עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH R01 מענקי DK060581, R01 DK083583 (שניהם לRGM).

חומרים דרושים א: ראה טבלה 1 (ריאגנטים) לפני ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (P / S): 100 מ&quot;ל HBSS 10X + 900 המ&quot;ל H 2 0 + 1% פניצילין / סטרפטומיצין (מאוחסן במקרר או שמר על קרח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20% מניות BSA נעשית במים וaliquoted ומאוחסנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (BSA): 200 מ&quot;ל 1X HBSS (P / S) + 3 מ&quot;ל של 20% BSA (ריכוזי BSA האחרונים הם 0.3%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איילט בינוני: RPMI + 10% FBS + גלוטמין% 1 + 1% פניצילין / סטרפטומיצין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Histopaque 1100: 240 1119 Histopaque המ&quot;ל + 200 המ&quot;ל 1077 Histopaque </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר 4-0 (McKesson): לחתוך לחתיכות 2 ¾ אינץ ומאוחסן בצלחת פטרי 10 סנטימטרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירים: לכופף את המלקחיים מהגדרות המדע פיין עד 90 מעלות, ולשייף את השיניים המשוננות של כל שלושת הזוגות במלקחיים. המטרה היא להקהות את השיניים, שלא להסיר אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורית לממשל של תערובת collagenase / פרוטאז: 27G ½ פנימה מחט, 30 וחצי פנימהמחט, PE50 צינור חתוך לחתיכות 12 פנימה. להגיש שתי המחטים עד סוף חלק מעוגל שאין קצוות חדים. הכנס את מחט 27G לקצה אחד של 12 פנימה חתיכת PE50 צינורות. הסר מחט 30G מהמעטפת על ידי ניפוץ המעטפת עם צבת, הופך את מארז ¼ פונה בכל פעם. הסר את המחט בצבת מהמעטפת והכנס אותו לקצה השני של צינור PE50 תחת מיקרוסקופ נתיחה. הקפד שלא קינקיות הצינור שאתה מכניס את המחט לתוך PE50 הצינורות. מחט 27G היא הסוף שתוכל לצרף את המזרק של collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטאז collagenase (CI האנזים הזה MA) והניטראלי (CI האנזים הזה BP). לשקם TDE להוראות יצרן. עיין בתעודה הספציפית הרבה ניתוח כדי לחשב את ריכוז פעילות האנזים. העברת סך של 350.000 פעילות יחידות קולגן משפילות (CDA) של collagenase המשוחזר ו100.000 יחידות הפרוטאז ניטראליות של reconstitפרוטאז uted BP לתוך צינור חרוטים ולדלל עד סך 15 מ&quot;ל בHBSS (P / S) </li></ol> פרוטוקול ב &#39;שלב אחר שלב 1. אינפלציה של לבלב עם תערובת collagenase / פרוטאז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר רחם, להרוות את גוף העכבר עם EtOH 70%, חלל בטן פתוח לחלוטין מפי הטבעת לסרעפת עם כל מספרי נתיחה ומלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על הפלטפורמה של המיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המעי האטום ומעי הגס עולה החוצה ולהגדיר אותם מחוץ לחלל הגוף לשמאלך. ראה איור 1 לסיכום של השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את האונות של הכבד נגד הסרעפת; הם צריכים להישאר שם אם חלל הגוף פתוח מספיק רחוק. מצא את העורק כבד, וריד פורטל וחבילת צינור מרה מובילה אל הכבד על ידי האחיזה בתריסריון עם מלקחיים מעוקלים. עם עוד זוג מלקחיים מעוקלים, להגיע מתחת לעורק, וריד והצינור bundle ולמשוך 2 ¾ פנימה חתיכת התפר 4-0 תחת העורק, הווריד, צינור המרה ולקשור אותו פעם אחת ולמשוך אותו בחוזקה כמו לסגור