המחברים מבקשים להודות לינג ג&#39;אנג לסיוע הטכני שלו. עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-86595). TAB הוא ניו חוקר ומלומד CIHR AHFMR. QH נתמך על ידי מלגת CIHR קנדה למוסמכים - דוקטורנטים וStudentship AIHS במשרה מלאה. SAN נתמך על ידי מלגת מלכת אליזבת השנייה בוגר. AYWS נתמך על ידי מלגות לתארים מתקדמים NSERC - דוקטורט.

ראה איור 1 עבור מערך כולל של פרוטוקול הניסוי. 1. בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך מקום סטרילי פלדת רשת לצלחת 60 x 15 מ&quot;מ פטרי. יחידה אחת נדרשה לדגימת רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) לכל מנה. שמור מנות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים עם CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר מאובטח למשטח חיתוך, צד הגחוני פונה כלפי מעלה. עכבר תרסיס עם אתנול 70% לעיקור ולהבטיח שפרוותו מדובללת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספרי כירורגיות, להתחיל על ידי ביצוע נתיחת חתך גחון בעור הבטן ממש מעל איבר המין. להרחיב את החתך כלפי מעלה לסנטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקו האמצע, להרחיב את החתך לאורך כל הגפיים. למשוך חזרה את העור הרפוי ולהצמיד אותו למשטח החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התימוס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הקצה התחתון של עצם החזה כדי לעשות חתך.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנעות הכבד, לחתוך את הסרעפת כדי לנתק את כלוב צלעות ולאחר מכן לחתוך את כלוב צלעות לכל צד. חותך את הצלעות כלפי מעלה בכל צד, מקפיד להימנע מהריאות והלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את בית החזה האחורי עם מלקחיים. התימוס הוא איבר לבן, bilobed ממוקם מעל הלב. אם אשתמש בשפה השטוחה של המלקחיים לתפוס את התחתית של האונות, משוך בעדינות את התימוס ולמקם אותו על מסך רשת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את הטחול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטחול הוא איבר אדום, גלשן בצורה הממוקם בצד השמאלי של חלל הבטן של העכבר, מתחת לכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חתך לתוך חלל הבטן. משוך בעדינות את הטחול עם זוג אחד של מלקחיים, תוך שימוש בזוג השני כדי להקניט את רקמת חיבור. הנח את הטחול על מסך רשת נפרדת. </li></ol></li></ol> 2. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בבוכנה ממזרק 3 מ&quot;ל, לטחוןאיברים לתוך מסך רשת עד רקמת חיבור ורק שרידי שומן. יש לשטוף את רשת עם HBSS מהצלחת שלוש פעמים. השתמש בוכנה חדשה לכל דגימת רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרויות אחרות למאחדים רקמה ניתן להשתמש במקומה של שיטה זו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב335 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> splenocytes resuspend ב 500 μl של חיץ תמוגה ACK (0.15 מ &#39;NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHC0 3, 0.1 המ&quot;מ Na 2 EDTA, 7.2 pH) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. thymocytes resuspend ב 20 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בFACS חיץ (PBS, 1% FCS, 0.02% יזידו נתרן) ומניח בצד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לsplenocytes isotonicity ידי הוספת 5 מ&quot;ל של HBSS. splenocytes הגלולה ידי צנטריפוגה וresuspend ב 20 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בחיץ FACS. אם תאים צריכים להישאר סטרילי, אתה יכול להשתמש בסטרילי RPMI + 10% FCS. </li></ol> 3.