בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

מטרת מחקר זה היא להעמיק את הבנתנו את תפקיד כלי הדם של הלבלב הן בביולוגיה תקינה של הלבלב והן בהתפתחות מחלות. על ידי העשרה מוצלחת של מקטע האנדותל, אנו מבקשים לזהות מסלולים ספציפיים בתוך כלי הדם השולטים בתפקודי הלבלב, אשר ניתן למקד באופן פוטנציאלי כדי לשחזר ולשפר את תפקודי הלבלב בסביבות מחלה. לאחרונה, דגש הולך וגובר מושם על התפקיד של תפקוד לקוי של תאי אנדותל בפתולוגיות הלבלב.

זיהוי ההטרוגניות של אוכלוסיות תאי אנדותל בלבלב איפשר להבין כיצד אינטראקציות אנדותל בלבלב שואפות או מגינות מפני מחלות. גישות אומיקס כגון ריצוף RNA של תא בודד או גרעין יחיד, פרוטאומיקה וגנומיקה משמשות לחקר הלבלב ברמה התאית. כדי לקבל תובנות ברמה הרקמתית או המרחבית, פלטפורמות חדשות המשתמשות בגישות בלתי משוחדות ומבוססות בדיקה כגון Visium ו- Xenium מיושמות.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקת דיסוציאציה עדינה הממזערת אנזימי לבלב אנדוגניים מהפחתת יכולת הקיום של התא והליך מיון תאים מגנטי להעשרה סלקטיבית של תאי אנדותל. אסטרטגיית הדיסוציאציה וההעשרה של הפרוטוקול שלנו תאפשר הבנה נוספת הן של סמני פני התא והן של התעתיק של תאי אנדותל בלבלב שנחקר בעבר עקב מגבלות טכניות. כדי להתחיל, מקם את העכבר המתת חסד על שולחן הניתוחים.

מתח את גפי העכבר ואבטח אותם בסיכות. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך קטן קו האמצע דרך העור ואת הצפק מאזור הבטן התחתונה ולהרחיב לכיוון אזור החזה. חותכים דרך הסרעפת ומרימים את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.

הכנס מחט 25 עד 30 מד המחוברת מזרק המכיל PBS סטרילי קר כקרח לחדר השמאלי של הלב. יש לנקב את הלב בקצב של חמישה עד 10 מיליליטר לדקה ולהפסיק לאחר הזרקת 10 מיליליטר. לאחר מכן, באמצעות מספריים לנתח מלקחיים, לחלץ את הלבלב בזהירות.

מעבירים את הלבלב לצינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS קר כקרח, יחד עם מעכב טריפסין ומניחים את הצינור על קרח. כדי להתחיל, להשיג את הלבלב murine בצלחת פטרי המכיל PBS קר כקרח. באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה, בזהירות להסיר רקמות עודפות.

מעבירים את הלבלב החתוך לצינור חמישה מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה. בעזרת מספריים מנתחים, טוחנים את רקמות הלבלב לחתיכות עדינות, תוך שמירה על הצינור על קרח. מעבירים את הליזט לצינור 50 מיליליטר המונח על קרח.

הוסף שני מיליליטר של תמיסת collagenase לצינור חמישה מיליליטר כדי להסיר כל רקמת לבלב שיורית ולהעביר אותו לצינור 50 מיליליטר. לדגור את הצינור באמבט מים ממוזג ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. מניחים את הצינור עם רקמה הומוגנית על קרח ולתת לו להתיישב על ידי כוח הכבידה.

לאחר מכן מעבירים את הסופרנאטנט דרך מסנן של 70 מיקרומטר ומוסיפים חמישה מיליליטר של תמיסת עצירת דיסוציאציה. באמצעות מחט 27 מד, triturate את הגלולה הנותרת עם מיליליטר נוסף של פתרון דיסוציאציה ולהעביר אותו דרך המסנן כמו קודם. סובבו את מתלה התא ב-300 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס והשהו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ כביסה.

לדגור פעם אחת 10 בחזקתם של שבעה תאים עם מיקרוליטר אחד של נוגדן ביוטין אנטי CD31 על מסובב. הוסיפו 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין ודגרו במשך 40 דקות נוספות. לאחר מכן הגדר מעמד מגנטי עם מחזיק מפריד העמודים והחל את העמודה.

לאחר איזון העמודה, הוסף את המדגם אליו ושטוף עם סך של תשעה מיליליטר של חיץ כביסה. הסר את העמוד מהמחזיק והנח אותו בצינור 15 מיליליטר. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ כביסה לעמודה.

באמצעות בוכנה, לדחוף למטה תאים בעמודה כדי לאסוף את elution המכיל את תאי אנדותל. לבסוף, סובבו מטה את שברי הזרימה וההתחמקות. לאחר השעיה מחדש, ספרו את התאים ומדדו את הכדאיות.

ניתוח PCR כמותי לאימות העשרת תאי אנדותל הראה כי לשברים המועשרים היו רמות גבוהות משמעותית של גני סמן, Pecam1 ו- Kdr בהשוואה לדגימות הזרימה. רמה נמוכה יותר של NK6 homeobox 1, גורם שעתוק בתאים האנדוקריניים של הלבלב, נצפתה בשברים המועשרים. כתמים מערביים הראו אותות חזקים של CD31 בגודל הצפוי, מה שאישר עוד יותר את העשרת תאי האנדותל בשברים.