Die Autoren danken Herrn Dr. Zachary Z. Brown und Jennifer Alleva für die anfängliche Entwicklung dieses Festphasensynthese Technik und Matthew Parker FL für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wird durch die Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) und dem Horst Witzel Fellowship Award von Cephalon, Inc. unterstützt unterstützt

1. Setup- <ol><li> Die Reaktion Set-up für die Festphasen-Synthese ist ein Polypropylen Filterpatrone oder Glasreaktor, die über Polypropylen Schlauch zu einem geschlossenen Saugflasche wird unter Vakuum verbunden, wie in 1 gezeigt. Die Reaktion kann von einem magnetischen Rührstab oder durch Einblasen von Stickstoff durch den Reaktor gemischt werden. </li><li> Ein Gasverteiler, der mit einem Argon-Zylinder mit einem Trockenrohr und Öl Absorptionsflasche ausgestattet ist auch zu empfehlen, da das Reaktionsgefäß unter einer inerten Atmosphäre enthalten sein können und ermöglicht die Entfernung von Reagenzien aus geschlossenen Behältern. </li><li> Alle Operationen werden in einer Abzugshaube und richtige persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe aus Nitril) ist erforderlich, durchgeführt. </li></ol> 2. Lädt erste Bis-Peptid auf Harz <ol><li> Wiegen Sie 114 mg HMBA-AM-Harz (0,88 mmol / g Beladung, 100 mmol) in 8 ml Reaktionsgefäß und fügen Magnetrührer. Verschließen Sie den oberen Teil thE, das mit einem Gummiseptum und Spülung das Rohr mit Argon für mindestens 5 Minuten. </li><li> In der Zwischenzeit, wiegen 117,3 mg der Verbindung 1 von 3 (586,63 g / mol, 2 Äq) und 59,2 mg 1 - (Mesitylen-2-sulfonyl)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296,0 g / mol, 2 Äq) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen Einweg und lösen sich in 2 ml wasserfreiem Dichlormethan (DCM). In 24 ul 1-Methylimidazol (NMI, 80,81 ml / mol, 3EQ) zu Lösung und mischen, bis vollständig gelöst ist. </li><li> Übertragen der aktivierten Lösung in das Reaktionsgefäß über eine Spritze und zu erlauben, unter Argon über Nacht (~ 10 Stunden) gerührt. </li><li> Entfernen Sie das Septum und lassen Sie das Reaktionsgemisch. Waschen des Harzes mit DCM (5x) und Dimethylformamid (DMF) (5x). Führen Sie die &quot;Methylrot-Test&quot; in Abschnitt 10.1 beschrieben, den Grad der Harzbeladung beurteilen. Wenn das Harz bleibt während der Methylrot-Test rot dann werden die Schritte 2.2 und 2.3 wiederholt werden soll. Eine gelbe Farbe, indikativ für ein negatives Methylrot Test, bevorzugt ist;jedoch kann, da alle verbleibenden Hydroxylgruppen im nächsten Schritt, ein leicht positives Ergebnis (hellorange Farbe Harz) verschlossen werden akzeptabel sein. </li></ol> 3. Entschützung der erste Bis-Peptid-und Simultan Resin Capping <ol><li> 1 mL DCM in das Reaktionsgefäß dann 1 ml 33% Bromwasserstoff in Essigsäure tropfenweise über 30 Sekunden (Blasenbildung auftritt) und lassen Sie ihn 15 Minuten lang rühren. Abgießen und wäscht das Harz mit DCM (5x) und wiederholen Sie noch einmal verarbeiten. </li><li> Waschen des Harzes mit DCM (5x) dann DMF (5x). Neutralisieren des Harzes durch zweimaliges Waschen mit einer 5% v / v Lösung von N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA) in DMF und dann mit DCM (5x) und DMF (5x) wieder zu waschen. Führen Sie die &quot;Methylrot-Test&quot; und &quot;Chloranil-Test&quot; in Abschnitt 10.1 und 10.2 diskutiert. Die Ergebnisse sollten für die Methylrot-Test und positiv für die Chloranil-Test