שיטת הקצב היה פיתח, אופטימיזציה על ידי חברי הקבוצה דופרי (מנדרינית, בריטניה) שונים לאורך השנים, אנו מעריכים כל התרומות שלהם. עבודה זו מומן כחלק של DOE המכון BioEnergy משותף (http://www.jbei.org) נתמכת על ידי מחלקת האנרגיה של ארה ב, משרד המדע, משרד הביולוגיים המחקר הסביבתי, באמצעות חוזה דה-AC02-05CH11231 בין לורנס המעבדה הלאומית ברקלי, מחלקת האנרגיה של ארצות הברית. אנו מודים גם תיאה פיק ו- Vy Ngo לקבלת עזרה בהכנת הדגימות csla9 .

1. קציר של חומר צמחי <ol><li>הקציר חומר צמחי טריים (~ 20 מ ג), מיד לתוכה אתנול 96% (v/v), דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה מבטל כל דופן התא משפילים אנזימים הנוכחי. עבור חומר יבש, מתחילים בשלב 2- 
	התראה: אתנול הוא דליק. 
	הערה: עלה אחד גזע או רוזט יספק מספיק חומר לניתוח. עם זאת, פחות שגיאות לצוץ אם בכמות גדולה יותר של רקמה זו איחדו וניתח מכיוון שזה קל יותר שוקל ולטפל.</li>
	<li>רקמה סוג רשומה בקפידה, שלב התפתחותי, כמבנה רב-סוכר משתנה עם שניהם. לדוגמה, עם תודרנית לבנה (בשימוש כאן), שלב הרקמה לפי השיטות של בויס. et al. 15 הערה: ב פרוטוקול זה, השתמשנו החצי התחתון של הגזע ינפלוראסכאנך, איפה silique הראשון הינו מאורך מלא אבל לא הצהבה.</li></ol>
 2. הכנה של אלכוהול לא מסיסים שאריות (אוויר) <ol><li>הכן אוויר, בעקבות השיטה של מורטימר. et al. 9 או שיטה דומה אחרת, על מנת לייצר אבקה חסר סוכרים מסיסים, כגון סוכרוז, עמילן.</li>
</ol> 3. Aliquoting וטרום טיפול של אוויר הערה: הכמות המדויקת של אויר הדרוש עבור כל דגימה יהיה תלוי (א) של השפע את רב-סוכר עניין בחומר ו- (ב) בגודל ממוצעת של oligosaccharides שפורסמו על ידי GH. השיטה מוסיף מולקולה בודדת פלורסנט עד הסוף תוך צמצום של. פחמימה # מיון, כל הפחמימות-כך מספר oligosaccharides קובע את הרגישות של הניסוי. כקו מנחה, glucomannan בגזע תודרנית מתעכל עם GH5/GH26 (כמתואר), 500 µg מומלץ 11, ואילו xylan בגזע תודרנית מתעכל עם GH11, מומלץ 100 µg כמו מורטימר &#39; s המחקר 3. <ol><li>שוקל אוויר (10-15 מ ג) לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL, ולהוסיף H 2 O ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. מערבולת כדי להשיג על ההשעיה אפילו. אם זה בעייתי, השתמש מהמגן זכוכית כדי לסייע תהליך זה-</li>
	<li>µG aliquot 500 לתוך microfuge צינורות. יבש aliquots באמצעות צנטריפוגה ואקום (ראה את הטבלה של חומרים) לילה ב- 30 ° C.</li>
	<li>האוויר לטיפול מראש עם 1 M NaOH (20 µL) לשעה בטמפרטורת החדר; זה מבטל את acetylates של סוכרים, מתנפח microfibrils תאית, לשבש את מבנה ביומסה ומאפשר גישה GH. 
	הערה: שלב זה ניתן לדלג על סוכרים מטוהרים. זהירות &#8211; חומצה/בסיס חזק.
	<ol><li>כוללים את aliquot עבור פקד אוויר לא-אנזים (אותו יחס כמו כל הדגימות, למעט שלב 4.1. אינו נכלל).</li>
	</ol></li> <li>µL להוסיף 200 של H 2 O ו 20 µL 1 מ' ב- HCl כדי לנטרל. מבחן ה-pH היא ~ 6-7 על ידי הסרת 1 µL ו לראות אותו על גבי נייר אינדיקטור חומציות.</li>
	מאגר אצטט <li>להוסיף 50 µL 1 מ' אמוניום, pH 6.0 (או איזה pH מתאים GHs השתמשו במחקר) ו- H 2 O לתת הנפח הכולל של 500 µL. 
	הערה: אמוניום אצטט משמש מאז זה sublimes על ייבוש, ולכן זה לא להוסיף מלח נוספים המדגם. עודף מלח יכול להוביל הלהקה המסכן-צורה והרזולוציה על הג'ל פייס.</li>
</ol> 4. הידרוליזה של האוויר עם Glycosyl Hydrolases (GHs) הערה: כאמור בדיון, טוהר GHs היא קריטית. רק להשתמש heterologously הביע, זיקה טהור אנזימים. לאחר קבלת כל חלקה של היצרן, hydrolyze aliquots מוגדרים של מצע (למשל, 500 µg אוויר) עם הגדלת כמויות של GH בן לילה (למשל, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 יחידות/µL). כאשר יש עודף של GH, טביעת האצבע בקצב ייראה זהה. עודף של אנזים נדרש לספק תוצאה לשחזור כי זה חייב להיות בטוח כי התגובה הידרוליזה מתקרב נקודת הקצה.
<ol><li>הוסף סכום שנקבע מראש (ראה לעיל) של mannanases (GH5, GH26 11) כדי aliquots האוויר במאגר מהשלב 3.5, כמו גם חיובי (30 µg של konjac glucomannan), ובקרה פקד שלילי. לא-אייר (אנזים מיקס ב שפופרת ריק). מערבולת, ומסתובב אז בקצרה כדי לאסוף את תערובת התגובה בתחתית השפופרת.</li>
	<li>דגירה בין לילה-37 מעלות צלזיוס (או את הטמפרטורה המתאימה עבור GH הבחירה) עם עצבנות עדין (~ 100 סל ד).</li>
	<li>לעצור את התגובה על ידי המקננת ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות 
	הערה: כובע סגרים יכול לשמש כדי לסגור את flip-העליון microfuge צינורות.
	<ol><li>צנטריפוגה באמצעות microfuge העליון של ספסל במהירות המרבית עבור 10 דקות ונשארים תגובת שיקוע.</li>
	</ol></li> <li>Resuspend צנפה 250 µL H 2 O, צנטריפוגה כאמור לעיל, ולשמר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לשלב שני supernatants, ויבש ומפרידה ואקום (ראה את הטבלה של חומרים) ב 30 ° C (~ 3 h או לילה ללא חימום).</li>
</ol> 5. הכנת תקנים פחמימה # מיון הפחמימות <ol><li>מניות 1 מ"מ הכן פתרונות H 2 O מנוז (אדם), mannobiose (האיש 2), mannotriose (האיש 3), mannotetraose (4 איש), mannopentaose (האיש 5), mannohexaose (איש 6), כל β, 1-4 מקושרים. Aliquot וחנות ב-20 ° C עד נדרש.</li>
	<li>להכין תערובת 1-6 3 ריכוזים שונים של אדם על ידי שילוב של µL 1 (תקן S1), µL 2 (S2) או 5 µL (S3) של כל ששת.</li>
