עבודה זו מומנה על ידי OO0G01 להעניק Biosciences לאנרגיה של המכון.

השיטה OLIMP מודגמת על hemicellulose הגדולות להציג את קירות התא של צמחים dicot, xyloglucan, באמצעות endoglucanase כמו glycosylhydrolase. השיטה הוכיחה עם שתילים ארבידופסיס כולו כמקור רקמות הצמח. חומר מטריקס ו אנזימים תאיים ניתן להחליף בהתאם לניתוח המבוקש באמצעות ההליך אותו. 1. קיר בידוד נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Five קציר 5 ימים שתילים הישן ארבידופסיס כולו או כמות שווה של החומר הרצוי ולהעביר אותם לתוך צינור התגובה 1.5mL. ודא כי חומר ממוקם בתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שני כדורי מתכת 3mm אל הצינור תגובה על גבי המדגם Snap-להקפיא בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את המדגם קפואים באמצעות כדור הטחנה (02:30 דק &#39;, 25Hz). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL אתנול מימית 70% מהמדגם. הסר את כדורי מתכת באמצעות מגנט. וורטקס ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם בסל&quot;ד 14,000 עבור 10min כדי גלולה שאריות אלכוהול מסיס המכיל את החומר דופן התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL של פתרון כלורופורם / מתנול (01:01 v / v). וורטקס ביסודיות כדי resuspend גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם בסל&quot;ד 14,000 עבור 10 דקות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הדגימה באמצעות concentrator. </li></ol> 2. Solubilization של אוליגוסכרידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור solubilization את פוליסכריד בפרט בצורה של אוליגוסכרידים שלה resuspend גלולה יבש 25μl של המאגר המתאים. עבור formate אמוניום endoglucanase 50mm, pH4.5, משמש. הוסף 0.2U של endoglucanase. ההשעיה וורטקס נוזל ספין למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם עבור 16h ב 37 ° C באינקובטור, רועד בכל 300rpm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הממס של לעכל (מים) באמצעות concentrator. </li></ol> 3. MALDI-TOF ניתוח של אוליגוסכרידים שוחרר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BioRex MSZ בתמורה 501 קטיון חרוזים שרף משמשים כדי להסיר מלחים האנזים מן המדגם מעוכל. מצבם חרוזים ידי הצבת aliquot בעמודה ריקה כביסה החרוזים עם כמויות של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5-10 חרוזים BioRex המדגם מתעכל מיובשים. ואז להוסיף מים 10μl, עבור כמויות קטנות יותר של חומר 5μl המים עשויים לשמש. לטבול את החרוזים בפתרון על ידי לחיצה קצרה מסובב את הצינור. דגירה לפחות 10min בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 2μl מטריקס (2,5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB), 10mg/ml במים) לצלחת יעד MALDI. להתאדות המטריצה ​​ממס תחת ואקום המוביל גבישים כימיים הומוגני מטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 2μl הפתרון מדגם desalted על גבי מטריצת הגבישים בצלחת היעד. אם אתה רוצה לזהות מספר גדול של דגימות רק לשמור על תצפית לכל היותר 3min. הפעם מסגרת מבטיח כי הדוגמה הראשונה הבחינו לא יבש עדיין. חכו 2min נוסף כדי להבטיח ערבוב יסודי של מטריקס מחדש מומס ומולקולות מדגם oligosaccharide במדגם הבחין האחרון. לאחר מכן יבש את הצלחת למקד תחת ואקום. תמהיל המדגם / מטריצה ​​צריך להתגבש תוך פחות 1min כדי לאפשר התגבשות הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת לתוך היעד ספקטרומטר MALDI-TOF המוני. המכשיר צריך להיות מוגדר במצב reflectron חיובי עם מתח מואץ של 20000V ו עיכוב של 350 ננומטר, את טווח המוני שנבחר צריך להיות 500-3000 דא (עשוי להשתנות תלוי oligomers צפוי). התחל ירי הלייזר ולאסוף 100-200 ספקטרה לפי המדגם, אשר נערך כדי ליצור ספקטרום נציג הממוצע (איור 2 א). יונים המייצג אוליגוסכרידים ספציפי ניתן לזהות על ידי המסה שלהם על יחס תשלום (m / z). עוצמות יון (גובה שיא) של כל היונים של עניין יש להוסיף עד 100% וכתוצאה מכך השפע היחסי של כל oligosaccharide במדגם (2B איור). </li></ol> 4. בניתוח OLIMP באתרו OLIMP יכול לשמש גם ישירות על רקמת השמטת כל צעד בהכנת הקיר. כדוגמה מולבן hypocotyls