את הכבד ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בשני זוגות של מלקחיים מעוקלים, לתפוס זהירות התריסריון ולמצוא את צינור המרה יצורף לתריסריון בגבשושיות. השתמש במלקחיים של טונג למבעדם לבלב וזכות רקמת חיבור מתחת קרוב צינור המרה לגבשושיות. נקוב המלקחיים שלך במהירות באמצעות האיבר לעשות חור ולאחר מכן הניח את שני המלקחיים של מלקחיים ביניהן ותופס חלק 2 ¾ סנטימטרים נוספים של תפר דרך 4-0 ולקשור אותו פעם אחת ולמשוך אותו למעגל קטן, אבל אל תמשכו חזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי ל90 ° המלקחיים ולמספרי Vannas Superfine. עם 90 ° מלקחיים, לצבוט בזהירות ולמשוך מעי הדק עד צינור המרה הוא מתוח. הפוך חתך אופקי אחד מעבר פטמית עם מספריים מדקירת סכין את המספריים הפתוחים אל המעי ולאחר מכן חיתוך בתנועה אחת. נסה לעשות o רקne חצה פטמית בלי להינתק צינור המרה מהגבשושיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ועדיין מחזיק את המעי עם 90 מלקחי °, להכניס צינורית לתוך צינור המרה עד מחצית אורכו של צינור המרה, ולאחר מכן משוך בעדינות את התפר ההדוק סביב הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק 3 מ&quot;ל עם 2.0 מ&quot;ל של תערובת collagenase / פרוטאז ולהזריק לתוך הצינורית בקצב איטי וקבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האינפלציה של הלבלב היא מוחלטת, הסר צינורית מצינור מרה ולהשתמש במלקחיים המעוקלים ומספריים מעוגלים אביב כדי להסיר את הלבלב המנופח על ידי מתחיל במעי הגס היורד וחיתוך רקמת חיבור כפי שאתה מושך את המעיים. המשך להסיר את הלבלב מהמעיים עד שתגיע לצינור המרה, ואז להסיר את הלבלב מהטחול, אז בטן ולאחר מכן מהקרביים של חלל הבטן. סיים את ההסרה על ידי לגזוז את התפרים. הוסף את הלבלב לצינור 50 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל של HBSS(P / S). צינור זה צריך להיות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך לעיל לכל חיה עד ארבע חיות. לקבלת תוצאות אופטימליות, לנתק רק ארבע pancreata בפעם אחת. בדרך כלל, ואילו הארבעה הראשונים הם באמבט המים 37 מעלות צלזיוס, אנו לנפח עוד pancreata ארבעה. </li></ol> 2. הלבלב דיסוציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את 50 צינורות המ&quot;ל מכילים pancreata לתוך אמבט מי 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הצינור ולבדוק לניתוק רקמות, כדי להיות בטוח רקמות מתפרקות בקלות, ואז מערבולת הצינורות 12 פעמים בזמן שאתה מחזיק את הצינור על ידי המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לא יותר מ 30 מ&quot;ל של HBSS (BSA) (זה יכול להיות סכום נמוך, תלוי כמה נחוץ כדי לאזן את הצינורות לצעד צנטריפוגה), וצנטריפוגה XG ב 290 דקות לאחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant זהירות ולהשאיר כמות קטנה של supernatant (2-3 מ&quot;ל) בתחתית כדי לא לשבש את התא הגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 30 מ&quot;ל ATTACהד ל14 גרם מחט, להוסיף לא יותר מ 10 מ&quot;ל של HBSS (BSA) ולשאוב את ההשעיה למעלה ולמטה 2 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את תערובת התא דרך מסננת תה פלסטיק לתוך צינור מ&quot;ל 50 ולשטוף עם 10 מ&quot;ל HBSS אחר (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 330 עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant למזוג ולהפוך צינורות לניקוז על מגבת נייר סופגת לדקת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל צינור בשנת 1100 histopaque 10 המ&quot;ל הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי histopaque עם 10 המ&quot;ל HBSS (BSA) וסרכזת ב900 XG עבור 18 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל 20 המ&quot;ל של supernatant באמצעות נשא pipet מ&quot;ל גדול 25 ולהעביר את supernatant דרך 70 מיקרומטר סינון הפוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את האיונים לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטרים על ידי pipetting 10 תקשורת איון מ&quot;ל דרך המסנן בעוד מחזיק אותו בצד ימין מעל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות האיים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 רקמת תרבות חממה עד מוכן לניסויים. בדרך כלל, איונים הן נבחרו ידניים וספרו לפני experimentation. </li></ol> 3. נציג תוצאות תשואות איון, מורפולוגיה, ואיכות הם הפרמטרים הכלליים המשמשים לשפוט את ההצלחה של בידוד איון. בידות שלנו, תשואות מאיון C57BL הממוצע / 6 העכבר הן בטווח של 150-250 איונים באמצעות פרוטוקול זה (ראה טבלה 2), וניתנות להשוואה לנתונים המתקבלים באמצעות אופטימיזציה סיגמא סוג XI collagenase. עם זאת, תשואות יכולות להשתנות בהתאם לעומס העכבר משמש וגיל של העכבר. רוב בעלי החיים שאנו מעסיקים הם בטווח גילי 8-16 שבוע פרוטוקול זה נבדק על זני עכבר מרובים, כולל C57BL / 6 (180-250 איונים / עכבר), CD1 (200-300 איונים / עכבר), 129 / ויטמין B6 (200-300 איונים / עכבר), BLKS-db/db (120-200 איונים / עכבר), NOD (10 בני שבוע, 100-150 איונים / עכבר), וNOD-SCID (100-150 איונים / עכבר ). מורפולוגיה איון טיפוסית מוצגת באיור 2, שבו יש לי איונים עגולים למלבניים צורה עם גודל אחיד יחסית (אם כי הגודל uniformity יכול להשתנות מזן לזן). איור 3 מציג הניתוח הטיפוסי שלנו של הפרשת גלוקוז מגורה אינסולין מC57BL / 6 איים מבודדים באמצעות עכבר TDES המטוהר לעומת collagenase XI סיגמא סוג. בדרך כלל, תוצאות באיכות גבוהה איון הכנה בגירוי אינסולין בגלוקוז 25 מ&quot;מ שהוא גדול 6-20 פעמים יותר מאשר זה שנצפה בגלוקוז 2.5 מ&quot;מ. יישומים אחרים יכולים לשמש גם כדי לבדוק את האיכות של איים מבודדים, ואלה כוללים שימוש בטכניקות perifusion, Ca 2 + הדמיה (עם Fura2), והשעתוק ההפוך PCR, בין יתר 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. סיכום של cannulation של צינור המרה. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מראה אופייני של איוני C57BL / 6 בבידוד 24 השעות הבאים. תמונות נרכשו במיקרוסקופ בהגדלה של 40X verted. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הפרשת גלוקוז מגורה אינסולין של C57BL / 6 איונים. בבידוד 24 שעות הבאים, 100 איונים הודגרו בצלחת 12-היטב לשעה 1 ב 37 ° C בקרבס-רינגר פתרון HEPES נאגר מכיל גלוקוז 2.5 מ&quot;מ. איונים אז הועברו לHEPES קרבס-Ringer בגלוקוז 2.5 מ&quot;מ עבור שעות נוספות, אחרי שsupernatant נאסף למדידת אינסולין באמצעות assay שני אתר immunospecific אנזים צמוד immunosorbent (ELISA) (קריסטל כימי). אותם האיים הועברו לאחר מכן לקרבס-רינגר פתרון HEPES נאגר מכיל גלוקוז 25 מ&quot;מ, ושחרור אינסולין לתוך המדיום נמדד באמצעות ELISA לאחר שעת 1 של דגירה.