	<li>יבש ומפרידה ואקום (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מעלות צלזיוס (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization של Oligosaccharides <ol><li>להכין פתרון מניות של נמלים 0.2 מ' (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic חומצה) H 2 O: חומצה אצטית 17:3. מניות חם עד 60 ° צלזיוס לחלוטין להתמוסס המוצק. חנות ב-20 ° C, מוגן מפני אור, 2-3 חודשים.</li>
	<li>להכין פתרון 0.2 מ' מניות של 2-picoline borane (2-PB) ב דימתיל סולפוקסיד. זה מאוד היגרוסקופי, אז מיד resuspend כל אבקה עם קבלת ב דימתיל סולפוקסיד. Aliquot, חנות ב-20 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שנים. הפשרת aliquots ככל הנדרש (החנות ב 4 ° C עבור 2 שבועות ולאחר מכן להשליך).</li>
	<li>להכין מאגר derivatization של H 2 O: אצטית חומצה: דימתיל סולפוקסיד בגיל 17:3:20-</li>
	<li>אחד לטעום, להוסיף 5 µL של נמלים, 5 µL של µL 2-PB ו- 10 מאגר derivatization. ספין בקצרה כדי לאסוף בתחתית של הרכבת התחתית, מערבולת ביסודיות, ואז ספין בקצרה שוב. ראה איור 1 לתיאור התגובה.</li>
	<li>Incubate דגימות לילה ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.</li>
	<li>יבש ומפרידה ואקום (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מעלות צלזיוס (~ 2 h).</li>
	תקן של אוריאה 100 של 3 מ' µL ודוגמאות <li>resuspend. חנות ב-20 ° C, מוגן מפני האור עד נדרש.</li>
</ol> 7. הכנה של קצב ג ' לים הערה: הרכבה של הציוד הליהוק ג'ל יהיה תלוי המותג. כאן, אנחנו use מערכת אלקטרופורזה אנכי (ראה טבלה של חומרים), מצוידים עם צלחות זכוכית 18 ס"מ 24 ס"מ ו- 1.5 מ מ מפרידי.
<ol><li>להרכיב ג'ל מכשור יציקה לכל היצרן &#39; הוראות s.</li>
	<li>לעשות 10 x קצב מאגר (1 מ' טריס-בוראט, pH 8.2) כלהלן: להוסיף 121.14 גר' טריס-בסיס ~ 400 מ של H 2 O ומיקס להתמוסס. להתאים את ה-pH ל 8.2 על-ידי תוספת של חומצה בורית מוצק (כ- 60 גרם), ולאחר מכן לבצע אחסון עד 1 ל'</li>
	<li>יעשו אמוניום 10% (w/v) persulfate (APS) מניות H 2 O. Aliquot ו לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס. ההפשרה aliquots פעם אחת, לאחסן ב 4 ° C ולמחוק לאחר 2 שבועות.</li>
	<li>להפוך ויוצקים את הג'ל פתרון. עבור הציוד הנ ל, ג'ל 1 להקביל בין 50 מ. בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, מערבבים H 2 O (20.2 מ"ל), מאגר בקצב של 10 x 5 מ ל, 24.6 מ ל 40% אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (29:1 acrylamide:Bis). (זהירות: רעיל).
	<ol><li>להוסיף 200 µL של APS ו 20 µL של N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED). היפוך בעדינות לערבב (כדי למנוע היכרות עם בועות אוויר). יוצקים את הג'ל באמצעות סרולוגית או פיפטה באמצעי אחסון גדולים אחרים, ~ 4 ס מ מתחת לקצה העליון של הזכוכיות. שימו לב לאפשרות של בועות אוויר מלהילכד הג'ל. אם הם עושים להפסיק לשפוך, הטיה/ברז הג'ל לשחרר אותם.</li>
	</ol></li> <li>כיסוי את הג'ל עם אלכוהול איזופרופיל (זהירות : דליק) או, בזהירות, עם H 2 O. אפשר ג'ל פולימריזציה (20-30 דקות), ולאחר מכן יוצקים את השכבה העליונה. אם אלכוהול איזופרופיל שימש, ואז לשטוף 2 x עם H 2 יבש או כל נוזל עודף באמצעות נייר סופג.</li>
	<li>להפוך ויוצקים את הג'ל הערימה. לערבב 6.8 מ ל H 2 O, מאגר בקצב של 10 x 1 מ"ל, 2.8 מ"ל אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (זהירות: רעילים), 80 µL APS, µL 8 של TEMED ב שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. ' היפוך ' כדי לערבב, כיסוי על גבי polymerized ג'ל פתרון. הכנס בעדינות מסרקים, הימנעות בועות אוויר השמנה תחת השיניים המסרק.</li>
	<li>אפשר ג'ל כדי פולימריזציה (20-30 דקות), עטוף ברקמה לחה ולאחר מכן גם בניילון נצמד, ולאחסן ב 4 ° C עד הנדרש. חנות עם המסרקים במקום. 
	הערה: קצב ג'לים ניתן לאחסן לתקופה מקסימלית של 2 שבועות (למרות פחות משבוע הוא אידיאלי), אם הם שמרו לחה.</li>
</ol> 8. ריצה קצב ג'ל <ol><li>להשתמש בסמן קבוע כדי לתייג את העמדות היטב על הזכוכית, אשר יסייע שמירה על מסלול של סדר טעינה, והם בזיהוי איפה הבארות המסרק הוא הוסר ברגע.</li>
	<li>להסיר את המסרק. למלא את הבארות מאגר בקצב 1 x-</li>
	<li>להשתמש microsyringe µL 10 כדי לטעון µL 2 של סטנדרטים ודוגמאות לתוך בארות. הימנע משימוש המסלולים החיצוני ביותר, אשר נוטים לרוץ דגימות גרוע.</li>
	<li>להרכיב התא העליון של המנגנון ג'ל-ריצה, ולמקם את הג'ל במיכל מקורר (~ 10 ° C) פועל (10 ° C) המכיל מאגר בקצב x 1. למלא את התא העליון עם מאגר בקצב 1 x-</li>
	<li>להפעיל כוח והפעל הג'ל ב- 200 וולט (קבוע V) במשך 30 דקות ולאחר מכן עלייה במתח עד 1000 V עבור 1 h 40 דקות. להגן על ג'לים מפני אור (למשל, על ידי ליפוף טנקים בשקיות אשפה שחור). 
	הערה: לבדוק ג'לים ~ 5 דקות לאחר הפעלת המתח ולאחר מכן עוד 5 דקות לאחר הגדלת המתח עד 1,000 V. אם ערכת צריכת חשמל אין אפשרות לשמור את המתח יש ככל הנראה דליפת המאגר. להסיר את הג'ל של הטנק. להרכיב מחדש את התא העליון, בודקים בזהירות השמה אטמים כל. שבב גדול בקצה העליון של לוח הזכוכית עלול למנוע את הצלחת יוצרים סגירה עם gasket. יכול בדרך כלל באופן זמני לפתור על-ידי הוספת ירידה של 5% (w/v) agarose מותכת לחלק סדוקים של הזכוכית, לפני הוספת התא העליון.</li>
</ol> 9. להמחיש ג'ל בקצב הערה: להשתמש ג'ל הדמיה למערך עם נורות UV ארוכת גל את transilluminator, ואת מסנן פליטה למצלמה אשר מתאים fluorophore, כאן 530 ננומטר. לחלופין, סורק לייזר עשוי לשמש גם, כפי שמתואר Goubet 2-
<ol><li>להבטיח הג'ל מערכת הדמיה היא בחינם אבק על-ידי. מוחקים את זה עם לחות נטולת מוך.</li>
	<li>להסיר את הג'ל ממיכל בקצב והצג בקצרה בזמן הג'ל עדיין נמצא הזכוכיות (&#60; 80 ms) כדי לקבוע אם החזית צבע היא עדיין על הג'ל.</li>