של ארבידופסיס כמקור רקמות הצמח משמשים. שוב, endoglucanase משמש כדי לקבוע את המבנה של xyloglucan hemicelluloses. אנזימים וחומרים רקמה ניתן להחליף בהתאם לניתוח המבוקש באמצעות ההליך אותו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר שתיל מולבן ולמקם אותו לצלחת MALDI ריק היעד ולתת הנבט יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, מומס formate אמוניום 50mm, pH4.5) על הנבט יבש במיקום הרצוי. ודא כי ירידה אנזים נוגע חלקית את הצלחת היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת היעד MALDI בכלי סגור עם לחות להרוות להימנע כי הירידה אנזים מתייבש. דגירה את הצלחת בחדר עבור 16 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הצלחת היעד MALDI עם רקמות הצמח לבין ירידה אנזים תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5μl מטריקס (DHB: 10 מ&quot;ג / ליטר) על גבי כל מקום אנזים יבשים. תן לזה לעמוד 2min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הצלחת היעד MALDI תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות עם MALDI-TOF. מניחים צלחת עם רקמת היעד ואת המקום אנזים / מטריקס (ים) לתוך הספקטרומטר MALDI-TOF המוני. המכשיר צריך להיות מוגדר במצב reflectron חיובי עם מתח מואץ של 20000V ו עיכוב של 350 ננומטר, את טווח המוני שנבחר צריך להיות 500-3000 דא (עשוי להשתנות תלוי oligomers צפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ירי הלייזר על גבי המטריצה ​​/ מדגם גבישים הבא לרקמה. הקפד לא לפגוע ברקמה עצמה, במקרה כזה את זמן הטיסה של מולקולות יהיה משם. איסוף סביב 20-50 ספקטרה לכל נקודה, אשר מופקים כדי ליצור ספקטרום נציג הממוצע (איור 3). יונים המייצג אוליגוסכרידים ספציפי ניתן לזהות על ידי המסה שלהם על יחס תשלום (m / z). עוצמות יון (יון גובה) ניתן לדווח על כל עניין יונים יש להוסיף עד 100% וכתוצאה מכך השפע היחסי של כל אוליגוסכרידים במדגם. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה לניתוח OLIMP של xyloglucan hemicelluloses נוכח שתילים ארבידופסיס מוצג באיור 2. בשל הבדלי המסה של יונים לבין האנזים מאופיין היטב ידוע (endoglucanase) סגוליות היונים ניתן להקצות מבנים oligosaccharide ספציפי (איור 2 א). ברור, איזומרים מבניים לא ניתן להבחין. הנחת היסוד לקביעת השפע היחסי של אוליגוסכרידים שונים (תרשים 2B) הוא מפרט המסה שלהם גורם לתגובה דומה מאוד עבור אוליגוסכרידים אלה. כפי שמוצג כאן, כימות OLIMP ניתנת לשחזור מאוד. עם זאת, יש לציין כי חוסנו של השיטה תלויה מאוד האות יחס רעש של יוני oligosaccharide שונים. לדוגמה זיהום עם מלחים או כמויות נמוכות של אוליגוסכרידים יכול להקטין את היחס. ניתוח OLIMP על הרקמה עצמה (בניתוח באתרו) מאפשר לימוד של אזורים קטנים מאוד מוגדרים כולל הכנת המדגם מעט מאוד. בדוגמה המוצגת כאן (איור 3) לא איכותי (יונים זהה) אך הבדלים כמותיים (וריאציה ב בעוצמות יון) נצפו בין הצילומים ואת השורש של רקמות הנבט ארבידופסיס. צירופים של שיטת-OLIMP יכול ובכך להוביל &quot;הדמיה&quot; רקמה. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תרשים זרימה של הליך OLIMP באמצעות שתילים ארבידופסיס כולו כמקור צמח. ראשית, הרקמה macerated קיר התא חומר מוכן (תמונה שונה מן Fujino et al. 10). ואז אוליגוסכרידים של פוליסכריד קיר מסוים משתחררים באמצעות hydrolase ספציפיים. לבסוף, שכיחותם היחסית של אוליגוסכרידים מסיסים נקבעים באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. השפע היחסי של אוליגוסכרידים xyloglucan ב שתילים מולבן מ ארבידופסיס כפי שנקבע על ידי OLIMP. א) נציג xyloglucan oligosaccharide מסה ספקטרום; יון מייצג מבנה oligosaccharide ספציפי, איזומרים מבניים לא ניתן להבחין. ב) בר תרשים מקבילים להגדרה של שפע oligosaccharide יחסית. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. בניתוח OLIMP באתרו באמצעות שתילים מולבן של ארבידופסיס כדוגמה. אגל כל אנזים / עיכול (מעגלים צבעוניים) ניתן לנתח באופן עצמאי ספקטרה המונית המקביל ניתן להשיג ולנתח. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הספקטרום OLIMP של xylan hemicellulose מתקבל על ידי לעכל חומר Miscanthus עלה עם xylanase (Megazyme).