negativ. </li></ol> 4. Coupling Boc / tBu-Protected funktionalisierte bis-Amikeine Säure <ol><li> Wiedereinführung einer inerten Atmosphäre zu dem Harz enthaltenden Reaktionsgefäß durch dreimaliges Waschen mit wasserfreiem DCM, dann schließen ein Septum und Argon Linie. Reinigen und waschen Sie den Behälter, indem 1-2 ml wasserfreiem DCM und Vermietung für Aufsehen für 30 Sekunden dann Ablassen des Schiffes bis zur Argon Linie Bubbler zu steigen beginnt. Tun Sie dies mindestens einmal mehr. </li><li> Eine Lösung aus 0,15 M Bis-funktionalisierte Aminosäure (3EQ) und 245 mg 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) in 2 ml 2:1 DCM: DMF in einer Flamme getrockneten Test Rohr unter Argon-Atmosphäre. In 47 uL Diisopropylcarbodiimid (DIC, 156,6 mL / mol, 3EQ) und rühren für 90 Minuten. </li><li> In 35 ul DIPEA (174,19 mL / mol, 2 Äq) in 666 ul wasserfreiem DMF auf Harz und lassen Sie es 5 Minuten rühren. </li><li> Übertragen der voraktivierten bis-Aminosäure-Lösung in das Reaktionsgefäß über eine Spritze zu ermöglichen, und über Nacht gerührt. </li><li> Lassen Sie das Reaktionsgemisch und waschen zweimal mit wasserfreiem DCM während unter<html> Argon. </li><li> Um die Schließung des Diketopiperazin fördern, fügen Sie eine 0,25 M Lösung von HOAt (136,11 g / mol, 10eq) und DIC (156,6 ml / mol, 10eq) in einem 4 ml 1:1 DCM: DMF und zu erlauben, unter Argon rühren für 1 Stunde. </li><li> Entfernen Sie das Septum und lassen Sie das Reaktionsgemisch. Waschen des Harzes mit DCM (5x) und DMF (5x). Wenn gewünscht, führen Sie die &quot;Chloranil-Test&quot; in Abschnitt 10.2 besprochen. </li></ol> 5. Entschützung der Boc / tBu-geschützten funktionalisierten bis-Aminosäure <ol><li> 2 ml einer Lösung von 95:5 trifluororacetic (TFA): Triisopropylsilan (TIPS) in das Reaktionsgefäß und lassen Sie sie für 1 Stunde gerührt. Abgießen und wäscht das Harz etwa 30 Sekunden lang mit DCM (5x) und wiederholen Sie Vorgang noch einmal. </li><li> Waschen des Harzes mit DCM (5x) dann DMF (5x). Neutralisieren des Harzes durch zweimaliges Waschen mit einer 5% v / v Lösung von DIPEA in DMF waschen DCM (5x) und DMF (5x) wieder. Wenn gewünscht, führen Sie die &quot;Chloranil-Test&quot; in Abschnitt 10.2 besprochen. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 wie gewünscht zu synthetisieren gezielte Bis-Peptid. 7. Funktionalisierung des Bis-Peptid Prolidine End <ol><li> Die prolidine Ende der wachsenden Bis-Peptid kann unabhängig oder gemeinsam durch ein Diketopiperazin acyliert werden. Außerdem kann dieses Ende links geschützt werden, was diese gespalten sein, weshalb die freie Aminosäure. Wenn gewünscht, führen Sie die &quot;Chloranil-Test&quot; in Abschnitt 10.2 diskutiert, um Kopplungseffizienz zu beurteilen. </li></ol> 8. Entschützung der Fmoc und Acylierung des Quartär Ende des Bis-Peptid <ol><li> Ein 2-ml-Lösung von 20% Piperidin in DMF zugegeben und die Reaktion wird für 20 Minuten gemischt. Abgießen und wäscht das Harz mit DMF (5x) und wiederholen Sie Vorgang noch einmal. </li><li> Waschen des Harzes mit DCM (5x) dann DMF (5x). </li><li> Planen einer 0,15 M Lösung von Aminosäure (3EQ) in 2 ml N-Methylpyrrolidon (NMP) mit 114 mg 2 - (7-aza-1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3EQ) und 104,5 ul DIPEA (174,19 mL / mol, 6EQ) und umrühren. In den Reaktionsbehälter und lassen Sie sie für 6 Stunden rühren. </li><li> Waschen des Harzes mit DCM (5x) dann DMF (5x). </li></ol> 