	<li>פתח את הג'ל בעזרת כלי טריז, בעוד ג'ל הוא עדיין בצלחת כוס אחת, להשתמש בחותך פיצה כדי להסיר את הג'ל בשני הערמה, ואם החזית צבע היא עדיין על הג'ל, החלק התחתון של הג'ל.</li>
	<li>את ~ 5 מ ל H 2 O אל פני השטח של transilluminator, ולאחר מכן להעביר את הג'ל ישירות על גבי transilluminator. להגדיר את המסנן UV 605 והפעל את transilluminator והאזינו UV (ראה טבלה של חומרים) באמצעות התוכנה- 
	הערה: fluorophore נמלים המשמש כאן יש עירור/פליטה של 353/520 nm.</li>
	<li>לקחת כמה תמונות בזמנים חשיפה שונים (למשל, 100 ms 10 s). ודא כי האור האולטרה סגול מבוטלת בין תמונות על-ידי לחיצה על לחצן אור UV (לבטל) כדי להימנע משפילים את קרינה פלואורסצנטית. להבטיח כי לפחות 2 תמונות יש להקות רוויים (הג'ל imaging התוכנה יציין זאת).</li>
	<li>שמור קבצים כתמונות גבוהה-resolution.tif. 
	הערה: תמונות ניתן לנתח באמצעות התוכנה המצורפת עם הג'ל מערכת הדמיה, או באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה בחופשיות, כגון ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). עיין בסעיף תוצאות הדיון כימות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+A+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Mortimer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+of+Cell+Wall+Polysaccharides+Using+PACE.">Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE.</a> Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).</li><li>Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+glycosyl+hydrolases+and+biofuels:+a+natural+marriage.">Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage.</a> Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).</li><li>Mortimer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+xylan+in+Arabidopsis+primary+cell+walls+is+synthesised+by+GUX3,+IRX9L,+IRX10L+and+IRX14.">An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14.</a> Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).</li><li>Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+relative+quantitation+using+isotope+tagging+and+normal-phase+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).</li><li>Busse-Wicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Xylan+Substitution+Patterns+in+Gymnosperms+and+Angiosperms:+Implications+for+Xylan+Interaction+with+Cellulose.">Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose.</a> Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).</li><li>Mortimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+branches+from+xylan+in+Arabidopsis+gux+mutants+reveals+potential+for+simplification+of+lignocellulosic+biomass.">Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).</li><li>Anders, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyl+transferases+in+family+61+mediate+arabinofuranosyl+transfer+onto+xylan+in+grasses.">Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).</li><li>Goubet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+glucomannan+in+Arabidopsis+is+synthesised+by+CSLA+glycosyltransferases,+and+influences+the+progression+of+embryogenesis.">Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis.</a> Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+That+GH115+alpha-Glucuronidase+Activity,+Which+Is+Required+to+Degrade+Plant+Biomass,+Is+Dependent+on+Conformational+Flexibility.">Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility.</a> J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+complexity+dictates+microbial+resource+allocation+in+the+large+intestine.">Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine.</a> Nat Commun. 6, 7481 (2015).</li><li>Handford, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localisation+and+characterisation+of+cell+wall+mannan+polysaccharides+in+Arabidopsis+thaliana.">Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana.</a> Planta. 218 (1), 27-36 (2003).</li><li>Boyes, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+stage-based+phenotypic+analysis+of+Arabidopsis:+a+model+for+high+throughput+functional+genomics+in+plants.">Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants.</a> Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Carbohydrate Active Enzyme Database. , (2017).</li><li>Hogg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+architecture+of+Cellvibrio+japonicus+mannanases+in+glycoside+hydrolase+families+5+and+26+points+to+differences+in+their+role+in+mannan+degradation.">The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation.</a> Biochem J. 371, 1027-1043 (2003).</li><li>Brennan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+microbial+xylanases+from+insect+guts.">Unusual microbial xylanases from insect guts.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+high+throughput+carbohydrate+profiling+technique+for+analyzing+plant+cell+wall+polysaccharides+and+carbohydrate+active+enzymes.">Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 6, (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