<ol>
	<li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting.">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li><li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides.">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li><li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis.">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li><li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls.">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li><li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xyloglucan-specific+endo-beta-1,4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus:+expression+cloning+in+yeast,+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme.">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li><li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa:+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides.">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li><li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis.">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li><li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis.">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li><li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation:+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations.">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li><li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose.">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li><li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1,2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides.">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li><li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose.">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity.">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li><li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana.">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li><li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils,+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl.">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li><li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1.">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li><li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan,+a+major+primary+cell+wall+component.">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li><li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+liquid+chromatography,+capillary+electrophoresis,+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants.">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li><li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן OLIMP מאפשר ניתוח רגיש מאוד ומהירה של פולימרים נוכח מטריצות תאיים. OLIMP משלב את שחרור האנזימטית של oligomers עם ניתוח MALDI-TOF הבאים. הדור של הספקטרום MALDI-TOF לוקח פחות מדקה, ולכן OLIMP מתאים למגוון רחב של יישומים, כולל תפוקה גבוהה מחקרים כגון מסכי מוטציה. OLIMP אינו מוגבל סוכרים צמח אך עלולה להיות מיושם על מגוון רחב של פולימרים, מוגבל רק על ידי הזמינות של אנזימים hydrolytic ספציפיים. עם זאת, מגבלה של OLIMP הוא שפע מוחלט של הפולימר לא ניתן להשיג. כפי שהוזכר קודם לכן OLIMP ניתן להשתמש כדי ללמוד את המבנה של מגוון רחב של סוכרים המצויים המטריצה ​​תאיים של מגוון המינים. כדוגמה, איור 4 מייצג ספקטרום OLIMP של hemicellulose העיקרי מינים הדשא, xylan. כאן, דופן התא חומר הנגזר הדשא Miscanthus ממוזג היה מתעכל באמצעות xylanase.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>37550</td>
<td>10mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>BioRex MSZ 501(D) Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>142-7425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endoglucanase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Megazyme</td>
<td>E-CELTR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylanase M6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Megazyme</td>
<td>E-XYRU6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3mm metal balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>22.455.0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beat mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>Mixer Mill MM400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MALDI-TOF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shimadzu BioTech</td>
<td>Axima Performance</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MALDI target plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kratos Analytical</td>
<td>DE4555TA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpeedVac</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>Vacufuge 5301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MSVMHTS00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Welch</td>
<td>DryFast Ultra 2032</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