תאים מכתימים עבור cytometry זרימה מטרתו של פרוטוקול זה היא להתוות אסטרטגיות לניתוח של סלקציה חיובית ושלילית באמצעות wildtype (WT) ועכברי ח.י. CD4. לשיקולים כלליים בנוגע לזרימת cytometry עיצוב, רכישה, וניתוח ניסויי, אנו מתייחסים לקוראי סקירה מצוינת על ידי טונג ואח&#39; 11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 4 X 10 6 thymocytes לדגימת cytometry זרימה לכל אחד גם מצלחת 96-היטב, כמו גם 1 x 10 6 splenocytes WT לשליטת פיצוי. אם אתם משתמשים בעכברים הטרנסגניים, אתה צריך לכלול עכבר WT כבקרה בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה קולטנית FC ידי דוגרי תאים עם anti-CD16/32 (שיבוט 2.4G2) למשך 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בצלחת 335 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר את המכסה ולפזר נוזל מבארות ידי מצליף את הצלחת פעם אחת, עם פנים כלפי מטה לתוך כיור. Resuspend כל באר בשנת 200 μl של חיץ FACS. חזור על לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קוקטיילי נוגדנים כמפורטים להלן, באמצעות ריכוז האופטימלי של כל נוגדן המבוסס על דילול ב200 μl של חיץ FACS לטוב. הריכוז האופטימלי של כל נוגדן מוגדר כריכוז הנמוך ביותר הנדרש כדי לתת את ההפרדה הגדולה ביותר של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. אם אין אוכלוסייה שלילית לנוגדנים נתונים, נוגדן אלוטיפ צריך להיות כלול. הנפח הכולל לכל גם ניתן scaled למטה (לדוגמה עד 100 μl לטוב) אם רוצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WT התימוס: אנטי TCRβ CD4 אנטי,, ​​אנטי CD8, אנטי CD69 או אנטי CD5, אנטי CD24 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4 התימוס ח.י.: אנטי ח.י. TCR (T3.70), CD4 אנטי, אנטי CD8, אנטי CD69 או אנטי CD5, אנטי CD24 כדי להשיג הפרדה טובה יותר של CD69 lo וCD69 אוכלוסיות hi בthymocytes, מומלץ שנוגדן אנטי-CD69 עיקרי biotinylated לשמש, ואחריו כתם משני המכיל streptavidin fluorochrome מצומדות. אנו use אותה האסטרטגיה לCD5 מכתים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם 200 μl של קוקטייל נוגדנים בחיץ FACS למשך 30 דקות על קרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל לצביעת קוקטייל נוגדנים, כתם כל פקד פיצוי עם נוגדן חד fluorochrome מצומדות. באופן אידיאלי, כתמי פיצוי כרוכים באותם נוגדנים אלו המשמשים בקוקטייל הנוגדנים. עם זאת, מכתים עבור כל אנטיגן מסוים אינו ריאלי עבור ניסויים גדולים יותר כאשר אנטיגנים רבים שassayed. לכן, מכתים גם עבור CD4 אנטי או נגד CD8 מומלץ בשל ביטוי גבוה של אנטיגנים אלה, או השימוש בחרוזי פיצויים. כתם בחיץ FACS למשך 30 דקות על קרח בחושך. השאר שליטת פיצוי אחד בתוליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעמים עם חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend במאגר והעברה לצינורות FACS FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש דגימות על cytometer זרימה. כולל רכישת FSC-וFSC-W כדיllow לאפלית כפיל. </li></ol> 4. ניתוח של נתוני זרימת cytometry - עכברים