<ol>
	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDS, יום שבת, ואין לי מה RGM לחשוף. AGB המחבר הוא מועסק על ידי VitaCyte. המחבר RCM יש עניין בעלות בVitaCyte.

בפרוטוקול זה, יש לנו תארתי ההליך שלנו לcannulation, זלוף collagenase, והניתוק של הלבלב העכברי, במטרה לבודד את האיים לנגרהנס. מבחינה טכנית, בשיטה שלנו, שלט בפעם אחת, צריכה לאפשר לבידוד לבלב בתוך 4 דקות של הרדמת חסד בבעלי החיים ועל ידי 1 שעה צריכה לגרום לבידודה של איים מחיה אחת. המהירות של הטכניקה מאפשרת לנו לבודד מאיונים עד 12 עכברים בקטע אופייני, ובכך וכתוצאה מכך הבידוד של עד 3,000 איים. בניגוד לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בתכשירים גסים של collagenase, הפרוטוקול שלנו כולל את השימוש של פרוטאזות מטוהרות, CI האנזים הזה collagenase תואר שני וProtease BP CI האנזים הזה. סטיות בעקביות מהיערכות TDE כי הם זמינים מסחריים דורשות שכל מגרש להיבדק בנפרד ומותאם מראש לשימוש כללי. השתנות זו הרבה להרבה הובילה אותנו לשקול שימוש בפוריםTDES fied מVitaCyte. TDES אלה מטוהרים מאוד מתאפיינים במספר שיטות לרבות השימוש במבחני מצע רגישים פלואורסצנטי שכותרתו. Assay CDA פלואורסצנטי רגיש יותר לצורות מולקולריות שונות של collagenase כי יש קינטיקה שונה בקולגן הטבעי המשפיל. מבחני המצע פפטיד הסטוריים מספקים הערכה חסרה של collagenase. אפיון collagenase ידי מספר שיטות מבטיחה פעילות אנזים גדולה יותר בין מגרשים. בהתבסס על הבדיקה בבית שלנו תוך שימוש במגוון של תכשירי collagenase הזמינים מסחרי, מצא כי שילובי אנזים מטוהרי ניב תוצאות לשעתק הרבה להרבה. היתרונות העיקריים של שימוש TDES מטוהר מאוד ומאופיין בקפדנות ביישום זה פעם אחת בהרכב האנזים האופטימלי מוגדרים, עקביות ביצועים הרבה להרבה מובטחת. עקביות זו מבטלת את תהליך העבודה האינטנסיבית של הסמכה הנדרשת בדרך כלל הרבהלמוצרי collagenase גולמי או מועשרים. TDES המטוהר גם לאפשר שינויים נוספים בהרכב על מנת לשפר את התפוקה והאיכות של איונים התאוששו מזנים שונים של עכברים. דיווח קומפוזיציות אנזים אופטימליות לבידוד של איים מזנים שונים של עכברים יכול להיות מועבר בצורה יעילה יותר. זה, בתורו, מוביל לשימוש יעיל יותר במשאבים וגמישות משופרת בעיצוב ניסיוני. יש הרבה שלבים קריטיים שיכול להשפיע על התוצאה של בידודי איון באמצעות הפרוטוקול שלנו. הראשון הוא הצורך להשיג אינפלציה יעילה של הלבלב בטפטוף של הכנת האנזים. זה חשוב להתחיל אינפלציה בכוח עדין על המזרק, ולהגדיל את הכח כהתנפחות הלבלב. זה מועיל כדי להעביר את המעיים ולהרים את הלבלב באינפלציה כך שcollagenase perfuses כל האיברים. שלב קריטי נוסף הוא הכח שבעזרתו לוחץ הצינורות afteדגירת r על 37 מעלות צלזיוס (שלב 2.2). אנחנו גילינו שרועדים בלבלב קשה נגד הכובע של הצינור גורם לפיצול של איונים, אך ללא כל צורה של ניתוק מכאני בשלב זה, תשואות איון יכולות לנפול באופן דרמטי. זה גם הכרחי כי במהלך שלב הניתוק עם המזרק (שלב 2.5), כוח רמה בינונית מיושם במהלך התנועה מעלה ומטה עם הבוכנה; זה מבטיח ניתוק רקמות נאות לפני שלב הסינון (2.6), שבו מעט מאוד רקמה יש לשמור על מסנן מסננת התה. לבסוף, השלב האחרון הוא לעקוב בזהירות את שאיפתם של 20 המ&quot;ל כל מהאיים המופרדים histopaque. למרות שאיים הם בדרך כלל בממשק של histopaque וHBSS, מצאתי שאנחנו מאבדים איונים כאשר אנו מנסים להסיר רק את הממשק, במקום זאת, אנחנו עכשיו להסיר את כל 20 המ&quot;ל באמצעות נשא pipet מ&quot;ל גדול 25. אנחנו הוספנו סינון דרך המסנן ההפוך 70 מיקרומטר (שלב 2.11) לבטל את הצורך לגentrifuge האיים שוב ושוב כדי לשטוף את histopaque.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td></td><td> קטלוג # </td></tr><tr><td> HBSS 10X </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> תפר רול yd 4-0 100 </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> מחט הסוף 14 גרם בוטה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Sciss Superfine Vannas </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מעוגלים האביב </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים מעוגלים (2) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים מעוגלים (למשך 90 °) </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 אינץ מחט </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> מחט 30G 1/2 אינץ </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> צינור PE </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP פרוטאז </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 מזרק מ&quot;ל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 מיליליטר מזרק </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 מיקרומטר סינון </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 2 צלחת פטרי סנטימטר </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תה פלסטיק </td><td> כל אספקת המטבח </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> לוח 1. ריאגנטים וציוד </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סיגמא הסוג XI (L010M8618) </td><td> התואר שני (100615) BP (110329) </td><td> התואר שני (081104) BP (100823) </td><td> התואר שני (091211) BP (101109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> לוח 2. ממוצע תשואות איון (± סטיית תקן) באמצעות המון TDE שונים * * נתונים מייצגים תשואות איון ממוצעות מלפחות 10 עכברים. מספרים בסוגריים לוטים </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