9. Entfernen Sie die Boc-Gruppe vom Harz gebundenen Aminosäure und spalten aus Resin <ol><li> 2 ml eines 1:1 TFA: DCM-Lösung in das Reaktionsgefäß und zu ermöglichen, 30 Minuten rühren. Abgießen und wäscht das Harz mit DCM (5x) und wiederholen Sie noch einmal verarbeiten. </li><li> Waschen und abtropfen lassen das Harz für 30 Sekunden mit DCM (5x), dann DMF (5x). </li><li> 2 ml einer Lösung von 10% DIPEA in wasserfreiem DMF und zu ermöglichen, von 24-48 Stunden gerührt. </li><li> Sammle Reaktionsmischung in vorgewogenen Rundkolben. Übertragen Sie 30 ul dieser Lösung in 450 ul THF in einem LC-MS-Fläschchen und legt für die Analyse. Das Harz wird mit zusätzlichen Aliquots DMF und sammeln in den Rundkolben entfernen Lösungsmittel im Vakuum. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Reinigung von Bis-Peptid <ol><li> Man löst rohe Bis-Peptid in einer minimalen Menge von Dimethylsulfoxid (100-250 mL) und Überführung in HPLC-Ampulle Einsatz. Ort-Einsatz in Autosampler von semi-prepitive HPLC-System (Hewlett Packard 1100 Serie) mit einer XTerra Prep MS C18 5 um 7.8x150 mm-Säule und einer 100 ul Injektionsschleife ausgestattet. </li><li> Führen Sie mehrere Injektionen 50 ul der Probe unter Verwendung eines Gradienten-Programm von 5-95% Acetonitril in Wasser mit 0,1% Ameisensäure über 30 Minuten während der Überwachung bei 274 nm. Sammeln Sie die Produkt-Peak in einem vorher gewogenen Einweg-Zentrifugenröhrchen und einfrieren trocken mit einem Lyophilisators. Vorsicht ist mit dem ersten Lauf als eine leichte Verschiebung der Peak-Retentionszeit im Vergleich zu analytischen LCMS wird typischerweise beobachtet genommen werden. </li></ol> 11. Assessment Methods <ol><li> Methylrot TEST 7: Entfernen ~ 1 mg trockenes Harz über Einwegpipette und spülen in 4 ml Reaktionsgefäß. Fügen Sie eine Lösung von 20 mg Methylrot, 50 ul N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimid (DIC) und 5 mg 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) in 500 ul wasserfreiem DCM und lassen Sie sie für 5-10 Minuten rühren. Abtropfen lassen und abwaschen Harz mit DCM, bis das Filtrat farblos wird. Positive Indikation ist die Harzperlen verbleibende orange oder rot. </li><li> Chloranil-Test 12: Transfer ~ 1 mg trockenes Harz in einem kleinen Fläschchen über Einwegpipette. 3 Tropfen einer 0,8 mM sowohl Chloranil in DMF-Lösung und 2% Acetaldehyd in DMF-Lösung und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten. Positive Indikation ist die Harzperlen Drehen blau / lila. </li><li> AKTIVIERUNG trap-Test: aktivierten Verbindungen während der Synthese kann durch die Übertragung eine kleine Menge (5-10 mL) der aktivierten Lösung für ein Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Fläschchen mit 50 ul Pyrrolidin beurteilt werden. Mischen Sie mit der Hand ein paar Sekunden (Lösollten sich auf gelb), dann verdünnen mit 450 ul Tetrahydrofuran (THF) und legt für die LC-MS-Analyse. </li><li> ANALYSE-LC-MS: Das Endprodukt und aktivierten Zwischenprodukte, kann unter Verwendung eines HP 1200-Serie LC-MS-System mit einem Waters Xterra MS C18 3,5 um versehen werden 4,6 mm x 150 mm-Säule und einem Gradienten-System von 5-95% Acetonitril in Wasser mit 0,1% Ameisensäure als 30 Minuten. </li></ol> 12. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für sowohl rohe (4) und gereinigt (Abbildung 5) LCMS Spuren vorgesehen sind. Gereinigtes Ausbeuten von etwa 10% zu erwarten sind mit den oben beschriebenen Methoden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Versuchsanordnung für die Festphasensynthese. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Abbildung 2.Einschlägige Nomenklaturen von Bis-Amino Acids / Bis-Peptide. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Abbildung 3. Insgesamt Syntheseschema. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Abbildung 4a. HPLC-Spur des Rohprodukts bei 274 nm. <img alt="Abbildung 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Abbildung 4b. MS-Spektrum des Rohprodukts Peak. <img alt="Abbildung 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Abbildung 5a. HPLC-Spur des gereinigten Produkts bei 274 nm. <img alt="Abbildung 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Abbildung 5b. MS Spektrum von gereinigtem Product Peak.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hierin präsentierten Syntheseansatz stellt ein Verfahren zur Synthese von funktionalisierten Bis-Peptide, die von Bis-Aminosäure-Bausteine ​​mit gemeinsamen Festphasen-Peptidsynthesetechniken. Die Monomer-Synthese dieser &quot;Pro4&quot; Bausteine ​​aus trans-4-Hydroxyprolin 3 ist hoch skalierbar und wurde erfolgreich auf die Bühne zu einem Hydantoin 600 mmol (234 g) Skala (unveröffentlicht) abgeschlossen. Wenn die Monomere in der Hand sind, stellt die Verwendung von Festphasenverfahren eine schnellere Verfahren nach Bis-Peptidsynthese, als die aktuelle Methode Lösungsphase 4 durch wodurch die Notwendigkeit für die Reaktion Aufarbeitungen und Zwischenprodukte Reinigungen. Die primäre Herausforderung bei der Festphasensynthese wird die Diagnose synthetischen Fortschritt und Problemlösung, da keine Zwischenprodukte isoliert werden. Dies hat zu der Entwicklung vieler kolorimetrischen Tests einschließlich derer zu ermitteln, ob freie Amine (Kaiser-Test 10) oder frei Hydroxyle (Methyl-Rot-Test 7) an Harz ausgesetzt. Leider ist das häufig verwendete Kaiser Test 10 nicht allgemein anwendbar in unserem Festphasensynthese durch die fast ausschließliche Verwendung von sekundären Aminen oder Aminen an einem quartären Kohlenstoff. Andere Optionen für die Beurteilung auf HMBA Harz umfassen Test Spaltungen mit einem Nucleophil wie Hydrazin 11, quantitative Fmoc-Abspaltung durch UV / Vis 1,11 überwacht, und Einfangen und Analysieren von eingehenden Verbindungen aktiviert. Ein weiteres Problem übersehen in der Festphasensynthese ist die Reproduzierbarkeit von synthetischen Schritten durch den Bediener erforderlich. Mit diesem Gedanken, die Autoren empfehlen dringend die Verwendung einer Tabellenkalkulation oder eine Checkliste bei der Durchführung keine manuelle Festphasen-Peptid-Synthese. Die Schwierigkeit bei Verwendung von Bis-Peptide für die Festphasen-Synthese im Vergleich zu herkömmlichen α-Aminosäuren beinhaltet auch das Potenzial für schwierige Kopplung aufgrund von sterischendernis, die Notwendigkeit auf dem Harz Diketopiperazin Verschlüsse, und gleichzeitige Entschützen (Boc / tBu; Cbz / tBu). Ein weiterer schwer liegt bei der Erreichung quantitativer Freisetzung aus dem Harz mit dieser &quot;Safety-catch&quot;-Methode, wenn zu konventionelleren Mitteln verglichen. Mit diesen Faktoren zu berücksichtigen, ist es sehr möglich, dass eine weitere Optimierung dieser Methode erzielt werden kann und die derzeitigen Bemühungen sind in unserer Gruppe im Gange, um die hier vorgestellte Methode zu verbessern.