קצב היא שיטה פשוטה עבור אפיון מבנה רב-סוכר. ניתן להחיל אותה על כל רב-סוכר אשר ידועים GHs עם פעילות מאופיין, לראות דוגמאות רבות הספרות1,6,9,11. Tt הוחלה גם על האפיון של הרומן GHs12,13,18 ו glycosyltransferases9, על ידי עשיית שימוש של סובסטרטים מוגדר רב-סוכר, acceptors.
לשחזור, interpretable תוצאות תלויים שלושה שלבים מרכזיים. קודם כל, GHs בשימוש צריכים להיות חופשיים ובלחות פעילויות. . זה הטוב ביותר מושגת רק באמצעות ביטוי heterologously, זיקה מטוהרים אנזימים. שנית, עבור רוב הניסויים, זה חשוב כי הידרוליזה אנזימטי של סובסטרטים הוא בעת סיום. פעולה זו תבטיח כי ביומסה באותו הידרוליזה עם GH זהה נותן מאפיינים דומים בבכל ניסוי. לבסוף, צריך להיות עודף של fluorophore ב התגובה derivatization. פעולה זו מבטיחה כי הקצוות תוך צמצום זמין לוחיות ההסבר ל 100 אחוז. התוצאה תהיה הפארמצבטית גבוהה של תוצאות, כמו גם נתונים כמותיים.
ג'ל ואיכות ריאגנט הם קריטיים להבטחת לשחזור נתונים. מאגרי באיכות ירודה, במיוחד של שגוי pH, אוויר בועות הג'ל, דגימות עם עודף מלח יכול כל משפיעים על רזולוציה ושמירה פקטור של oligosaccharides. עם זאת, הכללת הפקדים המומלצת המתוארות בסעיף הפרוטוקול ואת התוצאות יאפשר פתרון בעיות.
הקצב הוא מוגבל על ידי היכולת שלו לזהות oligosaccharides. עבור ניסויים, טביעת אצבע פשוטה הוא כל שנדרש. עם זאת, כדי באמת quantitate את כמות glucomannan במדגם של אוויר, לדוגמה, הזהות של כל oligosaccharides פרסמה נדרש, אשר הוא תהליך ממושך. . זה יותר פשוט פחות סוכרים מורכבים כגון xylan3. מאז יש כמה תקנים פחמימה # מיון הפחמימות זמין מסחרית, לא תמיד ייתכן אפשרי או רצוי לזהות את כל הלהקות. במקרה זה, קצב יכול לספק נתונים מחמיא ספקטרומטר מסה (קרי, MALDI-CID9 או ESI-MS7ו- NMR6). על שיטות אלה, לעתים קרובות מועיל לעשות הכנה בקנה מידה גדול, נפרדים על-ידי גודל-הדרה כרומטוגרפיה ולאחר מכן לנתח כל שבר על ידי שני פייס לפני MS או NMR. בעוד בעבר דווח כי להקות יכול להיות טוחנות, המזוהה על-ידי MALDI-CID, בפועל גילינו שאין לזה קצב נמוך של הצלחה (ככל הנראה כתוצאה אינטראקציות של oligosaccharides שכותרתו עם הג'ל אקרילאמיד בעת חשיפה לאור UV).
המגבלה העיקרית אחרים של קצב הוא התפוקה. יש איכות טובה, ג'לים interpretable עם הפקדים המתאימים, ג'ל כל יהיה רק דוגמאות ניסיוני ~ 10, חוקר יכול לצפות לבדוק ~ 4 משטחים הקצב לכל יום. לאחרונה, גרסה של קצב באמצעות נימי אלקטרופורזה (CE) כבר מפותחת19, אשר מאפשר הכנת דוגמאות ב 96-ובכן צלחות. זה שימש בהצלחה כדי לאפיין את פעילות האנזים glycosyltransferase,6,מבנים רב-סוכר19, למרות שזה דורש גישה למחשב לסה נ, יכול להיות יקר כדי לרכוש ולתחזק.