חקירתו של ביטוי גנים בטא תא ותפקוד במבחנה השתנתה ישר לאורך השנים מהמחקר של שורות תאים סרטניים מכרסמים לחקר איונים מכרסמים מבודדים. איים עיקריים מציעים את היתרון הברור שהם יותר משקפים נאמנו את הביולוגיה של מסלולי איתות תאיים ותגובות הפרשה. ואילו בשיטה של בידוד איון באמצעות אנזים הכנות dissociating רקמות (TDE) כבר מבוססת היטב במעבדות רבות 1-4, וריאציות בעקביות של תפוקה ואיכות איון מכל זן מכרסמים ניתן להגביל את מידת ההיתכנות ומחקרי איון ראשוניים. וריאציות אלו מתרחשות לעתים קרובות כתוצאה מTDES הגולמי המטוהר חלקי המשמש בהליך בידוד האיון; TDES לעתים קרובות מפגינים הרבה וריאציות להרבה בפעילות ולעתים קרובות דורש התאמות למינון של אנזים בשימוש. מספר קטן של דיווחים השתמש מטוהר TDES לבידודים סלולריים מכרסמים 5, 6 </sup&gt;, אבל בפועל הוא לא נפוץ למרות השימוש השגרתי ויתרונות של מטוהר TDES לבידודי איון אדם. בשיתוף פעולה עם VitaCyte, LLC (אינדיאנפוליס, אינדיאנה), פתח פרוטוקול שונה עכבר איון בידוד המבוסס על שתואר על ידי 7 Gotoh, 8, שבו הם TDES perfused ישירות לתוך צינור הלבלב של עכברים, ואחרי חלוקת רקמה גולמית באמצעות שיפוע Histopaque 9, ובידוד של איים מטוהרים. הבדל משמעותי בפרוטוקול שלנו הוא השימוש במטוהרי collagenase (CI האנזים הזה MA) ושילוב ניטראלי פרוטאז (CI האנזים הזה BP). Collagenase התאפיין בשימוש בקולגן פעילות assay 6 פלואורסצנטי המשפיל (CDA) שמנוצל סיבים מסיסים שבכותרתו fluorescently שוק עור כמצע 6. מצע זה יותר חזוי של קינטיקה של פירוק קולגן במטריקס הרקמות מכיוון שהוא מסתמך על קולגן יליד כמצע. פרוטאז הוא characterized עם assay הקינטית ניאון רגיש 10. ניצול משופרים מבחנים אלה, יחד עם ניתוח ביוכימי מסורתי יותר תאפשר TDE להיות מיוצר באופן עקבי יותר, מה שמוביל לביצועים משופר עקביות בין מגרשים. הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם לתשואה מקסימלי איון ומורפולוגיה איון אופטימלית באמצעות C57BL / 6 עכברים. במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה, כמה שילובים של collagenase ופרוטאזות ניטראליות הוערכו בריכוזים שונים, והיחס הסופי של collagenase: פרוטאז ניטראלי 35:10 מייצג ביצועים דומים לסיגמה הסוג XI אנזים. בגלל השתנות משמעותית בתשואות איון ממוצעות מזנים שונים של חולדות ועכברים כבר דיווחה, שינויים נוספים בהרכב TDE צריכים להיעשות כדי לשפר את התפוקה והאיכות של איונים התאוששו ממינים וזנים שונים.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease at JoVE.com

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

תיאור מפורט של בידוד איון עכבר מתואר באמצעות הטכניקה של cannulation באתר הלבלב ductal וטפטוף של שילוב של מטוהר collagenase ופרוטאז הניטראלי.

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Google

Research

JoVE Journal

Biology

43.2K Views.  Indiana University School of Medicine. תיאור מפורט של בידוד איון עכבר מתואר באמצעות הטכניקה של cannulation באתר הלבלב ductal וטפטוף של שילוב של מטוהר collagenase ופרוטאז הניטראלי.

Video: Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Murine Pancreatic Islet Isolation

הלבלב Murine איילט בידוד

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...