oligo mass profiling (olimp) of extracellular polysaccharides

מגע ישיר של תאים בסביבה מתווכת באורגניזמים רבים על ידי מטריקס תאיים. היבט אחד משותף של מטריצות תאיים היא שהם מכילים סוכר moieties מורכבים בצורה של גליקופרוטאינים, proteoglycans, ו / או סוכרים. דוגמאות כוללות את תאי מטריקס של בני אדם ותאי בעלי חיים המורכב בעיקר חלבונים proteoglycans או סיבי פוליסכריד המבוסס קירות התא של צמחים ופטריות, ואת proteoglycan / glycolipid קירות התא של חיידקים מבוסס. כל glycostructures אלו ממלאים תפקידים חיוניים בתא אל התא תקשורת התא אל הסביבה איתות. דוגמה יוצאת דופן של מטריצה ​​מורכבת תאיים קיים קירות בתאי צמח גבוה יותר. הקיר שלהם מורכב רובו ככולו של סוכרים, עד 75% ממשקלה היבש, והוא מורכב biopolymers הנפוץ ביותר כיום על פני כדור הארץ. לכן, המחקר נערך כיצד לנצל את החומרים האלה בצורה הטובה ביותר משאב פחמן ניטרלי מתחדשת להחליף פטרוכימיה שמקורם בדלק מחצבי. האתגר העיקרי לגיור דלק נשאר סרבנות קירות השפלה אנזימטית או כימי בשל glycostructures ייחודי נוכח biocomposite ייחודי זה. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של תא צמח glycostructures הקיר. שיטה זו המוניים אוליגו Profiling (OLIMP) מבוססת על שחרורו האנזימטית של אוליגוסכרידים מחומרים הקיר בהנחיית glycosylhydrolases ספציפיים ניתוח בדיעבד של תערובות oligosaccharide solubilized באמצעות מטריצה ​​בעזרת לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS ) 1 (איור 1). OLIMP דורש קירות רק 5000 תאים לניתוח מלא, ניתן לבצע על הרקמה עצמה 2, ניתנת תפוקה גבוהה ניתוחים 3. אמנם הסכום המוחלט של אוליגוסכרידים solubilized לא ניתן לקבוע על ידי OLIMP השפע היחסי של יונים oligosaccharide השונים ניתן התחום מן הספקטרום המונית נותן תובנות לגבי דפוס, החלפה של פוליסכריד הילידים נוכח הקיר. OLIMP ניתן להשתמש כדי לנתח מגוון רחב של פולימרים הקיר, מוגבל רק על ידי הזמינות של אנזימים ספציפיים 4. לדוגמה, לניתוח של פולימרים הנמצאים בתא אנזימים צמחיים הקיר זמינים לנתח את xyloglucan hemicelluloses באמצעות xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylan באמצעות Endo-β-(1-4), xylanase 6,7 , או סוכרים pectic באמצעות שילוב של polygalacturonase לבין methylesterase 8. יתר על כן, באמצעות אותם עקרונות של OLIMP glycosylhydrolase ואפילו פעילויות glycosyltransferase ניתן לנטר נקבע 9.

Watch this Scientific Journal Video about OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides at JoVE.com

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

הדרך המהירה מתואר להשיג תובנות מבנה סוכרים מטריקס תאיים. השיטה מנצלת את הייחודיות של glycosylhydrolases ואת הרגישות של ספקטרומטריית מסה המאפשר כמויות זעירות של חומרים כדי להיות מנותח. טכניקה זו ניתנת להתאמה כדי לשמש ישירות על הרקמה עצמה.

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Research

JoVE Journal

Biology

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

13.6K Views.  University of California, Berkeley. הדרך המהירה מתואר להשיג תובנות מבנה סוכרים מטריקס תאיים. השיטה מנצלת את הייחודיות של glycosylhydrolases ואת הרגישות של ספקטרומטריית מסה המאפשר כמויות זעירות של חומרים כדי להיות מנותח. טכניקה זו ניתנת להתאמה כדי לשמש ישירות על הרקמה עצמה.

Video: OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...