ניתוח רב-סוכר על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE) הוא שיטה של אפיון מפורט של פוליסכרידים-1,-2,-3. צמח דופן התא פוליסכרידים קשה לשמצה לנתח, לרוב השיטות דורשים ציוד יקר, אופרטורים מיומן ואת כמויות גדולות של חומר מטוהרים. כאן, אנו מתארים פשוט שיטה להשגת מידע מבני רב-סוכר, כולל רזולוציה של isomers מבנית מפורט.
מבנה רב-סוכר של דופן התא צמח ההבנה הוא הכרחי עבור אלה החוקרים חקר הצמח ביוסינטזה דופן התא או את התפקיד של החומה תא צמח-התפתחות הצמח. לאחרונה, עם זאת, הרכב קיר תא צמח הפך מעניין לקבוצה רחבה יותר של החוקרים בשל ההתמקדות באמצעות צמח ביומסה (למעשה קיר התא) כמו זינה כדי לייצר דלק ביולוגי, ביוכימיקלים4. לדוגמה, יעיל saccharification אנזימטי החומר הזה דורש הבנה מפורטת של המבנים רב-סוכר, קוקטיילים אנזימטי ממוטבת שניתן יהיה הנבחר5.
קצב יש כמה יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות אשר עושים את זה אידיאלי לניתוח מהיר של מבנים מורכבים glycan. ראשית, היא אינה דורשת טיהור של רב-סוכר המדובר, כפי נדרש פתרון המדינה תהודה מגנטית גרעינית (NMR)6. שנית, קצב ניתן לפתור isomers מבנית, בניגוד ספקטרומטר מסה (MS, למשל, מטריקס בסיוע לייזר desorption/יינון (MALDI) וספקטרומטריית electrospray יינון (ESI)), אשר גם עשויה להיות מאתגרת כדי לבצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC) 7. שלישית, הקצב הוא מאוד רגיש, עם רזולוציה נמוכה-picomole, שלא כמו דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC) או נייר כרומטוגרפיה. בסופו של דבר, זה אינו דורש ידע ציוד או מומחה יקר, כמו במקרה של MS, NMR של LC.
שיטת הקצב מסתמך על ייחודה של אנזימי הידרולז (GH) glycosyl, אשר יעד מסוימים קישורים glycosidic בתערובת של סוכרים. כאשר האנזים GH פועל על השרשרת רב-סוכר, היא מגלה קצה תוך צמצום אשר יכול אז להיות מבחינה כימית derivatized, במקרה זה עם תווית פלורסנט. בחלק unhydrolyzed של המדגם ולכן מעובד לא לגילוי על ידי שיטה זו. Oligosaccharides עם תוויות ואז מפריד של ג'ל אקרילאמיד בפורמט גדול על ידי אלקטרופורזה. זה נותן פתרון מעולה של מולקולות דומות מאוד, לדוגמה, trisaccharides Glc-גבר-גבר, Glc-גבר-Glc יהיה שונה של Rf.
קצב שימש בהרחבה לאפיין מבנים שונים xylan על פני הצמח מינים8, לזהות מוטציות glycosyltransferase תודרנית6,9,10,11 לביצוע מבחני glycosyltransferase9, כדי לאפיין את הרומן GH פעילויות12,13. גם לאחרונה השתמשנו בו כדי לאפיין שמרים mannan דופן התא (Mahboubi, מורטימר, בהכנה). כאן נתאר שיטת אפיון מבנה הצמח דופן התא glucomannan, בהתבסס על דיווחים קודמים11,14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oligosaccaharide Standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 3458-28-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannobiose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 14417-51-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotriose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 28173-52-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotetraose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 51327-76-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannopentaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-35-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannhexaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GLCML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other specialty chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td>
			<td>(Molecular probes) Thermo</td>
			<td>A350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-picoline borane</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting kit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660 kit</td>
			<td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling recirculating water bath&#160;</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>RCB20-plus 115v</td>
			<td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td>
			<td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Pack</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EC1000XL</td>
			<td>1000V&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SPD131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycosyl hydrolases</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging software ( Genesys)</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