<table border="1"><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> HMBA-Am Harz </td><td> NovaBiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> NovaBiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Giftig, Ätzend </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Karzinogen </td></tr><tr><td> Wasserfreiem DCM </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Karzinogen </td></tr><tr><td> 33% Bromwasserstoff in Essigsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Giftig, Corrosive, Dämpfe, wenn sie geöffnet </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Entzündlich, giftig, ätzend </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Entzündlich, Giftig </td></tr><tr><td> Wasserfreiem DMF </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Entzündlich, Giftig </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Entzündlich, giftig, ätzend </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Giftig, Ätzend </td></tr><tr><td> TIPPS </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Entzündlich, Giftig </td></tr><tr><td> Piperidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Entzündlich, giftig, ätzend </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxic </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Giftig </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> NovaBiochem </td><td> 851055 </td><td> Giftig </td></tr><tr><td> Methylrot </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Entzündlich, giftig, Peroxid-Forming </td></tr><tr><td> Pyrrolidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Entzündlich, giftig, ätzend </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Fischer </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS Reaktionsgefäße </td><td> Gnade </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> 1200 Serie </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> 1100-Serie </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Lyophilisators </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Büchi </td><td> R-210-Serie </td><td></td></tr><tr><td> Argon </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

Im Jahr 1962 veröffentlichte RB Merrifield die erste Verfahren unter Verwendung von Festphasen-Peptid-Synthese als ein neuer Weg, um effizient zu synthetisieren Peptide. Diese Technik erwies sich schnell als vorteilhaft gegenüber seinen Vorgänger-Phasen-Lösung sowohl in Zeit und Arbeit. Verbesserungen hinsichtlich der Art der festen Träger, beschäftigt die Schutzgruppen und die Kopplung Methoden in den letzten fünf Jahrzehnten beschäftigt haben nur die Nützlichkeit des ursprünglichen Systems Merrifield Jahre stark zugenommen. Heute Pionier Verwendung einer Boc-Schutz-und Base / Nucleophil spaltbare Harz Strategie oder Fmoc-Schutz-und sauren abspaltbare Harz Strategie, die von RC Sheppard, werden am häufigsten für die Synthese von Peptiden 1 verwendet. Produkt von festen Träger Merrifield-Strategie, haben wir eine Boc / tert-Butyl-Festphasen-Synthese-Strategie für die Montage von funktionalisierten Bis-Peptide 2, die hierin beschrieben entwickelt. Der Einsatz von Festphasensynthese gegenüber tO-Lösung-Phasen-Methode ist nicht nur vorteilhaft sowohl in der Zeit und Arbeit, die von Merrifield 1 beschrieben, sondern erlaubt auch größere Leichtigkeit der Synthese von Bis-Peptid-Bibliotheken. Die Synthese, die wir hier zeigen, ist mit einem endgültigen Spaltung der Bühne, die ein zweistufiges &quot;Safety-catch&quot;-Mechanismus, um die funktionalisierten Bis-Peptid vom Harz durch Diketopiperazinbildung Release verwendet. Bis-Peptide sind starr, Spiro-Leiter Oligomere von Bis-Aminosäuren, die in der Lage, Funktionen in einer vorhersagbaren und gestaltbar Weise durch die Art und Stereochemie der Monomer-Einheiten und die Konnektivität zwischen jedem Monomer gesteuert zu positionieren sind. Jede bis-Aminosäure eine stereochemisch reine, cyclische Gerüst, das zwei Aminosäuren (eine Carbonsäure mit einer α-Amin) 3,4 enthält. Unser Labor wird derzeit untersucht das Potenzial funktionellen Bis-Peptide in einer Vielzahl von Feldern einschließlich Katalyse, Protein-Protein-Wechselwirkungen und nanomaterials.

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

Die effiziente Festphasen-Peptid-Synthese eines funktionalisierten Bis-Peptid Trimer Verwendung eines &quot;Safety-catch&quot; Spaltung Verfahren aus HMBA Harz beschrieben.

Festphasensynthese eines funktionalisierten Bis-Peptids unter Verwendung von &quot;Safety-Catch&quot;-Methodik

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.5K Aufrufe.  Temple University. Die effiziente Festphasen-Peptid-Synthese eines funktionalisierten Bis-Peptid Trimer Verwendung eines "Safety-catch" Spaltung Verfahren aus HMBA Harz beschrieben.

Serie: Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Optimierung der Ugi-Reaktion mit Parallel Synthese und Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Forschung

Biologie

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: eine detaillierte Methodik

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...