ללא TCR המהונדסים אנו משתמשים FlowJo לניתוח נתוני cytometry זרימה. ראה איור 2 א לאסטרטגית gating לעכברים שאינם TCR מהונדסים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש FSC-ידי SSC, שער אלקטרוני על האוכלוסייה &quot;לימפוציטים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך האוכלוסייה &quot;ימפוציטים&quot;, השתמש FSC-ידי FSC-W לשער אלקטרוני אוכלוסיית lo FSC-W שלא לכלול כפילויות סלולריות וaggregrates. זה שער &quot;הגופייה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אירועים בשער &quot;הגופייה&quot;, שעלילת CD8 ידי CD4. צייר שערים לד.נ., DP משעמם, DP בהיר, מסוג CD4 + CD8 אוכלוסיות הנה CD4SP וCD8SP כמתואר באיור 2 ב &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת CD4SP וCD8SP השערים, ליצור TCRβ ידי CD24 חלקות. השתמש בכלי gating רבע לצייר שערים כמתואר באיור 2 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור neעלילת w מהשער &quot;הגופייה&quot;: TCRβ ידי CD69. צייר שערים, B, C, D כמתואר באיור 2 ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עוד מזימה מהשער &quot;הגופייה&quot;: TCRβ ידי CD5. צייר השערים I, II, III, IV כמתואר באיור 2E. זוהי אסטרטגיה אחרת לבחינת סלקציה חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל DN, DP משעמם, DP בוהק, int CD4, וCD4SP CD8SP שערים מתחת &quot;גופייה&quot; לשערי I, II, III, IV, A, B, C, D (איור 2 ד, ה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר התאים בתת קבוצה מסוימת על ידי הכפלה תאית איבר בתדירות של כל שער שלאחר מכן עד שתגיע לאוכלוסיית היעד שלך. לדוגמה, מספר hi thymocytes TCRβ CD69-CD8SP היה נקבע על ידי% התאי התימוס TCR BHI x CD69-(חלק ד &#39;) x CD8SP%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספירה כבר לוקחת בחשבון את תאי חיים ומתים ולכן אינם כוללים &quot;lymphoc&quot;שער yte בחישובים שלך. </li></ol></li></ol> 5. ניתוח של נתוני זרימת cytometry - TCR טרנס עכברים ראה איור 3 א לאסטרטגית gating לעכברים הטרנסגניים TCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים 4.1 ו -4.2 כמו בסעיף הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת לשער &quot;הגופייה&quot;, ליצור T3.70 ידי עלילת SSC ושער בT3.70 + אוכלוסיית תא לנתח תאי T אנטיגן ספציפיים (איור 3 ב &#39;). בנסיבות מסוימות, זה עשוי להיות עניין להשוואה לאוכלוסייה זו (T3.70-) האוכלוסייה הלא אנטיגן ספציפית לתאי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך האוכלוסייה T3.70 +, התיקו DN, DP, CD4SP וCD8SP שערים (האיור 3C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות בקרת WT, לצייר השערים האלה מתחת לשער &quot;הגופייה&quot; או ליצור T3.70 שער כפי שיהיו מעט מאוד T3.70 + תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת לשער CD8SP, ליצורT3.70 ידי CD24 עלילה. השתמש בכלי gating רבע לחלק תאים לארבע אוכלוסיות (איור 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת היסטוגרמה מעולפת מתארת ​​CD69 ביטוי בתא DP של עכברי WT ו+ תא T3.70 DP של עכברי ח.י. CD4 (איור 4 א). חזור על פעולה כדי לבחון CD5 ביטוי (איור 4 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספר המוחלט של תאים בכל קבוצת משנה של ריבית בכ4.8. </li></ol>