צמח דופן התא פוליסכרידים קשה לשמצה לנתח, לרוב השיטות דורשים ציוד יקר, אופרטורים מיומן ואת כמויות גדולות של חומר מטוהרים. כאן, אנו מתארים פשוט שיטה להשגת מידע מבני רב-סוכר, כולל רזולוציה של isomers מבנית מפורט. ניתוח רב-סוכר על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), חומר צמחי דופן התא hydrolyzed עם glycosyl hydrolases ספציפית רב-סוכר בעל עניין (למשל, mannanases עבור מנן). פורמט גדול לזיהוי ג'לים משמשות לאחר מכן להפריד את oligosaccharides המשוחררים, אשר סומנו כאנטי fluorescently. ג'לים, ניתן לאבחן עם ג'ל ששונה מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים). טביעת האצבע פחמימה # מיון הפחמימות וכתוצאה מכך ניתן גם להשוות איכותית או, עם שכפול, באופן כמותי. הצמדה ומידע מסעף ניתן להקים באמצעות hydrolases glycosyl נוספים (למשל, mannosidases ו- galactosidases). בעוד פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מבנה glucomannan, ניתן להחיל אותה על כל רב-סוכר אשר מאופיין glycosyl hydrolases קיים. לחלופין, זה ניתן לאפיין את הרומן glycosyl hydrolases שימוש רב-סוכר מוגדר סובסטרטים.

