פרוטוקול זה פותר אתגרים נפוצים שחווה עם עיבוד כיח שהקשתו בעבר על השימוש בציטומטריית זרימה למטרות אבחון קליני בעלות תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה נועד לחסוך זמן באמצעות משקל כיח כדי לקבוע נפחי כתמי נוגדנים וצבע. במהלך הדגירה הכתימה, ניתן לבצע ספירת תאים עבור השלבים במורד הזרם.
חשוב להשיג ספירת תאים מדויקת כדי לקבוע את נפח ההשעיה מחדש הנכון כדי למנוע בעיות בעת ריצה על cytometer הזרימה. פרוטוקול זה יכול לספק תובנה על תחומי מחקר החוקרים את בריאות הריאות. לדוגמה, ניתן ללמוד מחלות כגון COPD, אסתמה, סרטן ריאות או ההשפעות של COVID.
מדגים את ההליך יהיה ד"ר מייקל לאי, מדען מחקר ופיתוח מהמעבדה שלי. ראשית, לשקול את מדגם כיח כדי לקבוע את הנפחים של ריאגנטים דיסוציאציה. להעביר את המדגם לכלי בגודל המתאים בהתבסס על משקל כיח, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד לגרם של 0.5% NAC ו 4 מיליליטר לגרם של 0.1%DTT.
מערבולת הדגימות במהירות המרבית במשך 15 שניות וסלע במהירות המרבית במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לדלל מדגם זה עם תמיסת מלח מאוזנת 4X הנקס או HBSS כדי לנטרל את NAC ו- DTT. ואחרי מערבולת מהירה, לטלטל את המדגם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
מסנן מתלה תא באמצעות מסננת תא רשת ניילון 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי אחד או יותר 50 מיליליטר כדי ליצור השעיה של תא אחד. תפיל את התאים. לאחר שאיפה supernatant, לשלב כדורי אחד 15 מיליליטר צינור חרוט לשטוף עם HBSS באותם תנאים.
resuspend גלולה התא בנפח של חוצץ נקבע על ידי המשקל הראשוני של דגימת כיח. קח aliquot מן השעיית התא ולערבב 10 microliters של דילול כיח עם 30 microliters של 0.4% כחול טריפן, ולאחר מכן לטעון לתוך תאי הספירה של המוציטומטר לספירת תאים חיים / מתים. כיח תווית בצינורות פיצוי.
הוסף נוגדן HBSS וצבע לכל צינור תא כיח וצינורות פיצוי כפי שצוין בטקסט. הוסף את תאי הכיח לצינורות ה- assay והוסף חרוזי פיצוי לצינורות הפיצוי כפי שהוזכר בטקסט. לדגור את כל הצינורות על קרח מוגן מפני אור במשך 35 דקות.
לאחר מילוי הצינורות עם HBSS קר כקרח, צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 800 פעמים G.for צינורות פיצוי, לשאוף את supernatant קרוב לכדורים ככל האפשר ולהעיף את הכדורים להשתחרר. לאחר מכן, להוסיף 0.5 מיליליטר של HBSS קר צינורות פיצוי ולאחסן את הצינורות על הקרח באזור מוגן אור עד הצורך לניתוח ציטומטריית זרימה. ואז שאפו את הסופר-נט מהליחה, איזוטיפ, דם וצינורות אפיתל לא מוכתמים.
לשחרר את הכדורים על ידי הבהוב הצינורות. הוסף שני מיליליטר של 1%PFA לצינורות האיזוטיפים הלא מזוהמים ו -10 מיליליטר לצינורות הדם והאפיתל. לדגור על הצינורות על קרח בצורה מוגנת אור במשך 30 דקות, ולאחר מכן במהירות מערבולת במהירות המרבית ושוב לדגור במשך 30 דקות נוספות.
ואז למלא את הצינורות עם HBSS קר כקרח. לאחר מכן, צנטריפוגות הצינורות בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 1, 600 פעמים G.Aspirate ככל האפשר מבלי להפריע לכדור התא ולהעיף את הצינור עם האצבעות כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של HBSS קר צינורות לא נגוע ואיזוטיפ. לחשב ולהוסיף את הנפח הנדרש של HBSS עבור resuspension של הדם ואת צינור האפיתל על פי ספירת התאים הכוללת.
לאחסן את כל הדגימות בצינורות פיצוי מוגן מפני אור על הקרח בארבע מעלות צלזיוס עד ניתוח ציטומטריה זרימה מבוצע. החל הליכי אתחול מתאימים עבור cytometer הזרימה בשימוש. השתמש בתערובת של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה או חרוזי NIST כדי להבטיח כי מתחי פיזור קדימה ופיזור צד מוגדרים למקם את חרוזי NIST כדי להתפרש על העלילה מבלי למקם את החרוזים קרוב מדי לצירים.
הגדר את קצב הזרימה כבינוני עבור LSRII או גבוה עבור Navios EX. התאם את המתחים עבור כל פרמטר המשמש עבור הפרמטרים פיזור פלואורסצנטי למקם את אוכלוסיות התא בקנה מידה. השתמש בנתונים עם אסטרטגיית הגטינג כהדרכה להתאמת המתחים בהתאם. לרכוש נתונים עבור דגימת כיח לא נגוע תחילה, ואחריו מדגם מוכתם איזוטיפ, ולאחר מכן צינור הדם ואת צינור האפיתל.
משקל כיח שימש לקביעת נפחי נוגדנים או צבע להכתמה. המתאם בין משקל הליחה לתפוקת התא לא היה חזק. דגימות כיח חולקו לארבע קטגוריות משקל, אשר מקובצים בהתפלגות של תפוקת התא.
כל נוגדן בשימוש היה titrated בריכוז בשלב הרמה עם מדד הכתמים הגבוה ביותר נבחר כמו ריכוז העבודה. בכל קטגוריות המשקל, הזיהום הממוצע של ה- SEC היה פחות מ -20% עם אחוז התאים קיימא המוצג. מוצגת אסטרטגיית הגטינג המשמשת לניתוח.
חרוזי NIST שימשו כדי להגדיר שער אשר הוחל על מדגם כיח כדי לחסל פסולת. פסולת קטנה חוסלה עוד יותר על ידי שער הרוחב. צבע הכדאיות שימש לחיסול תאים מתים, בעוד שער יחיד הוסר כפולות.
תיוג נוגדני האנטי-CD45 אפשר הפרדה של תאי כיח בודדים חיים לתא דם ותא שאינו תא דם. הפרופילים שהתקבלו מ- Navios EX, LSRII ו- Lyric הושוו. אסטרטגיית הגינג לחיסול הפסולת, התאים המתים, הכפילים והשוואת פרופילי הדם והלא דם מוצגת.
טכניקה זו אפשרה לנו ליישם שיטות אלה כדי לזהות סיכון לסרטן ריאות לשימוש כבדיקה קלינית לא פולשנית.