<ol>
	<li>Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aire+regulates+negative+selection+of+organ-specific+T+cells.">Aire regulates negative selection of organ-specific T cells.</a> Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).</li><li>Liston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+dosage--limiting+role+of+Aire+in+thymic+expression,+clonal+deletion,+and+organ-specific+autoimmunity.">Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).</li><li>Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+learning+self-control+in+the+thymus.">Central tolerance: learning self-control in the thymus.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).</li><li>Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+association+of+partial+T-cell+immunodeficiency+and+immune+dysregulation.">Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li><li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+what+have+we+learned+from+mice.">Central tolerance: what have we learned from mice.</a> Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).</li><li>Zhan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Without+peripheral+interference,+thymic+deletion+is+mediated+in+a+cohort+of+double-positive+cells+without+classical+activation.">Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).</li><li>Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+apoptosis+induced+by+T+cell+activation+is+mediated+by+glucocorticoids+in+vivo.">Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo.</a> J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).</li><li>Martin, S., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+and+nonspecific+deletion+of+immature+cortical+thymocytes+caused+by+antigen+injection.">Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection.</a> European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).</li><li>Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+TCR+alpha+expression+critically+influences+T+cell+development+and+selection.">The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection.</a> J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).</li><li>Tung, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+flow+cytometry:+a+practical+approach.">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).</li><li>Aliahmad, P., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+all+CD4+T+lineages+requires+nuclear+factor+TOX.">Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX.</a> J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).</li><li>Kastner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl11b+represses+a+mature+T-cell+gene+expression+program+in+immature+CD4(+)CD8(+)+thymocytes.">Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes.</a> Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).</li><li>Albu, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL11B+is+required+for+positive+selection+and+survival+of+double-positive+thymocytes.">BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes.</a> J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).</li><li>Van De Wiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocytes+between+the+beta-selection+and+positive+selection+checkpoints+are+nonresponsive+to+IL-7+as+assessed+by+STAT-5+phosphorylation.">Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation.</a> J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).</li><li>Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+signals+are+essential+for+cortex-medulla+migration+of+developing+thymocytes.">CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes.</a> J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).</li><li>Saini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds.">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science signaling. 3, ra23 (2010).</li><li>Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bim-mediated+apoptosis+is+not+necessary+for+thymic+negative+selection+to+ubiquitous+self-antigens.">Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens.</a> J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).</li><li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4+8++thymocytes.">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li><li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla.">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).</li><li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self.">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li><li>Anderson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein.">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li><li>Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo.">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).</li><li>Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7-mediated+migration+of+developing+thymocytes+to+the+medulla+is+essential+for+negative+selection+to+tissue-restricted+antigens.">CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).</li><li>Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+negative+selection+on+the+T+cell+repertoire+reactive+to+a+self-peptide:+a+large+fraction+of+T+cell+clones+escapes+clonal+deletion.">Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion.</a> Immunity. 13, 829-840 (2000).</li><li>Gallegos, A. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance+to+tissue-specific+antigens+mediated+by+direct+and+indirect+antigen+presentation.">Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation.</a> J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4(+)+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li><li>Bouillet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+Bcl-2+family+member+Bim+is+required+for+apoptosis+of+autoreactive+thymocytes.">BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes.</a> Nature. 415, 922-926 (2002).</li><li>Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proapoptotic+protein+Bim+is+differentially+required+during+thymic+clonal+deletion+to+ubiquitous+versus+tissue-restricted+antigens.">Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li><li>Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+orphan+steroid+receptor+Nur77+in+apoptosis+accompanying+antigen-induced+negative+selection.">A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection.</a> Immunity. 3, 273-282 (1995).</li><li>Zhou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Nur77/Nurr1+leads+to+inefficient+clonal+deletion+of+self-reactive+T+cells.">Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells.</a> J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).</li><li>Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+analysis+of+clonal+deletion+in+vivo.">Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo.</a> J. Immunol. 179, 837-844 (2007).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש לבדיקת סלקציה חיובית ושלילית בעכברים מהונדסים TCR הלא TCR מהונדס ו. פרוטוקול זה מתאר את ההכתמה של אנטיגנים על פני שטח. לניתוח נוסף של מנגנונים מולקולריים, לעתים קרובות יש צורך לבצע צביעה תאית. אנו משתמשים BD Biosciences קיט Cytofix / Cytoperm עבור רוב החלב...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> תמיסת המלח המאוזן של האנק HyClone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> מסכי רשת מתכת </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי (60 מ&quot;מ x 15) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> מזרקים (3 מ&quot;ל) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות חרוטים (15 מ&quot;ל) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Zeiss - פרימו סטאר </td><td> 415500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> אוסרמדעי </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת 96-היטב </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה הרבה ערוצים </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום </td><td> Paa </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> יזיד הנתרן </td><td> IT ייקר הכימי ושות </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FCR מגיב חסימה </td><td></td><td></td><td> השיבוט 2.4G2 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר ח.י. TCR </td><td> eBioscience </td><td> * XX-9930-YY </td><td> השיבוט T3.70 </td></tr><tr><td> CD4 נגד עכבר </td><td> eBioscience </td><td> * XX-0042-YY </td><td> שיבוט RM4-5 </td></tr><tr><td>NTI עכבר CD8α </td><td> eBioscience </td><td> * XX-0081-YY </td><td> שיבוט 53-6.7 </td></tr><tr><td> Anti-CD24 עכבר </td><td> eBioscience </td><td> * XX-0242-YY </td><td> שיבוט M1/69 </td></tr><tr><td> TCRβ נגד עכבר </td><td> eBioscience </td><td> * XX-5961-YY </td><td> שיבוט H57-597 </td></tr><tr><td> Anti-CD69 עכבר Biotinylated </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-י.י. * </td><td> השיבוט H1.2F3 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD5 Biotinylated </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-י.י. * </td><td> שיבוט 53-7.3 </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> eBioscience </td><td> * XX-4217-YY </td><td></td></tr><tr><td> cytometer זרימה </td><td> Biosciences BD - קנטו FACS </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת ניתוח cytometry זרימה </td><td> TreeStar - Flowjo </td><td> FlowJo v7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 בינוני </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * XX משתנה לפי fluorochrome וי.י. משתנים לפי גודל בקבוקון. </td></tr></tbody></table>

examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry

מערכת חיסונית בריאה דורשת שתאי T מגיבים לאנטיגנים זרים, בעוד שנשארו סובלני לאנטיגנים עצמיים. סידור אקראי של הקולטן התא T (TCR) α ולוקוסי β יוצר רפרטואר תאי T עם מגוון עצום בהספציפיות אנטיגן, הן עצמי וזרות. בחירת הרפרטואר במהלך פיתוח בבלוטת התימוס היא קריטית ליצירת תאי T בטוחים ושימושיים. פגמים בבחירה הרתי לתרום להתפתחות של הפרעות אוטואימוניות וכשל חיסוניים 1-4. אבות תאי T מכניסים את התימוס כthymocytes (DN) השלילי כפול שלא מבטא CD4 או CD8 עמיתים לקולטנים. ביטוי של αβTCR ושני עמיתים לקולטנים מתרחש בשלב החיובי הכפול (DP). אינטראקציה של αβTCR עם (pMHC) הציג עצמי פפטיד-MHC על ידי תאים הרתי קובעת את גורלו של thymocyte DP. אינטראקציות זיקה גבוהות להוביל לבחירה וelimina שליליתtion של thymocytes העצמי תגובתי. תוצאה נמוכה זיקת גומלין בבחירה והתפתחות חיוביות של CD4 או CD8 (SP) תאי T חיוביים יחידים המסוגלים לזהות אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי 5-MHC עצמי. סלקציה חיובית ניתן ללמוד בעכברים עם רפרטואר polyclonal (wildtype) TCR ידי התבוננות הדור של תאי T בשלים. עם זאת, הם לא אידיאליים למחקר של סלקציה שלילית, הכולל מחיקה של אוכלוסיות קטנות אנטיגן ספציפיים. מערכות מודל רבות שמשו ללמוד סלקציה שלילית אך נבדל ביכולתם לסכם אירועים פיסיולוגיים 6. לדוגמה, בגירוי במבחנה של thymocytes חסר את הסביבה הרתי כי הוא מעורב באופן אינטימי בבחירה, ואילו ממשל של אנטיגן אקסוגני יכול להוביל למחיקה הלא ספציפית של thymocytes 7-9. נכון לעכשיו, את הכלים הטובים ביותר ללימוד בסלקציה שלילית vivo הם עכברים שמבטאים transgספציפי enic TCR לאנטיגן עצמי אנדוגני. עם זאת, רבי מודלים קלסיים TCR המהונדסים מאופיינים בביטוי המוקדם של שרשרת TCRα המהונדסת בשלב DN, וכתוצאה ממוקדמת סלקציה שלילית. המעבדה שלנו פתחה מודל CD4 ח.י., בי המהונדס ח.י. TCRα מתבטא בתנאים בשלב DP, המאפשר סלקציה שלילית להתרחש במהלך עקורים למעבר SP כפי שמתרחש בעכברי wildtype 10. כאן, אנו מתארים פרוטוקול זרימה cytometry מבוסס לבחון סלקציה חיובית ושלילית הרתי במודל עכבר CD4 ח.י.. בעוד סלקציה שלילית בעכברי ח.י. CD4 היא פיזיולוגית מאוד, שיטות אלה יכולים להיות מיושמים גם על מודלים מהונדסים TCR אחרים. אנחנו גם נציג אסטרטגיות כלליות לניתוח סלקציה חיובית ברפרטואר מתאים לכל עכברי מניפולציות גנטיות polyclonal.

במודלים פיסיולוגיים TCR מהונדסים ועכברי WT, סלקציה חיובית מתחילה בשלב הבהיר DP לפני המעבר לשלב המשעמם עקורים לאחר מפגש אנטיגן. thymocytes המשעמם העקור לאחר מכן זן מסוג CD4 + שלב מעבר lo CD8 לפני שהפך thymocytes CD8SP (האיור 2B) CD4SP או. thymocytes SP הבוגר מאו...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry at JoVE.com

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא T<em&gt; In vivo</em&gt; באמצעות מניפולציות גנטיות בעכברי wildtype או רקע רצפטור תא T מהונדס.

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

examination-thymic-positive-negative-selection-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.6K Views.  University of Alberta. אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא T In vivo באמצעות מניפולציות גנטיות בעכברי wildtype או רקע רצפטור תא T מהונדס.

Video: Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...