כאן, אנו מראים על ג'ל קצב דוגמה לרוץ לכל הפרוטוקול, יחד עם תיאורי כדי לסייע עם פרשנות הנתונים ופתרון בעיות, זה מלווה מדריך כללי מוצלחת בקצב ג'ל פרשנות13,16. ג'ל נציג של קצב רגיל וזמינותו של דופן התא מנן תוכן מוצגת באיור2, מתואר ליין מאת ליין.
סטנדרטים מסלולים 1, 2 ו- 3 הצג סולם של מסחרית שנרכש oligosaccharides (גבר1- גבר6) ב 5 (S1), 10 (S2) ו- 50 ריכוז pmol (S3). בעת קבלת הרבה פחמימה # מיון הפחמימות מסחרי חדש, חשוב לבדוק את הטוהר על ג'ל. Oligosaccharides רבים, במיוחד tetrasacccharides יותר, יכול לקבל זיהום משמעותי, עם oligosaccharides של דרגות אחרות של פלמור (DPs), כמוצג כאן גבר6 (המסומנים *). בזמן quantitating ג'ל, זה חשוב שתהיה לפחות 3 ריכוזי הסטנדרטים, מאז זה הכרחי לחישוב עקומת סטנדרטי. חישוב של העקומה רגיל יכול להיות גם עוזר להבטיח כי התגובה derivatization הוא בעיקרו של דבר בעת סיום. סטנדרטים של ריכוזים ידועים לאפשר השוואות בין ג'לים, פקד שימושי עבור איכות ההפרדה ואיכות derivatization.
בקרה חיובית ליין 4 מראה של עיכול mannanase konjac glucomannan. Konjac glucomannan זמין מסחרית, בזמן זה לא קיים באותו מבנה כמו זה, לדוגמה, נמצאו תודרנית, זה משמשת לשתי מטרות. ראשית, זה פקד חשוב לעיכול אנזימטיות. החוקר צריך לקבוע איך נראה מצע מסחרי מתעכל עם שלהם GHs להתמקד כאשר מתעכל עד לסיומו (קרי, עודף עצום של GH מתווסף התגובה). אם בעתיד ניסויים התבנית משתנה, זה יכול להצביע או לאובדן של פעילות או זיהום של המניה GH. שנית, הוא משמש פקד עבור התגובה derivatization בנוכחות האנזים ומאגר המלחים. אם הפקד חיובי הוא עני, ולאחר מכן זה עשוי לציין כי רכיב של התגובה הידרוליזה היא המעכבת כדי derivatization הסטנדרטים להיראות טוב.
תודרנית פראי סוג (WT) נובעות אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) ליין 5 מציג את קצב טביעות אצבע של גבעול תודרנית WT (השוואה עם הפניות11,14).
csla9 תודרנית גזע אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) 6 ליין מציגה מראה טביעת האצבע בקצב של הגזע של תודרנית הצמח חסר העיקריות נובעות מנן סינתאז11. להשוות בין WT, שליטה שלילי טביעות אצבעות. בעוד רוב מנן נעדר במפעל הזה, נשארת כמות קטנה, כפי שמעידים עוצמות הלהקה מופחת עבור כל הנגזרות mannanase oligosaccharides זה הוא מסונתז על ידי מנן נוספים synthases (CSLA2, 3)11.
בקרה שלילית - אנזים בלבד ליין 8 מראה להקות על הג'ל שאינם ספציפיים שואבים מזהמים ב mannanase קוקטייל, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
בקרה שלילית - WT אוויר בלבד ליין 9 מציג את להקות הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
בקרה שלילית- csla9 אוויר בלבד ליין 10 מראה להקות על הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
אורן עץ אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) ליין 7 מראה טביעות אצבע בקצב של עץ אורן, אשר מכיל את galactoglucomannan. בבירור יש דפוס שונים של oligosaccharides שפורסמו כדי תודרנית, בשל מבנהו שונה.
בקרה שלילית - אורן אוויר בלבד 11 ליין מראה להקות על הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
לפרש ג'ל הקצב פשוט למדי, אך דורשת מודעות לנקודות הבאות. עבור נתונים, מומלץ לבצע את הקצב לפחות 3 באופן עצמאי גדל ביולוגי משכפל, מומלץ לבצע משכפל טכנית לפחות 2 על כל שכפול ביולוגי. הפקדים המתוארים הם קריטיים לפרשנויות, להקות לא ספציפית צריכה להילקח. אנו גם ממליצים טעינת דגימות השונה על שכפל ג'לים, כדי לא לכלול תופעות אשר הם תוצאה של תאורה לא אחידה על ידי transilluminator. לפירוש מדויק דורש ניתוח של להקות אשר לא רוויים. מאז יש טביעות אצבעות פחמימה # מיון הפחמימות עשוי להכיל שני סוכרים שפע מאוד גבוהות ונמוכות, אנו ממליצים ניתוח חשיפות מרובות של הג'ל אותו. הסטנדרטים יכול לשמש כדי לנרמל בין תמונות שונות.
עבור סוגים מסוימים של ניסויים, זה עשוי להיות רצוי לכמת את כמות רב-סוכר בהכנת אוויר. בזמן זה אפשרי לכמת מן הקצב ג'ל, זה דורש ידע את זהותו מולקולרית המדויק של כל פחמימה # מיון הפחמימות שפרסם את GHs, היכן הוא ממוקם על הקצב ג'ל. זה כרגע לא לגמרי ידוע מנן, אך נקבע עבור אחרים סוכרים למשל xylan3. הסטנדרטים מספקים דרך של נורמליזציה בין ג'ל, גם כאשר לא מתבצע כימות, ולכן יסייע לכל ניתוח איכותי או כמותי למחצה.
זיהוי המבנה של הפרט oligosaccharides יכולה להיות מושגת באמצעות קוקטיילים של שקריאה GHs. תוספת של עוד GHs עלול לחשוף פרטים אודות קישורים ותחליפי של oligosaccharides המשוחררים (למשל, תוספת של β - 1, 4 - glucosidase שפועל על קצה שאינם בהפחתת תחשוף אילו oligosaccharides בתערובת מכילים תכונה זו). אנזימים זמינים כוללים galactosidases, glucuronidases, glucosidases (ראה את מסד הנתונים CAZy16 לפרטים נוספים); ראה הוג, ד. et al. 17 כדוגמה.
ניתן להשתמש בפרוטוקול לעיל כדי לאפיין את הפעילות של GHs לא ידוע. במקרה זה, ביומסה מוגדר, כגון תודרנית glucomannan גזע או konjac, אמור לשמש למסך GHs13לא ידוע.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
איור 1 : זה מראה את הערכה עבור derivatization הניאון של oligosaccharides עם נמלים. שונה מ- Goubet2.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>המטרה e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"="_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
איור 2 : ג'ל בקצב נציג מציג טביעת האצבע מנן תודרנית, אורן, מוטציה של תודרנית (csla9) אשר יש ליקויי ביוסינטזה מנן. AlR היה הידרוליזה עם קוקטייל mannanase, oligosaccharides שפורסמו היו derivatized עם fluorophore. Oligosaccharides היו מופרדים על ידי אלקטרופורזה בג'ל על בסיס גודל, צורה של תשלום. סולם של manno-oligosaccharides (Man1-6) מוצג כדי לסייע בזיהוי mobilities היחסית של oligosaccharides פרסמה, הידרוליזה של מנן מטוהרים (נגזר konjac) מוצג פקד חיובי. * = להקות לא ספציפית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE at JoVE.com

