaman ve emek hem de çözüm fazlı önceki üzerinden avantajlı olduğunu kanıtladı. Sağlam bir destek niteliği ile ilgili Gelişmeler, koruyucu gruplar istihdam ve son beş yılda istihdam kaplin yöntemleri yalnızca Merrifield orijinal sistemin yararlılığı artmaktadır. Günümüzde, bir Boc-bazlı koruyucu ve baz / nükleofil yarılabilir reçine strateji veya Fmoc-bazlı koruma ve asidik reçine yarılabilir stratejisinin kullanımı, en yaygın olarak 1 peptit sentezi için kullanılır, RC Sheppard öncülük. Merrifield en katı destek stratejisi esinlenerek, biz burada açıklanan fonksiyonlandırılmış bis-peptidler 2, montaj için bir Boc / tert-bütil katı-faz sentezi bir strateji geliştirdik. T karşılaştırıldığında, katı-faz sentezi ile kullanılmako çözelti faz yöntemleri Merrifield 1 tarafından tarif edildiği gibi zaman ve hem de çalışma avantajlı olarak, yalnızca değil ama aynı zamanda bis-peptid kütüphaneleri sentezinde daha kolay bir şekilde sağlar. Burada göstermektedir ki sentezi iki adımlı bir diketopiperazine oluşumu ile reçineden bis-peptit fonksiyonlandırılmış serbest bırakmak için mekanizması &quot;emniyet yakalamak&quot; kullanan bir son bölünme aşaması içerir. Bis-peptidler tipi ve stereokimyasal monomer birimlerinden ve her bir monomer arasındaki bağlantı ile kontrol edilen bir tahmin edilebilir ve designable şekilde, işlevselliği konumlandırmak için mümkün olan bis-amino asit, katı, spiro-merdiven oligomerler vardır. Her bir bis-amino asit, iki amino asit (bir α-amin ile bir karboksilik asit) 3,4 içeren bir stereokimyasal olarak saf, siklik iskelesi olup. Laboratuvarımız şu kataliz, protein-protein etkileşimleri ve n de dahil olmak üzere, geniş bir alan üzerinde çeşitli işlevsel bir bis-peptidlerin potansiyeli soruşturmaanomaterials.

Watch this Scientific Journal Video about Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology at JoVE.com

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

Bir HMBA reçineden Yarılma Prosedürü: &quot;emniyet yakalamak&quot; kullanılarak, bir fonksiyonlandırılmış bis-peptit trimerininkinden verimli bir katı-faz peptid sentezi açıklanmaktadır.

Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi &quot;Güvenlik&quot; Catch Kullanımı

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

solid-phase-synthesis-functionalized-bis-peptide-using-safety-catch

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.5K Görüntüleme.  Temple University. Bir HMBA reçineden Yarılma Prosedürü: "emniyet yakalamak" kullanılarak, bir fonksiyonlandırılmış bis-peptit trimerininkinden verimli bir katı-faz peptid sentezi açıklanmaktadır.

Video: Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Paralel Sentezi ve Otomatik Liquid Handling kullanma Ugi Reaksiyon optimizasyonu

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Biyoloji

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

Nohutta Kuru Kök Çürüklüğü Hastalığı Tahlilleri: Detaylı Bir Metodoloji

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

İşlevselleştirilmiş spirrosiklik heterosiklus sentezi ve sitotoksisite testi

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Methods Article

Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi "Güvenlik" Catch Kullanımı