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Views.  Joint BioEnergy Institute. פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.

Video: Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in human pathology and other biochemical contexts. In order to perform characterization of protein deamidation, we have recently developed a novel long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method which can separate the glutamine (Gln) and asparagine (Asn) isoform products of deamidation from model compounds to highly complex biological samples. LERLIC-MS/MS is, therefore, the first shotgun proteomics strategy for the separation and quantification of Gln deamidation isoforms. We also demonstrate, as a novelty, that the sample processing protocol outlined here stabilizes the succinimide intermediate allowing its characterization by LERLIC-MS/MS. Application of LERLIC-MS/MS as shown in this video article can help to elucidate the currently unknown molecular arrays of protein deamidation. Additionally, LERLIC-MS/MS provides further understanding of the enzymatic reactions that encompass deamidation in distinct biological backgrounds.

Here we present a step-by-step protocol of the long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method. This is a novel methodology that enables for the first time quantification and characterization of the glutamine and asparagine deamidation isoforms by shotgun proteomics.

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content is rather low in all organisms, amounting in plants to about 0.009% of dry weight. To date, one of the most accurate methods for measuring iron concentration in plant tissues is flame absorption atomic spectroscopy. However, this approach is time-consuming and expensive and requires specific equipment not commonly found in plant laboratories. Therefore, a simpler, yet accurate method that can be routinely used is needed. The colorimetric Prussian Blue method is regularly used for qualitative iron staining in animal and plant histological sections. In this study, we adapted the Prussian Blue method for quantitative measurements of iron in tobacco leaves. We validated the accuracy of this method using both atomic spectroscopy and Prussian Blue staining to measure iron content in the same samples and found a linear regression (R2 = 0.988) between the two procedures. We conclude that the Prussian Blue method for quantitative iron measurement in plant tissues is precise, simple, and inexpensive. However, the linear regression presented here may not be appropriate for other plant species, due to potential interactions between the sample and the reagent. Establishment of a regression curve is thus needed for different plant species.

We present a simple and reliable protocol for measuring iron content in plant tissues using the colorimetric Prussian Blue method.

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and how the domains are oriented/positioned. Here, a protocol with the potential for elucidating which specific domains mediate interactions in multicomponent system through ab initio modeling is described. A method for calculating solution structures of macromolecules and their assemblies is provided that involves integrating data from small angle X-ray scattering (SAXS), chromatography, and atomic resolution structures together in a hybrid approach. A specific example is that of the complex of full-length nidogen-1, which assembles extracellular matrix proteins and forms an extended, curved nanostructure. One of its globular domains attaches to laminin &#947;-1, which structures the basement membrane. This provides a basis for determining accurate structures of flexible multidomain protein complexes and is enabled by synchrotron sources coupled with automation robotics and size exclusion chromatography systems. This combination allows rapid analysis in which multiple oligomeric states are separated just prior to SAXS data collection. The analysis yields information on the radius of gyration, particle dimension, molecular shape and interdomain pairing. The protocol for generating 3D models of complexes by fitting high-resolution structures of the component proteins is also given.

Here, we present how Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) can be utilized to obtain information on low-resolution envelopes representing the macromolecular structures. When used in conjunction with high-resolution structural techniques such as X-Ray Crystallography and Nuclear Magnetic Resonance, SAXS can provide detailed insights into multidomain proteins and macromolecular complexes in-solution.

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination of the high-specificity separation technique IEX with the accurate molar mass analysis achieved by MALS allows the characterization of heterogeneous protein samples, including mixtures of oligomeric forms or protein populations, even with very similar molar masses. Therefore, IEX-MALS provides an additional level of protein characterization and is complementary to the standard size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) technique.
Here we describe a protocol for a basic IEX-MALS experiment and demonstrate this method on bovine serum albumin (BSA). IEX separates BSA to its oligomeric forms allowing a molar mass analysis by MALS of each individual form. Optimization of an IEX-MALS experiment is also presented and demonstrated on BSA, achieving excellent separation between BSA monomers and larger oligomers. IEX-MALS is a valuable technique for protein quality assessment since it provides both fine separation and molar mass determination of multiple protein species that exist in a sample.

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

This protocol describes the use of high-specificity ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering for an accurate molar mass determination of proteins, protein complexes, and peptides in a heterogeneous sample. This method is valuable for quality assessment, as well as for the characterization of native oligomers, charge variants, and mixed-protein samples.

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These amyloid fibrils can sequester endogenous metastable proteins as well as components of the proteostasis network (PN) and thereby exacerbate protein misfolding in the cell. There are a limited number of tools available to assess the aggregation process of amyloid proteins within an animal. We present a protocol for fluorescence lifetime microscopy (FLIM) that allows monitoring as well as quantification of the amyloid fibrilization in specific cells, such as neurons, in a noninvasive manner and with the progression of aging and upon perturbation of the PN. FLIM is independent of the expression levels of the fluorophore and enables an analysis of the aggregation process without any further staining or bleaching. Fluorophores are quenched when they are in close vicinity of amyloid structures, which results in a decrease of the fluorescence lifetime. The quenching directly correlates with the aggregation of the amyloid protein. FLIM is a versatile technique that can be applied to compare the fibrilization process of different amyloid proteins, environmental stimuli, or genetic backgrounds in vivo in a non-invasive manner.

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescence lifetime imaging monitors, quantifies and distinguishes the aggregation tendencies of proteins in living, aging, and stressed C. elegans disease models.

אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...